应用血清蛋白组学技术筛选鼻咽癌肿瘤抗原

目的: 应用血清蛋白组学技术优化肿瘤抗原筛选方法,筛选鼻咽癌肿瘤抗原.方法: 以免疫印迹技术筛选出含有特异性抗体的鼻咽癌患者血清,运用免疫沉淀技术对血清与鼻咽癌细胞株(CNE1)的裂解物进行处理以富集肿瘤抗原,正常人血清做对照,经凝胶电泳找出差异条带,通过质谱分析、数据库搜索和信息学分析鉴定差异蛋白.结果: 应用此方法找出存在于鼻咽癌样本中的明显差异条带1条,重复性较好,经鉴定该条带为膜结合IgM.结论: 采用上述方法筛选肿瘤抗原行之有效,可能成为肿瘤抗原筛选的一种简单、便捷、灵敏的有效方法,得到鼻咽癌候选抗原膜结合IgM.     

卵巢癌细胞与卵巢癌淋巴定向高转移细胞分泌蛋白差异初筛

目的:分析卵巢癌细胞株(SKOV3)与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞株(SKOV3-PM4)分泌蛋白的差异,寻找与卵巢癌淋巴定向转移密切相关的潜在诊断分子标志。方法:分别收集SKOV3与SKOV3-PM4培养上清,利用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI_T0F-MS/MS)技术筛选及鉴定差异表达的蛋白点,对其进行生物学分析后采用蛋白质印迹法验证挑选目标蛋白在细胞分泌蛋白中的表达情况。结果:二维凝胶电泳显示,SK-OV3细胞分泌蛋白质点数约为569±156,SKOV3-PM4细胞分泌蛋白质点数约为598±175。选取差异较大的7个差异蛋白点进行MS+MS/MS质谱鉴定,分别为乙二醛酶1(GLO1)、翻译后调节肿瘤蛋白(TPTC)、二磷酸核苷激酶B(ND-PK-B)、膜联蛋白(ANXA1)、热休克蛋白27(HSP)、过氧化物氧化还原(PRDX1)和磷脂酰乙醇胺结合蛋白Ⅰ(PEBP-Ⅰ)。挑选NDPK-B、ANXA1和HSP蛋白经蛋白质印迹法验证发现,SKOV3-PM4细胞中ANXA1和HSP27表达高于SKOV3细胞,而NDPK-B表达低于SKOV3细胞。与质谱分析的结果基本一致。结论:在卵巢癌细胞与卵巢癌淋巴结定向高转移细胞之间分泌蛋白存在很大的差异,其中已被鉴定的ANXA1和HSP27与卵巢癌淋巴结转移密切相关,有望成为诊断或预测卵巢癌淋巴结转移患者血清检测的标志。     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的:筛选肿瘤血管靶向肽GX1(CGNSNPKSC)的受体.方法:化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs),培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞(co-HUVECs)全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果:免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间.利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A(NDPKA).结论:利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础.     

肿瘤相关抗原HSC70在食管癌中的鉴定与表达研究

目的 探索食管鳞状细胞癌的肿瘤相关抗原。方法 提取食管鳞状细胞癌组织蛋白,用20例食管癌患者血清和20例健康对照血清分别作为检测抗体进行Western blot分析,比较分析二者的差异,将差异蛋白酶解后用质谱进行鉴定分析;用免疫组化方法对鉴定的肿瘤相关抗原进行验证。结果 食管癌血清的阳性信号比较多,其中70 kDa的蛋白阳性率为40%(8/20),而健康对照血清阳性率为0%(0/20),该蛋白被鉴定为HSC70或称HSPA8。免疫组化结果显示HSC70在食管癌组织主要表达于细胞浆和细胞核,且表达明显高于癌旁正常组织。结论 联合免疫印记和质谱技术可以鉴定肿瘤相关抗原;HSC70可能是食管癌发生的重要参与蛋白,可能是食管癌诊断和治疗的关键靶分子。     

