CTLA4Ig表达质粒的基因枪转染皮肤及细胞的实验研究

目的 利用基因枪技术提高CTLA4Ig的cDNA的转染效率。方法 设基因枪局部转染组，注射器局部注射组和肌肉注射组，并构建pCTLA4Ig-IRES2-EGFP表达载体，将质粒注射入皮肤，观察三种方法转移CTLA4Ig目的DNA的存留时间。同时，体外培养ECV，293细胞，用基因枪或逆转录病毒载体转染上述质粒，观察质粒的转染及表达情况。结果 基因枪转移基因至细胞，皮肤的效率明显好于其他方法，但对细胞，基因枪的初始压力不能太高，否则，细胞容易死亡。结论 基因枪转染CTLA4Ig质粒效率较高。     

中子急性损伤对GM-CSF转基因小鼠肝脏和肺中VEGF表达的影响

目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）转基因小鼠经中子照后肺脏和肝脏中血管内皮细胞生长因子（VEGF）蛋白的表达变化。方法 BALB/C小鼠进行全身中子照射,吸收剂量为0.6Gy,分为未转基因组和转基因组,转基因组于照射前24 h进行hGM-CSF活体基因电转染。两组小鼠照射后1、14和28 d分批活杀,应用HE染色观察组织病理形态学变化,免疫组化法检测VEGF的蛋白表达及用Western blot研究VEGF在肺脏和肝脏中的表达变化。结果转基因组小鼠在照后14～28 d,肺脏及肝脏病理损伤较轻,VEGF蛋白表达水平较未转基因组增高。结论 GM-CSF基因活体转染对小鼠中子急性损伤极期和恢复期血管生成和恢复具有促进作用。     

EB病毒膜抗原的表达致转基因小鼠发生淋巴瘤的观察

目的：研究转基因小鼠EB病毒膜抗原（membrane antigen,MA）BLLF1基因的表达与淋巴瘤的关系,探讨EB病毒BLLF1基因作为淋巴瘤致癌基因的可能性。方法（1）观察4只EB病毒膜抗原（MA）BLLF1基因转基因首建鼠（Founder)淋巴瘤的发病时间、发病频率。（2）对发病小鼠进行解剖,观察肿瘤发生部位及特征,取肿瘤组织进行病理学观察。（3）用流式细胞仪分析MA在瘤细胞中的表达并用激光共聚焦显微镜分析MA在瘤细胞中的表达部位。（4）对瘤细胞用碘化丙啶（PropidiumIodide,PI)染色,用激光共聚焦显微镜观察细胞核形改变。（5）用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗CD3单抗及抗SIgM多抗染色,分析瘤细胞的免疫表型。结果（1）4只转基因首建鼠中,2只MA表达阳性鼠分别在4月龄和8月龄时发生淋巴瘤,而2只MA表达阴性小鼠同期内未发生淋巴瘤,发病率为2／4。（2）组织病理学检查及瘤细胞免疫表型分析证明为T细胞淋巴瘤。（3）流式细胞仪分析表明MA在瘤细胞中表达,激光共聚焦显微镜观察证明MA表达部在细胞及细胞膜上。（4）碘化丙啶（PI）染色后,用激光共聚焦显微镜观察证明MA表达部位在细胞浆及细胞膜上。（4）碘化丙啶（PI）染色后,用激光共聚焦显微镜观察细胞核呈分叶状改变,符合癌细胞核形特点。结论EB病毒膜抗原（MA）BLLFI基因的表达可导致转基因小鼠发生淋巴瘤,提示EB病毒BLLF1基因可能为淋巴瘤的致癌基因。     

Tie2基因对纳米金颗粒进入牙周组织的影响

目的 研究Tie2基因表达对不同粒径纳米金颗粒（gold nanoparticles, GNPs）进入牙周组织及停留情况的影响。方法 采用实时定量PCR和Western印迹法检测Tie2基因和蛋白在正常和转基因小鼠牙周组织中的表达;冰冻切片检测GFP在牙周组织中相对高表达的部位;小鼠尾静脉注射1g/kg剂量20、40、60、80nm粒径GNPs,应用ICP-AES技术检测牙周组织Au含量。结果 转基因小鼠比正常小鼠Tie2基因的表达高约2.5倍。Tie2蛋白在转基因小鼠牙周组织中显著高表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。GFP荧光提示Tie2在转基因小鼠牙周组织血管周围表达相对较高。转基因小鼠和正常小鼠牙周组织中GNPs的累积量随粒径增大而减少,正常小鼠牙周组织中GNPs的累积量明显高于转基因小鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 Tie2基因高表达不利于GNPs扩散。     

