构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的：探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法：实验于2005-05／1在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm，缝接入20mm硅胶管中，形成神经再生室。7d后重新打开伤口，刨开硅胶管，截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只，无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果：①两组培养的细胞光镜观察结果：实验组的许旺细胞密度高于对照组，特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个／mm^2，而对照组密度不足200个／mm^2。②两组许旺细胞免疫组织化学染色：实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为（98．0&;#177;1.2）％，而对照组许旺细胞的纯度为（93．0&;#177;2．1）％（P〈0．05）。③两组细胞的生长曲线：培养7d，实验组细胞数量较对照组明显增加，达到（49．6&;#177;3．5）&;#215;10^7L^-1，远高于对照组的（31．7&;#177;3．9）&;#215;10^7L^-1。结论：从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞，为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

微囊化成年兔许旺细胞的体外培养

背景:研究发现将体外培养扩增的大量许旺细胞种植到神经导管上来引导周围神经再生效果明显,而目前备受关注的微囊化免疫隔离技术,在克服免疫排斥问题上具有明显的优势与实用性.目的:微囊包裹兔许旺细胞并进行体外培养,观察许旺细胞形态及增殖变化.设计、时间及地点:体外细胞水平观察实验,于2005-09/2006-05在南昌大学第二附属医院分子实验室完成.材料:健康成年家兔由南昌大学医学院动物中心提供,微囊发生器由南昌大学医学院神经生物学研究室研制.方法:使双侧坐骨神经发生Wallerian变性,经改良后反复差速贴附法进行培养,快速分离纯化许旺细胞.海藻酸钠-氯化钡一步成囊法包裹生长良好的第3代许旺细胞.主要观察指标:倒置显微镜下观察培养过程中微囊化许旺细胞形态变化,MTT检测不同时期微囊化许旺细胞及游离许旺细胞的增殖改变.结果:在培养过程中可见微囊及其囊内许旺细胞形态均保持完整,微囊未见破损.微囊化后的许旺细胞总体呈现悬浮生长的趋势.培养0,1,3,5,7 d时MTT检测微囊许旺细胞组与游离许旺细胞组吸光度值差异有显著性意义(P＜0.05).结论:微囊包裹的许旺细胞体外可存活较长时间,微囊化许旺细胞相比游离许旺细胞增殖速度有所减慢.     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的：观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞，对大鼠脊髓损伤的修复作用。 方法：实验于2004-07／12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只，空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞，28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。 结果：68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果：脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损，驻杆时间减少超过30％，单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力，分别为对照的36％和65％，神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想，可达到正常对照的93％以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果：许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量：（22．7&;#177;1．9），（31.3&;#177;5．3），（12．9&;#177;3．0）个／视野；平均吸光度：0．035&;#177;0．02l，0．075&;#177;0．033，0．023&;#177;0．011，P均〈0．01]。 结论：外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞，能够更加优化神经修复微环境，有利于神经损伤后修复。     

许旺细胞修复大鼠脊髓损伤:静脉移植的可行性及优势

背景:目前细胞移植是修复脊髓损伤的研究热点之一,许旺细胞能够分泌多种神经营养因子,改善损伤局部微环境,大量相关文献证实了其能够促进脊髓损伤后功能的恢复.针对治疗脊髓损伤的细胞移植方法很多,其中静脉移植具有操作方便、能够避免传统移植方法造成的附加损伤等优点.目的:探讨许旺细胞尾静脉移植修复大鼠脊髓损伤的疗效.方法:体外分离Wistar大鼠双侧坐骨神经,植块法培养,S-100染色鉴定,Hoechst33342标记许旺细胞.Impactor model-Ⅱ打击仪制作 Wistar大鼠T10脊髓损伤模犁60只,随机分为3组,空白对照组术后未作处理,DMEM对照组、许旺细胞移植组术后1周分别尾静脉注射1 mL.DMEM或1 mL.许旺细胞.术前1 d,术后1,3 d,1周及以后每周进行BBB评分.移植后1,2,4周取材行冰冻切片观察移植许旺细胞的迁移.移植后8周取材行苏木精-伊红染色及免疫荧光染色观察损伤段胶质原纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶的表达.结果与结论:经纯化鉴定获得纯度为95%的许旺细胞.移植后1,2,4周损伤段及邻近节段脊髓内可观察到Hoechst33342阳性细胞.术后4周,许旺细胞移植组与空白对照组、DMEM对照组BBB评分差异开始有显著性意义(P<0.05),且许旺细胞移植组高于空白对照组、DMEM对照组.苏木精-伊红染色示各组均有脊髓空洞形成,许旺细胞移植组空洞小于空白对照组、DMEM对照组.免疫组织化学染色示空白对照组、DMEM对照组胶质原纤维酸性蛋白反应较强,许旺细胞移植组胶质原纤维酸性蛋白阳性面积小于其他组(P<0.05);许旺细胞移植组神经元特异性烯醇化酶的阳性面积明显大于其他组(P<0.05).提示静脉移植许旺细胞修复大鼠脊髓损伤是可行的,操作简便,且有较好的疗效.     