新的肺癌血清标志物——甲状腺运载蛋白

背景与目的 肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一,迄今缺乏临床诊断可用的分子标志物.本实验应用SELDI技术寻找肺癌新的血清标志物.方法 对227例血清样品(包括146例肺癌、13例肺炎、28例结核性胸膜炎和40例正常人血清样品)进行蛋白质谱检测.对候选蛋白进行质谱鉴定,并结合免疫共沉淀和ELISA技术筛选出肺癌新的候选标志物.结果 通过Biomarker WizardTM软件分析显示13.78 kDa、13.90 kDa和14.07 kDa的蛋白峰在肺癌病人血清样品中明显低于对照组.通过1-D胶分离,质谱鉴定和免疫沉淀分析显示这3个差异蛋白峰为野生型甲状腺运载蛋白(nativeTTR)和它的两个变体(cysTTR and glutTTR).ELISA和SELDI技术分析上述血清样品均发现TTRs在肺癌血清中的表达下调.结论 采用SELDI技术首次筛选并鉴定出TTRs,表明其可能作为肺癌诊断的候选血清标志物.     

胃癌血管特异性短肽GEBP11结合受体的免疫沉淀法筛选

目的:筛选胃癌血管特异性短肽GEBP11(CTKNSYLMC)的结合受体.方法:采用Western-blot、免疫细胞化学染色法对共培养人脐静脉内皮细胞(co-HUVECs)CD31和KDR的表达进行检测;化学合成生物素标记的GEBP11,应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GEBP11结合的蛋白质;采用Western-blot检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用液相色谱一二级质谱(LC-MS/MS)及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果:co-HUVECs表达CD31,KDR表达增加.通过免疫沉淀和Western-blot分析,发现一条与GEBP11特异结合的条带,其分子量约为12KD.经LC-MS/MS和生物信息学分析,获得候选蛋白ATP7B.结论:经鉴定co-HUVECs表达内皮细胞标志性分子且KDR表达上调;利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GEBP11受体的候选蛋白,为研究GEBP11的作用机制奠定了基础.     

一种新的组学技术-肿瘤抗原组学

肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens,TAA)的筛选是实现肿瘤早期诊断及生物治疗的基础与瓶颈。现有技术(SEREX、SERPA、蛋白芯片等)虽在TAA筛选中取得了一系列重要成果,但并不能满足有效筛选TAA的需要。因此,建立新的筛选策略和技术平台成为筛选TAA的重要挑战。近来,为快速筛选病原体全部抗原,一种被称为抗原组(antigenome)的新型组学技术被建立起来,多种细菌的抗原组已被确定。本研究组在抗原组、肿瘤免疫组学以及其它组学研究成果的基础上,尝试提出肿瘤抗原组(Cancer antigenome)与肿瘤抗原组学(Cancer antigenomics)的概念。认为:肿瘤抗原组是指肿瘤细胞内全部抗原(蛋白类抗原和非蛋白类抗原)的总合;肿瘤抗原组学是主要利用免疫学、抗原表位组学、抗体组学及多系统组学相关高通量技术有效筛选肿瘤相关抗原的一门新兴学科。该技术将候选抗原的免疫学筛选作为TAA筛选的首要条件,显著提高了病原体抗原的筛选效率和特异性。肿瘤抗原组学的技术方案是:采用异种疫苗免疫技术,先将包含全部肿瘤抗原的肿瘤组织裂解物作为疫苗免疫动物,制备特异性抗体,再通过免疫分离、鉴定技术(免疫亲和层析、免疫沉淀技术、质谱技术)分离、鉴定TAA。显然,肿瘤抗原组学的提出为TAA的筛选提供了新的技术方法,对于筛选、确定肝癌早期生物诊断和生物免疫治疗靶标具有一定意义。     

一种肿瘤相关抗原在非小细胞肺癌中的鉴定和表达

[目的]运用血清蛋白质组分析技术(SERPA)鉴定非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤相关抗原.[方法]提取NSCLC肿瘤组织的胞浆蛋白,经二维凝胶电泳分离后转膜,用患者或健康对照血清为一抗进行免疫印迹分析,比较免疫印迹的结果,在未转膜的参比凝胶上找到差异蛋白点,进行MALDI-TOF鉴定;用免疫组化方法验证NSCLC组织中候选抗原的表达.[结果]本研究共鉴定4个候选蛋白.CCT5在肺鳞癌和肺腺癌组织中表达明显升高,且主要定位于癌细胞浆,胞核未检测到表达.[结论] CCT5可能是NSCLC的肿瘤相关抗原.     