过表达牙本质涎磷蛋白的骨髓间充质干细胞部分牙向和骨向分化基因的表达

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSC）过表达牙本质涎磷蛋白（DSPP）后的形态学改变，并研究其部分牙向及骨向分化基因的表达情况。方法体外培养小鼠BM-MSC，通过腺病毒介导的方式将DSPP基因转染小鼠BM-MSC，通过标记基因GFP检测转染效率，观察转染后细胞的形态学改变，RT-PCR方法检测过表达DSPP的BM-MSC有无成牙和成骨基因的mRNA表达。结果成功获得小鼠BM-MSC，经腺病毒介导的DSPP基因转染BM-MSC的转染效率可达42．7％，转染后的细胞出现分化，似成牙本质样细胞。转染后细胞表达DSPP、DMP1、Msx1／2、Pax9、Lhx6／7、Sox9、Cbfα1、Osx、Col Ⅰ等多种牙向和骨向发育分化基因。结论过表达DSPP的BM-MSC出现细胞分化，并可表达多种牙向及骨向发育分化的基因。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的表型分析

目的：研究乙型肝炎病毒X蛋白致转基因小鼠的表型效应。方法：采用免疫组织化学和组织病理学方法分析转基因小鼠中X蛋白的表达部位及其病理学改变。结果：免疫组织化学检测发现X蛋白在转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤组织中均有表达，从F0代到F3代小鼠，X蛋白在肝细胞中的分布逐渐从细胞质向细胞核转移。病理学分析显示，表达X蛋白的转基因小鼠出现了皮肤组织结构异常、肝组织和肺组织轻度变性等病理学变化。结论：乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤等组织中表达X蛋白，部分转基因小鼠出现的皮肤组织、肝组织和肺组织病理性损伤可能与X蛋白有关；各代转基因小鼠肝细胞中X蛋白的分布具有规律性的变化，可用于研究X蛋白在不同部位发挥功能的途径。     

Pin1在皮肤组织中的表达以及可诱导转基因小鼠模型的建立

目的 观察Pin1在皮肤中的表达情况，构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型。方法 将小鼠Pin1基因克隆到改造过的可与Myc标签蛋白融合的pTRE2载体中，并将线性化的DNA通过显微注射的方式构建TRE-Pin1小鼠。结果 我们成功获得TRE-Pin1转基因首建鼠，该小鼠与上皮特异的K14-rtTA转基因小鼠配繁，获得Pin1在皮肤上皮特异性的可诱导表达的双转基因小鼠；我们通过将多西霉素（又名强力霉素， Doxycycline）加入饮水的方式诱导Pin1基因的表达，并通过Western blot，免疫组织化学等方式证明了Pin1蛋白在皮肤上皮中能特异性地过表达。我们还发现内源的Pin1在皮肤中主要表达于上皮细胞。结论 我们成功地构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型，为后续研究Pin1在皮肤中的功能奠定基础。     

GH/tPA双转基因小鼠的制备及其表达分析

目的 旨在获得GH/tPA双转基因小鼠,并比较分析小鼠乳腺中人组织纤溶酶原激活剂（tPA）的表达水平和个体生长发育状况。方法 利用2只tPA单转基因雄性小鼠（P03、P05）与经超数排卵处理的正常非转基因雌性小鼠交配,受精卵显微注射线性化的GH质粒、胚胎移植而获得后代小鼠,PCR检测基因整合情况,ELISA和Western blotting检测比较单、双基因表达tPA水平,监测转基因小鼠不同生长阶段的体质量来分析GH基因对小鼠生长发育的影响。结果 P03系小鼠共获得286枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔77只,经PCR检测获得16只tPA单转基因小鼠（7♂,9♀）,13只GH/tPA双转基因小鼠（8♂,5♀）,双基因整合率为16.9%;P05系小鼠共获得175枚受精卵,移植受体母鼠后,顺利产仔34只,经PCR检测获得12只tPA单转基因小鼠（5♂, 7♀）,7只GH/tPA双转基因小鼠（3♂,4♀）,双基因整合率为20.6%。单、双转基因小鼠乳腺中表达tPA的最高量分别为82.5 μg/mL、674 μg/mL,GH/tPA双转基因小鼠乳腺中表达tPA的量明显高于tPA单转基因（P<0.05）。在小鼠的整个生长周期内,单、双转基因与正常非转基因小鼠的体质量增长均没有显著的差异（P>0.05）。结论 本实验成功地制备了GH/tPA双转基因小鼠,结果表明GH基因导入小鼠体内能够显著地提高目的基因tPA的表达水平,且不会对转基因小鼠的生长发育造成任何明显的影响,这为将来制备高表达转基因动物生产医药蛋白及其育种奠定了基础。     