许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植修复大鼠脊髓损伤

目的:观察许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡、Bcl-2表达及下肢运动功能恢复的影响.方法:清洁级SD大鼠随机分为4组:正常对照组、单纯损伤组、许旺细胞组、许旺细胞海藻酸钠凝胶组.后3组制作脊髓全横断损伤模型.正常对照组、单纯损伤组不进行移植处理,许旺细胞组植入吸附许旺细胞悬液的明胶海绵块、许旺细胞-海藻酸钠凝胶组植入许旺细胞-海藻酸钠凝胶.分别于12 h,1,3,7,21 d对动物进行BBB评分后处死,取损伤区脊髓节段制成石蜡切片进行TUNEL、Bcl-2染色,观察脊髓内凋亡细胞、Bcl-2细胞的数量及分布变化.结果:正常对照组仅有少量淡染Bcl-2阳性细胞;单纯损伤组神经元Bcl-2免疫反应阳性细胞表达的高峰在第3天,14 d时Bcl-2免疫反应阳性细胞表达接近正常水平.许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植后损伤脊髓细胞Bcl-2免疫反应阳性细胞表达具有显著增高(P＜0.05),7 d高度表达并持续2周以上.单纯损伤组脊髓内细胞凋亡最多,并于损伤后1,7 d形成两个高峰,多分布于白质中.许旺细胞-海藻酸钠凝胶组BBB评分较单纯损伤组及许旺细胞组明显提高(P＜0.05).结论:许旺细胞-海藻酸钠凝胶移植能抑制大鼠脊髓损伤后脊髓细胞凋亡、促进Bcl-2的表达,提高了脊髓运动功能的恢复,但未达到正常水平.     

壳聚糖支架与大鼠许旺细胞的体外组织相容性

背景:与聚乳酸、胶原等材料相比,壳聚糖作为一种新的生物材料研究时间较短,在神经修复方面的工作开展的较少.目的:介绍一种简单的壳聚糖支架制备方法并分析其与许旺细胞的生物组织相容性.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2008-11/2009-07在包头医学院生物医学中心实验室完成.材料:Wistar乳鼠10只用于分离培养许旺细胞.医用级壳聚糖粉(脱乙酰度为99%)由浙江澳兴生物科技有限公司提供.方法:以6%壳聚糖乙酸水溶胶制备壳聚糖支架,取乳鼠坐骨神经采用酶消化后组织块贴壁培养的方法培养许旺细胞.实验分为正常对照组和实验组,实验组将壳聚糖支架平铺于孔底,超净工作台内干燥,然后将许旺细胞接种到培养板内培养,24 h后培养液中加入4,6-二氨基2苯基吲哚孵育过夜,去除未与细胞结合的4,6-二氨基-2-苯基吲哚继续培养1周.正常对照组不加任何干预,同样在37℃和体积分数为5%CO2的条件下培养1周.主要观察指标:培养第1,3,5,7天分别选择细胞总数不低于100和200个的视野进行照像,应用图像分析软件(Image pro plus 6.0)分析,计算凋亡细胞的百分率.结果:壳聚糖支架表面光滑,透明状,质地均匀,厚度0.15 mm.正常对照组和实验组在第1,3,5,7天凋亡细胞的百分率比较,差异无显著性意义(P>0.05).结论:该壳聚糖支架所需材料少,制作方法简单,与许旺细胞具有良好的组织相容性.     