肿瘤血管靶向肽GX1的受体筛选

目的：筛选肿瘤血管靶向肽GX1（CGNSNPKSC）的受体。方法：化学合成生物素标记的GX1,分离培养原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,培养并收集共培养人脐静脉内皮细胞（co-HUVECs）全蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GX1结合的蛋白质;采用银染检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALD I-TOF-MS）及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析。结果：免疫沉淀和银染法获得与GX1特异性结合的蛋白条带,其分子量在10-15KDa之间。利用MALDI-TOF-MS及生物信息学分析获得了一个有意义的候选蛋白核苷二磷酸激酶A（NDPKA）。结论：利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GX1受体的候选蛋白,为研究GX1的作用机制奠定了基础。     

胃癌血管特异性短肽GEBP11结合受体的免疫沉淀法筛选

目的：筛选胃癌血管特异性短肽GEBP11（CTKNSYLMC）的结合受体.方法：采用Western-blot、免疫细胞化学染色法对共培养人脐静脉内皮细胞（co-HUVECs）CD31和KDR的表达进行检测;化学合成生物素标记的GEBP11,应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与GEBP11结合的蛋白质;采用Western-blot检测,确定并获取特异性蛋白条带;利用液相色谱一二级质谱（LC-MS/MS）及生物信息学分析,对条带蛋白进行测序和分析.结果：co-HUVECs表达CD31,KDR表达增加.通过免疫沉淀和Western-blot分析,发现一条与GEBP11特异结合的条带,其分子量约为12KD.经LC-MS/MS和生物信息学分析,获得候选蛋白ATP7B.结论：经鉴定co-HUVECs表达内皮细胞标志性分子且KDR表达上调;利用免疫沉淀-质谱法筛选获得了GEBP11受体的候选蛋白,为研究GEBP11的作用机制奠定了基础.     

Overexpression of focal adhesion kinase, a protein tyrosine kinase, in ovarian carcinoma.

BACKGROUND: Focal adhesion kinase (FAK) is a tyrosine kinase that is important to such key functions such as cell adhesion, motility, and invasion. A MEDLINE search of the years 1980-1998 found no previous reports of FAK expression in human ovarian carcinoma. The authors performed experiments to determine whether FAK expression is elevated in this disease. METHODS: Ten normal human ovarian tissue samples and 26 cancer samples from patients with Stage I-IV ovarian carcinoma were obtained. Two ovarian carcinoma cell lines were also analyzed. FAK expression was determined by Western blot analysis with the V39 anti-human FAK polyclonal antibody. The level of FAK protein expression was determined using densitometric scanning of the 125 kD band on autoradiographs of Western immunoblots. RESULTS: Serous cancers expressed fourfold-increased values of FAK relative to normal ovarian tissue (P < 0.0001), and nonserous adenocarcinomas expressed threefold- to fourfold-increased values of FAK (P < 0. 0006). Ovarian carcinoma cell lines also expressed increased values of FAK. With a cutoff of 40, an elevated FAK level was associated with a sensitivity of 93% and specificity of 100%. There was no significant difference in FAK expression with regard to grade or stage of tumor. CONCLUSIONS: FAK is significantly overexpressed in ovarian carcinoma, implying that FAK may play an important role in ovarian carcinogenesis. FAK expression may be useful as a screening tool to identify newly developed disease or as a tumor marker in confirmed cases of epithelial ovarian carcinoma. FAK may also serve as a potential target for therapeutic disruption of ovarian carcinoma progression.     

α1，2-岩藻糖转移酶基因转染对卵巢癌细胞中HER2/neu表达及活性的影响

目的:探讨α1,2-岩藻糖转移酶（α1,2-fucosyltransferase,FUT1）基因转染对人卵巢癌细胞中HER2/neu表达及活性的影响。方法:分别应用Real time PCR、免疫细胞化学染色和Western blot方法检测转染前后卵巢癌细胞中HER2/neu在基因、蛋白水平上的表达和磷酸化情况,利用免疫共沉淀方法检测HER2/neu蛋白上是否有Lewis(y) 结构。结果:Real time PCR结果显示转染后细胞中HER2/neu mRNA表达明显增高。免疫细胞化学染色、免疫共沉淀结合Western blot检测到转染后卵巢癌细胞中HER2/neu蛋白和Lewis(y)抗原的表达均较转染前显著增加,HER2/neu蛋白上有Lewis(y)抗原结构。Western blot结果显示基因转染后HER2/neu的酪氨酸磷酸化水平显著升高。结论:Lewis(y)抗原是HER2/neu结构上的一部分,其表达增加不但促进卵巢癌细胞中HER2/neu的表达,还激活了HER2/neu受体酪氨酸激酶。     