唐氏综合征细胞黏附分子在APP转基因小鼠海马中的表达变化及其意义

目的  观察唐氏综合征细胞黏附分子（DSCAM）在淀粉样前蛋白（APP）转基因小鼠海马中的表达变化规律,探讨其意义。方法  选择月龄分别为1、3、6和12个月的APP转基因和野生型小鼠,应用免疫组织化学法对脑切片进行染色,观察DSCAM在APP转基因小鼠脑中的表达,应用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测该蛋白在海马中表达量的变化规律,野生型小鼠做对照。结果  DSCAM主要在APP转基因小鼠大脑皮层、海马的锥体细胞中表达。在两组小鼠中,DSCAM在海马中的表达水平随年龄增长而下降（P <0.05）。DSCAM在APP转基因小鼠海马中的表达量明显高于同龄野生型小鼠（P <0.05）。结论  DSCAM在APP转基因小鼠海马内的过度表达可能在APP小鼠的学习和记忆能力下降中扮演重要角色。

     

人Man2c1转基因小鼠外周血中性粒细胞和CD8+T细胞的调节

目的以转hMan2c1基因小鼠为模型,分析hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏的蛋白表达和活性,研究hMan2c1基因对于机体免疫系统的影响。方法Western blot方法检测hMan2c1基因在脾脏的蛋白表达并检测小鼠脾脏α-甘露糖苷酶活性;血常规分析外周血中各种血细胞的比例;以BSA作为抗原观察机体的免疫应答;流式细胞技术观察外周血中CD4 、CD8 、B、NK细胞的数量。结果Western blot结果显示,与野生型小鼠比较,hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏组织有明显的表达,α-甘露糖苷酶活性明显增高,中性粒细胞明显升高。BSA刺激后,转基因小鼠外周血免疫细胞中的CD8 T淋巴细胞明显高于野生型小鼠。结论hMan2c1基因在小鼠脾脏表达引起α-甘露糖苷酶活性显著升高,并进一步影响淋巴细胞的生成,增加中性粒细胞和CD8 T淋巴细胞对免疫原的应答。     

融合基因GM-CSF/IL-2转基因瘤苗在肝癌特异性免疫治疗中的应用

目的 制备人白细胞介素2(hIL-2)与鼠粒-单核细胞集落刺激因子(mGM-CSF)融合基因修饰的H22肝癌全细胞瘤苗,探索融合基因GM.CSF/IL-2转基因瘤苗,在肝癌主动免疫治疗中特异性抗肿瘤作用.方法 用含hlL-2与mGM-CSF融合基因的真核表达载体在体外转染H22肝癌细胞,制成疫苗,皮下接种Balb/c小鼠,同时建立Balb/c小鼠荷瘤模型,ELISA法检测H22/pcDNA3.1( ).GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(分别接种H22/pcDNA3.1( )瘤苗、H22瘤苗、PBS)血清中IL-10、IFN- γ水平,观察小鼠存活期;同时用51Cγ释放法测定H22/pcDNA3.1( )-GM-CSF/IL-2瘤苗免疫组小鼠与各对照组小鼠(单纯荷瘤组、正常组)脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性.结果 成功制备了含有hIL2与mGM-CSF融合基因的H22肝癌瘤苗,转基因瘤苗免疫组小鼠的脾细胞在体外对亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于对照组小鼠的脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤率(分别为13.6%和7.5%),也高于其对S180细胞的杀伤率(9.1%)(P＜0.05).转基因瘤苗免疫组小鼠血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01),血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).同时,转基因瘤苗免疫组小鼠生存期亦有明显延长.结论 转染hIL-2与mGM-CSF融合基因的同系肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应,延长荷瘤小鼠生存期.     