构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的:探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法:实验于2005-05/11在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm,缝接入20mm硅胶管中,形成神经再生室。7d后重新打开伤口,刨开硅胶管,截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只,无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果:①两组培养的细胞光镜观察结果:实验组的许旺细胞密度高于对照组,特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个/mm,而对照组密度不足200个/mm。②两22组许旺细胞免疫组织化学染色:实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为(98.0±1.2%,对照组许旺细胞的纯度为(93.0±2.1)%(P<0.05)③)而。两组细胞的生长曲线:培养7d,实验组细胞数量较对照组明显增加,达到(49.6±3.5)×10L-1,远高于对照组的(31.7±3.9)×10L。77-1结论:从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞,为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

成年大鼠心肌细胞分离方法的改良

背景:目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究.目的:建立稳定的改良成年SD大鼠心肌细胞分离方法,使之适于进行原代培养和研究.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/09在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成.材料:8～10周龄雄性SD大鼠30只,由同济医学院实验动物中心提供,Ⅱ型胶原酶、蛋白酶和不含脂肪酸的牛血清白蛋白分别为美国Worthington公司、美国Sigma公司和德国Merck公司产品.方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,采用改良的Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注,无钙Krebs-Henseleit缓冲液(KH液)非循环灌流4 min,0.6 g/L Worthington 2型胶原酶联合0.03 g/L蛋白酶消化约15 min,剪下心室组织于消化液和10 g/L牛血清白蛋白的混合液中,剪碎后于37℃振摇孵育10min,200 μm尼龙网过滤,500 g离心1 min,梯度复钙,自然沉降.主要观察指标:心肌细胞的形态、活力和产量.结果:复钙后的杆状存活心肌细胞得率为(73±5.6)%(n=30),其中90%以上的杆状心肌无明显搏动,横纹清晰.每只大鼠心脏的平均存活心肌细胞产量为(4.2±0.4)×106.结论:经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞,可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞,分子生物学研究.     

许旺细胞移植促进大鼠脑胆碱能神经纤维损伤后的修复

目的:利用显微移植技术,观察体外培养纯化的鼠坐骨神经许旺细胞悬液植入损伤的脑隔-海马纤维束后对胆碱能神经纤维的修复情况。方法:2004-06/2005-01在中国医科大学完成。①选取清洁级SD大鼠72只,随机数字表法分为许旺细胞即时移植组、许旺细胞延迟移植组、模型对照组,24只/组。另选用SD乳鼠1只用于坐骨神经许旺细胞悬液的制备。②3组大鼠均建立隔-海马纤维束损伤模型。造模后,许旺细胞即时移植组于中线旁1.8mm、脑皮层下4.5mm、前囟后1.8mm和2.0mm两处立即注射许旺细胞悬液,每处注射量为10μL,持续5min,许旺细胞延迟移植组造模后缝合头皮,回笼继续饲养,6d后再行许旺细胞悬液移植治疗,步骤同上。模型对照组造模后仅即时注入RPMI1640培养液。各组大鼠回笼饲养,分别于细胞植入后的1,2,4,6周处死,6只/时相点。③于上述各时相点麻醉大鼠,断头取脑,预行免疫组织化学染色的标本置于体积分数为0.1甲醛中固定,免疫组织化学染色检测低亲和力神经生长因子受体的表达;预行乙酰胆碱脂酶纤维染色的脑组织先在40g/L多聚甲醛灌注液中固定6h,然后置于体积分数为0.15的磷酸蔗糖液中4℃过夜,观察脑海马损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况。移植后第4周,对各组距损伤区分别为0.5mm,1.5mm,2.5mm层面海马内的乙酰胆碱酯酶阳性纤维数量进行定量分析。结果:72只大鼠均进入结果分析。①许旺细胞移植后低亲和力神经生长因子受体的表达:模型对照组无表达低亲和力神经生长因子受体的许旺细胞出现;许旺细胞即时移值组2周后出现低亲和力神经生长因子受体的明显表达,4周达高峰,6周时程度略有下降;许旺细胞延迟移值组表现与即时移值组相似。②脑海马损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况及相关定量分析:乙酰胆碱酯酶能再生神经纤维分布于损伤区内皮层下隔区、移植的许旺细胞团内及其周围,增生的纤维呈束样向海马内延伸。移植后第4周,许旺细胞即时移植组和延迟移植组海马CA1区、CA3区和齿状回内各层面的乙酰胆碱酯酶纤维密度均明显高于模型对照组(t=3.70,P<0.05);且许旺细胞延迟移植组3个区域各层面乙酰胆碱酯酶纤维密度均明显高于即时移植组(t=3.44,P<0.05)。结论:脑损伤后植入的许旺细胞可在受体内存活,表达可结合神经生长因子的低亲和力神经生长因子受体,促进胆碱能神经纤维再生。此外,于脑损伤后稍晚期植入的许旺细胞可能更有利于胆碱能神经纤维的再生。     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的:观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞,对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:实验于2004-07/12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只。空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞,28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。结果:68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果:脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损,驻杆时间减少超过30%,单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力,分别为对照的36%和65%,神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想,可达到正常对照的93%以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果:许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量:(22.7±1.9),(31.3±5.3),(12.9±3.0)个/视野;平均吸光度:0.035±0.021,0.075±0.033,0.023±0.011,P均<0.01]。结论:外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞,能够更加优化神经修复微环境,有利于神经损伤后修复。     