Detection of the p110 beta subunit of phosphatidylinositol 3-kinase complexed with neutral endopeptidase

BACKGROUND: Neutral endopeptidase 24.11 (NEP) is a cell-surface peptidase that inactivates a variety of neuropeptide substrates. In addition to catalytic activity, NEP can exert biological effects through protein-protein interactions. We previously reported that NEP directly associated with tyrosine-phosphorylated Lyn kinase, and with the p85 subunit of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase) resulting in an NEP-Lyn-PI3 kinase protein complex. MATERIALS AND METHODS: In this report, we investigated the association of NEP with cytoplasmic proteins using ProteinChip Array, surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI) technology combined with time-of-flight mass spectrometry, as well as immunoprecipitation and Western blottings. RESULTS: Using immunocapture on the ProteinChip surface, we identified a 122 kDa protein which associates with NEP derived from LNCaP cell lysates which had the identical molecular weight as the beta-subunit of p110 subunit of phosphatidylinositol 3-kinase. The identity of the p110 beta was confirmed by Western blot analysis of NEP and p110 beta immunoprecipitates using monoclonal antibodies specific for NEP and p110 beta. CONCLUSION: These data confirm the association of phosphatidylinositol 3-kinase (consisting of the p85 adaptor and p110 beta-subunit) with NEP. Furthermore, this work demonstrates the ability of mass spectrometry to identify proteins interacting with NEP and potentially other cell-surface peptidases.     

食管癌中KIAA1522基因的转录本及蛋白表达分析

目的：检测食管鳞癌组织及细胞系中KIAA1522基因不同转录本的表达及丰度，确定其蛋白的表观分子量，为进一步研究KIAA1522在食管癌中的表达改变及功能提供实验依据。方法：使用反转录PCR（RT-PCR）及实时荧光定量PCR（qPCR）检测食管癌组织及细胞系中KIAA1522基因4个不同转录本的表达及丰度；以特异性siRNA敲降食管癌细胞中KIAA1522的表达，并在模式细胞中过表达KIAA1522，通过Western blot检测确定KIAA1522的表观分子量，并通过质谱分析验证KIAA1522条带的序列组成。结果：KIAA1522的转录本T1和T4在食管鳞癌组织及多个细胞系中均有表达，其中T1的表达丰度相对最高。Western blot检测中观察到的分子量为170 kDa的条带为KIAA1522基因特异性的蛋白表达产物，同时质谱分析结果也证实该条带为KIAA1522多肽。结论：T1为食管鳞癌组织及细胞系中KIAA1522基因的优势转录本，KIAA1522蛋白的表观分子量为170 kDa。     

基于iTRAQ标记结合2D nano HPLC-ESI-OrbiTrap MS/MS技术筛选卵巢癌血清标记物

  目的  利用相对和绝对同位素标记（iTRAQ）和纳升级两维高效液相色谱-电喷雾-OrbiTrap质谱（2D nano HPLC-ESI-OrbiTrap MS/MS）蛋白组学方法探寻卵巢癌血清标记物,以提高早期卵巢癌诊断率。  方法  收集卵巢癌患者血清20例（卵巢癌组）,CA125异常的卵巢良性囊肿16例（良性囊肿组）,健康者20例（正常对照组）,每组取10例组内等量混合后去除高丰度蛋白,iTRAQ试剂标记,进行强离子交换柱分离多肽、nanoLC分离并在线连接电喷雾串联OrbiTrap质谱分析,筛选出重要的差异蛋白。随后采用Western blot方法,将筛选出的重要差异蛋白进行56例临床血清样本逐例验证。  结果  共鉴定出差异蛋白326个。其中重点筛选出了8个重要的差异蛋白:蛋白PARD3、SRP1-alpha、LAMA4、LRP16、IgSF2、NRAMP1、NF-E2-related factor 1和APOA4;验证了3个重要差异蛋白:PARD3、NRAMP1、APOA4。  结论  应用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术筛选出了8个重要的差异蛋白,可能是潜在的肿瘤标记物。其中APOA4蛋白有可能成为区分恶性与良性卵巢疾病的生物标志物。