Effects of Exogenous p16^ink4a Gene on Biological Behaviors of Human Lung Cancer Cells

The effects of exogenous p16ink4a gene on biological behaviors of human lung cancer cell line with homozygous deletion of p16ink4a gene were investigated. Exogenous p16ink4a gene was transfected by lipofectin into human lung cell line A549, in which p16ink4a gene was homozygously deleted. The expression of p16ink4a mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunocyto-chemistry, respectively. The changes in the behaviors of the transfected cell lines in vitro and in vivo were observed. In the transfected cell line A549, the exogenous p16ink4a gene could be stably ex-pressed. The growth of A549 cells transfected with p16ink4a gene was obviously slowed down. Flow cytometry revealed that transfection of the exogenous p16ink4a gene resulted in A549 cell lines arrest in G1 phase of cell cycle. The tumorigenicity of these transfected cells in nude mice could be inhib-ited, and the tumor growth of nude mice was significantly suppressed. It was concluded that exoge-nous p16ink4a gene may be stably expressed in human lung cancer cell line A549. The expression of the introduced p16ink4a could block lung cancer cells to entry into S phase of cell cycle and inhibit tumor malignant growth both in vitro and in vivo.     

C57小鼠源性淋巴瘤的基因枪途径抗肿瘤免疫研究

[目的]诱导C57小鼠建立有效的抗肿瘤免疫.[方法]用基因枪途径给C57小鼠腹部接种含有粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)基因的质粒,24h后在同一部位注射FBL3肿瘤细胞破碎后的上清液,15d后用3×106个FBL3肿瘤细胞皮下接种攻击.[结果]肿瘤的生长受到抑制,小鼠的生存时间明显延长.[结论]基因枪途径局部接种含有GMCSF基因的质粒,可增强机体的抗肿瘤免疫,抑制肿瘤细胞的生长.     

巨噬细胞对转染粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的胰腺癌细胞株PC-3的杀伤作用

目的 研究巨噬细胞对转染粒细胞-巨噬细胞细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因后的胰腺癌细胞系PC-3的杀伤作用。方法 巨噬细胞由小鼠腹腔注射ConA刺激后分离培养而获得。通过脂质体转染法,将含GM-CSF基因的质粒及空质粒转染至PC-3细胞。以上基因的表达由Western blot免疫印迹法鉴定。采用Cal-cein-AM释放法行巨噬细胞杀伤试验以评估GM-CSF对肿瘤免疫调节作用。结果 巨噬细胞对转染GM-CSF基因后的PC-3细胞杀伤率较空质粒组显著增高(P<0.001)。结论 GM-CSF能增强巨噬细胞杀伤PC-3细胞的能力,提示GM-CSF对于胰腺癌的免疫治疗有潜在价值。     

Therapeutic antitumor response to cervical cancer in mice immunized with U14 v accines transfected with costimulatory B7 gene

Objective To investigate the effect of U14 vaccine transfected with the B7 gene in inducin g antitumor immune response to murine cervical carcinoma in Chinese 615-strain mice.Methods A recombinant retroviral plasmid vector expressing mouse B7-1 gene (pLNSX-mB7) was transfected into 615-strain mouse cervical carcinoma cell line No. 14 (U1 4) by electroporation to set up a highly-expressed mB7-1 U14 cell clonal strai n (B7(+)U14). In vivo experiments: (1) B7(+)U14 vaccine was primed to protect t he 615-strain mice against U14 re-challenge. (2) B7(+)U14 vaccine was injecte d into tumor-bearing mice with different tumor sizes. Lifetimes and tumor s izes were recorded. In vitro cytotoxicity assay: Mice were immunized with B 7(+)U14 or U14 vaccine and 2 weeks later, spleen cells of those mice were cultur ed for 2 days. The cytotoxicity of these cells against U14 was detected by 5-d iphenyl tetrazolium bromide assay.Results We obtained several B7-1 high expression clonal U14 lines. In vivo experiment, we did not find tumor growing in 3 of the 6 mice primed by B7(+)U14 vaccine during their entire life after re-challenge with U14. The other 3 mice develo ped tumors and their average survival time was longer than that of the control g roup (P&lt;0.01). All 6 mice grew tumors in the control group. When the transplanted tumors became palpable, the mice were randomly divided into 3 group s to be injected with B7(+)U14 vaccine. It was effective for tumor-bearing mic e only when the tumor diameters were &lt;3 mm. When the diameters were ≥3 mm, it was not efficacious to inject B7(+)U14 vaccine (P&lt;0.05). In vitro cytotoxicity assay, cytotoxic T lymphocytes induced by B7(+)U14 vaccine h ad a high er cytotoxicity against U14 than that induced by U14 vaccine (F=310.8, P &lt;0.001).Conclusions Vaccines of cervical cancer cells transfected with the costimulatory molecule B7 gene can induce antitumor immune protection in host mice against U14 re-challe nge. This treatment may cure part of the tumor-bearing mice but be restricted by tumor size. The results suggest that transfecting the B7 gene into cervical cancer as a cell vaccine may be an efficient supplementary method to treat cervi cal cancer after operation.     