许旺细胞体外培养纯化的观察

目的：许旺细胞能分泌生长因子，在周围神经再生中起重要作用，获得高纯度许旺细胞是对其研究的重要前提，为此探讨获得高纯度的SD乳鼠的许旺细胞的有效方法。方法：组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法。结果：经组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用，所得许旺细胞的纯度很高，可达98％以上，而且细胞所受到的外界因素影响也较少。结论：通过体外培养方法得到高纯度且受到的外界因素影响小的许旺细胞，可采用组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用的方法。     

SD大鼠许旺细胞提取及纯化:乳鼠和成年鼠的对照(英文)

背景:许旺细胞是神经创伤修复的种子细胞,获取大量高纯度、高活性许旺细胞是研究的关键.目的:比较乳鼠和成年鼠许旺细胞的体外培养、纯化和形态学的差别,探讨简单可行的、可以获得高纯度许旺细胞的培养方法.方法:出生1～3 d SD大鼠20只和成年大鼠10只(体质量150～200 g),实验按细胞的来源分为新生组和成年组.双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞;倒置显微镜观察细胞形态、贴壁速度;细胞计数,纯度计算;MTT法检测细胞增殖能力,绘制两组许旺细胞的增殖曲线,判定增殖速度;S-100免疫化学法鉴定细胞.结果与结论:乳鼠的许旺细胞贴壁速度快于成纤维细胞,成鼠的许旺细胞贴壁速度慢于成纤维细胞,两组许旺细胞纯度均达96%以上;MTT法检测两组许旺细胞增殖均活跃,由增殖曲线显示乳鼠许旺细胞增殖更快(P < 0.05);S-100免疫化学反应均呈阳性.提示双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞,可以获取纯度高、活性良好的许旺细胞;乳鼠许旺细胞的增殖、贴壁能力更强.     

许旺细胞移植促进大鼠脑胆碱能纤维损伤后的修复

目的:脑损伤大鼠于脑隔-海马通路植入许旺细胞,观察许旺细胞的存活状况和损伤区乙酰胆碱酯酶能纤维的再生,分析许旺细胞与中枢神经系统轴突再生的相关性。方法:实验于2002-05/2003-05在北京解放军总医院完成。①选取成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只,随机数字表法分为许旺细胞移植组、模型对照组,32只/组。另取SD乳鼠30只作为许旺细胞的标本来源。②两组大鼠均建立脑隔-海马胆碱能纤维损伤模型。造模后许旺细胞移植组立即注射体外培养2～3代的许旺细胞悬液,注射部位为中线旁1.8mm,前囟后1.8mm和中线旁1.8mm,前囟后2.0mm两点,5μL/点。模型对照组仅注入RPMI1640培养液。③两组分别于许旺细胞植入后1,2,4,6周各处死8只大鼠,取脑组织制备石蜡切片。免疫荧光组织化学染色检测移植后许旺细胞低亲和力神经生长因子受体的表达情况;乙酰胆碱酯酶纤维染色检测损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况;移植后第4周,采用网格测试系统对距损伤区分别为0.5mm,1.5mm,2.5mm层面(即海马的前、中、后部区域)乙酰胆碱酯酶纤维密度进行定量分析。结果:实验选取64只大鼠均进入结果分析。①移植后许旺细胞表达低亲和力神经生长因子受体的情况:许旺细胞移植组在移植后2周表达低亲和力神经生长因子受体,第4周达到高峰,6周时略有下降;而模型对照组未出现表达低亲和力神经生长因子受体的许旺细胞。②移植后脑损伤区乙酰胆碱酯酶能神经纤维再生情况:许旺细胞移植组于移植后第2周在损伤后的皮层下隔区内即可见再生的乙酰胆碱酯酶能神经纤维,主要分布在损伤后的皮层下隔区,呈束样向海马内延伸。模型对照组无明显乙酰胆碱酯酶纤维再生。③移植后第4周脑损伤区海马内不同层面乙酰胆碱酯酶纤维密度定量分析结果:许旺细胞移植组大鼠脑海马CA3区在0.5mm,1.5mm,2.5mm各层面的乙酰胆碱酯酶纤维密度均明显高于模型对照组(t=8.012,P<0.05)。结论:植入脑隔-海马通路后的许旺细胞可在受体内存活并表达低亲和力神经生长因子受体,促进损伤后乙酰胆碱酯酶能神经纤维的再生。     

许旺细胞的体外培养提纯

许旺细胞是组织工程修复神经损伤的种子细胞,能否获得大量且高纯度的许旺细胞对于组织工程学至关重要.许旺细胞的培养纯化技术日趋完善,其经典的培养方法有植块法和酶消化法,在此基础上改进的去除成纤维细胞的方法有差速贴壁法、免疫选择法、阿糖胞苷补充法、刺激因子增殖法等.最近比较新的提纯方法有磁性活细胞分离法、层粘连蛋白纯化法、三维支架联合培养法.另外还有一些因子,如胎牛血清浓度等影响许旺细胞的扩增.这些技术的主要目的就是在体外获得大量的高纯度许旺细胞,以满足组织工程修复神经的需要.许旺细胞的体外培养和提纯方法众多,且已取得初步进展,但在此技术完全成熟之前尚还有许多问题有待解决,如周期长、细胞活性低、在传代培养中细胞生物学特性不稳定等.     

新生大鼠许旺细胞体外培养纯化的最佳培养条件

背景:许旺细胞对促进外周神经的生长,发育和修复有重要作用,目前对于许旺细胞体外培养方法的优劣情况报道不一.目的:筛选许旺细胞最佳体外培养条件.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/10在武汉大学人民医院中心实验室完成.材料:三四天龄SD大鼠24只,由武汉大学医学部实验动物中心提供.方法:无菌剥离大鼠双侧坐骨神经,应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁法分离培养纯化许旺细胞.取处于指数生长期的细胞,调整密度为1×107 L-1接种到6孔培养板,然后分组实验.设定4个条件:培养基pH(6.8～8.8)、胎牛血清体积分数(2%～20%)、培养箱温度(34～39℃)、培养箱CO2浓度(3%～8%).首先固定胎牛血清体积分数、培养箱温度和培养箱CO2浓度,改变培养基pH对细胞进行培养,从而确定最适培养基pH.然后依次改变胎牛血清体积分数、培养箱温度以及培养箱CO2浓度,进而得到其他3个指标的最佳值.镜下观察见明显克隆形成时终止培养,以含5个以上细胞的细胞团作为1个克隆,在倒置显微镜下进行克隆计数.主要观察指标:通过许旺细胞长势及克隆形成情况,筛选许旺细胞体外培养扩增的最适pH、胎牛血清体积分数、培养温度和培养箱CO2浓度.结果:在以DMEM/F12(1:1)为基础培养基的情况下,培养基pH为7.0～7.2时克隆形成最多,＜7.0或＞7.2时克隆形成明显下降:胎牛血清体积分数为10%许旺细胞长势较好且克隆数明显增加,当血清浓度过高或过低时克隆形成相对较差;34～36℃细胞生长受到明显抑制,克隆形成较少,37℃时克隆形成最多,＞37℃细胞长势开始变差,克隆形成下降,至39℃时细胞已无法贴壁民;培养箱CO2浓度为3%～8%时许旺细胞克隆形成无明显变化.结论:许旺细胞体外培养的最佳条件为pH7.2的DMEM/F12(1:1)细胞培养基、胎牛血清体积分数10%、培养箱温度37℃、培养箱CO2浓度5%.     