野生型p53基因抑制胆囊癌细胞裸鼠体内生长的实验研究

目的：研究转染野生型p53（wtp53）基因对胆囊癌细胞裸鼠体内生长的影响。方法：在脂质体介导下将含有wtp53的真核表达质粒pCMV—p53，导入GBC—SD细胞中。用G418筛选，建立转染克隆细胞系。以PCR、RT—PCR和蛋白质印迹法证实外源p53基因的整合与表达。用裸鼠移植瘤试验检测体内致瘤性的影响。结果：野生型p53基因成功的导入胆囊癌细胞系，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。表达外源wtp53的GBC—SD—wtp53细胞，裸鼠体内致瘤性受到显著抑制。结论：野生型p53基因可有效抑制胆囊癌细胞在裸鼠体内的生长。     

转粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因瘤苗治疗T细胞淋巴瘤的实验研究

目的:探讨转粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophge colong stimulating factor,GM-CSF)基因瘤苗治疗小鼠T淋巴细胞瘤的方法。方法:将小鼠GM-CSF真核表达质粒用电穿孔法导入小鼠淋巴瘤细胞系RMA,有限稀释法制备单个细胞克隆,经RT-PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM-CSF的RMA克隆,该克隆细胞经丝裂霉素灭活后免疫小鼠以诱导其产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力。结果:获得了高表达GM-CSF的RMA克隆,将其用丝裂霉素灭活后免疫小鼠使小鼠使小鼠产生了抗肿瘤免疫保护力。结论:转GM-CSF基因瘤苗可作为有效的抗肿瘤瘤苗。     

淋巴瘤细胞转染GM-CSF 基因后生物学特性的变化

目的：制备高表达GM－CSF的淋巴瘤细胞系，观察淋巴瘤细胞转染GM－CSF基因后生物学特性的改变。方法：将小鼠GF－CSF真核表达质粒用电穿孔法导入小鼠淋巴瘤细胞系RMA，有限稀释法制备单个细胞克隆，经RT－PCR，骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM－CSF的RMA克隆，并观察其生物学特性的改变。结果：获得了高表达GM－CS的RMA细胞系,其同基因动物体内致瘤性降低。结论：淋巴瘤细胞系RMA转染GM－CSF基因后致瘤性降低。     

IL-6和B7双基因转染的小鼠EL-4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用

目的:探讨IL-6和B7双基因转染的小鼠肿瘤疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应.方法:利用含小鼠B7分子和人IL-6分子cDNA的逆转录病毒载体pLmB7SN和pLhIL-6SN分别转染包装细胞株CRIP,经G418抗性筛选后以含有B7或IL-6外源基因的病毒颗粒感染小鼠EL-4胸腺瘤细胞,观察EL-4-IL-6、EL-4-B7、EL-4-IL-6+B7细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力.结果:相对亲本肿瘤细胞EL-4而言,单基因和双基因转染的EL-4细胞在小鼠体内的生长速度均明显减慢,小鼠存活时间均有一定延长,3种转基因的EL-4细胞经X-射线灭活后免疫小鼠,虽均未能阻止随后接种的EL-4细胞的生长,但小鼠存活时间都明显延长,IL-6和B7双基因转染的EL-4肿瘤细胞在抗肿瘤活性方面与IL-6或B7单基因转染的EL-4细胞差异无显著性.结论:与单基因表达疫苗比较,双基因表达疫苗没有表现出协同的抗肿瘤效应.     

C57小鼠淋巴细胞瘤电转染GM-CSF基因研究

目的:制备高表达GM-CSF的C57小鼠T淋巴瘤细胞系。方法:将小鼠GM-CSF真核表达质粒用电穿孔方法导入C57小鼠T淋巴瘤细胞中,倍比稀释法制备单个细胞克隆,经RT-PCR、骨髓干细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM-CSF的RMA-GM克隆。结果:获得了高表达GM-CSF的RMA细胞系RMA-GM,其出瘤时间延长。结论:C57小鼠RMA-GM克隆细胞出瘤时间延长,肿瘤细胞免疫原性增强。