许旺细胞体外培养纯化的观察

目的:许旺细胞能分泌生长因子,在周围神经再生中起重要作用,获得高纯度许旺细胞是对其研究的重要前提,为此探讨获得高纯度的SD乳鼠的许旺细胞的有效方法。方法:组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法。结果:经组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用,所得许旺细胞的纯度很高,可达98%以上,而且细胞所受到的外界因素影响也较少。结论:通过体外培养方法得到高纯度且受到的外界因素影响小的许旺细胞,可采用组织块反复种植纯化法、低含量胰酶快速消化和差速贴壁法综合运用的方法。     

人神经生长因子基因修饰的许旺细胞治疗脊髓损伤的实验研究

目的:观察神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因修饰的许旺细胞(Schwann cells,SCs)对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复及GAP-43的表达情况,探讨其对脊髓损伤修复的作用机制.方法:清洁级SD大鼠52只,随机分为EGFP-N1-NGF转染许旺移植组16只(A组),许旺细胞移植组16只(B组),PBS对照组12只(C组)和假手术组8只(D组),用改良Allen法制造大鼠脊髓损伤模型.分别于术后7,14,21,28 d用BBB评分法观察动物行为学的变化,用肌电图检测动物中枢传导速度和波幅;然后处死动物,取损伤区1 cm范围脊髓节段,常规石蜡包埋,组织切片,GAP-43免疫组织染色观察脊髓损伤的组织学变化.结果:BBB评分结果D组＞A组＞B组＞C组;肌电图检测结果显示中枢传导速度A、B、C组间差别有统计学意义P＜0.05,D组明显高于其它三组;GAP-43免疫组化检测结果提示A＞B＞C组,D组仅有少量表达.结论:本研究证实NGF基因修饰的许旺细胞能够促进脊髓损伤的恢复,可能是促进神经轴突的生长有关.     

双重消减纯化体外培养许旺细胞

背景: 许旺细胞培养技术和纯化方法虽不断改良, 得到的培养物纯度仍然有限, 双重消减法是否可以培养高纯度许旺细胞。目的: 采用双重消减法对许旺细胞进行培养, 观察其生长情况并测定培养纯度。设计:对照动物实验。单位:首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科,北京市耳鼻咽喉科研究所。材料:实验于2006-03/07在北京市耳鼻咽喉科研究所免疫室和病理室完成。选用20只3天龄Wistar大鼠,雌雄不限,由中国医学科学院实验动物中心提供。方法:分离大鼠坐骨神经,以0.2%胶原酶消化后培养。①分组干预:细胞分为实验组及对照1,2,3组,每组5只。实验组应用双30min差速贴壁法和Ara-c纯化,对照组1,2分别用双30min差速贴壁法和Ara-c纯化处理,对照组3不进行纯化。②实验评估:倒置显微镜下观察许旺细胞生长情况;采用MTT法测量实验组和对照组3生长曲线,观察细胞增殖能力;采用免疫细胞化学染色对许旺细胞进行鉴定;计算许旺细胞培养纯度(每个视野S100阳性细胞占所有细胞的比例)。主要观察指标:①各组许旺细胞生长情况。②免疫细胞化学染色结果。③细胞生长曲线。④许旺细胞培养纯度。结果:①许旺细胞生长情况:培养5d时实验组许旺细胞形态及增殖能力良好,偶见成纤维细胞。对照组1、2在培养第5天时可见较多成纤维细胞,许旺细胞形态好,但较少呈漩涡状排列的生长区域。对照组3从培养第2天开始成纤维细胞迅速增殖,所占比例逐渐增大,许旺细胞生长受到影响,突起较短,少见漩涡状生长区域。②许旺细胞生长曲线:实验组许旺细胞于第3天进入对数增殖期,至第6天达平台期。对照组3较实验组提前1d进入对数增殖期。③免疫细胞化学鉴定结果:实验组经抗S100抗体染色,阳性的许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,梭形或三角形,双极突起,漩涡状排列。成纤维细胞形态不规则,胞浆宽大,着蓝色。④许旺细胞计数:实验组S100阳性细胞所占比例高于对照组3(P<0.01)。结论:利用双重消减法得到较高纯度的许旺细胞培养物。     

许旺细胞源神经营养因子在大鼠腰髓中的表达

背景：许旺细胞能分泌多种营养因子，有保护和营养神经元的作用，并对神经损伤后的修复起促进作用。目的：观察正常成年大鼠和不同胎龄鼠及幼鼠腰髓组织中许旺细胞源神经营养因子的表达，及其对脊髓不同发育时期的作用。设计：对照实验。动物实验。材料：实验于2003-09于南华大学动物实验室完成，采用Wister大鼠30只，雌雄不限，体质量为150-300g，由南华大学动物实验室提供。千预：①取材和切片：取体质量180-220g，成熟期为4-6周正常成年大鼠腰髓和背根神经节，继而行后固定。共8只雌鼠受孕，取不同孕龄母鼠中的胎鼠及幼鼠腰髓组织，分别行冰冻切片。②免疫组化染色：以抗许旺细胞源神经营养蛋白抗体作为一抗，行卵白素-生物素过氧化物酶复合物免疫组化染色，观察染色部位的灰度，通过电脑上扫描计算染色深度得出半定量值，分析许旺细胞源神经营养因子在腰髓的表达。主要观察指标：①正常腰髓免疫组化染色结果。②生长发育的腰髓免疫组化染色结果。结果：共8只雌鼠受孕，实验样本均取自8只受孕雌鼠的胎鼠及所产幼鼠。①正常腰髓免疫组化染色结果：许旺细胞源神经营养因子在成年大鼠腰髓的整个白质和灰质后角Ⅲ、Ⅳ，Ⅴ层有较低表达。②生长发育的腰髓免疫组化染色结果：许旺细胞源神经营养因子在胎龄14d和胎龄15d开始有表达，胚胎时期表达先增高后下降，其中胎龄21d最高。出生后许旺细胞源神经营养因子在腰髓中表达明显下降，其中第7和12d最高。结论：许旺细胞源神经营养因子在成年大鼠腰髓及背根神经节有较低表达，在生长发育的腰髓中表达基本呈逐渐下降趋势。许旺细胞源神经营养因子对大鼠脊髓的发育可能起促进作用，此结果说明许旺细胞源神经营养因子在脊髓生长发育过程中，主要在胚胎发育时期起作用。     

许旺细胞及其与三维支架的联合培养

目的:许旺细胞能够促进损伤的周围神经的再生过程。应用许旺细胞与组织工程材料联合培养,构建人工神经修复周围神经损伤,具有广阔的应用前景。因此,探讨许旺细胞的培养方法以及许旺细胞与三维支架的联合培养对组织工程化人工神经的构建具有重要意义。资料来源:应用计算机检索Medline1984-01/2004-01中有关许旺细胞培养以及组织工程材料的文章,检索词为“Schwanncellsculture,tissuengineeringmaterials,associationculture”,并限定文章语言种类为“English”;同时应用计算机检索中文期刊全文数据库和万方数据库199601/2004-12中有关许旺细胞培养以及组织工程材料的文章,检索词为“许旺细胞培养,组织工程材料,联合培养”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,重点选择介绍许旺细胞培养方法以及许旺细胞与三维支架联合培养的文献,对非随机试验予以排除。资料提炼:在所有检索到的文献中,排除非随机试验的文献以后,最终选择24篇最为相关的作为参考文献。其中有1篇重点介绍许旺细胞的作用,5篇重点介绍许旺细胞的培养方法,其余的主要研究许旺细胞与三维支架的联合培养。资料综合:许旺细胞的培养方法包括组织块法和酶消化培养法。可与许旺细胞进行联合培养的支架材料包括聚酯纤维、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸和聚乳酸共聚物、ZQ膜、壳聚糖等等。这些支架材料为人工神经的构建提供了丰富的原料,为应用组织工程化人工神经修复受损的周围神经奠定了基础。结论:应用组织块法和酶消化培养许旺细胞的技术已经基本成熟。对于那些可与许旺细胞进行联合培养的支架材料的研究,应当尽快由现今单纯的体外培养逐渐向动物实验过渡,为早日研制出合格的人工神经做进一步的努力。