基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化,菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响;比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-P_(eha)LacZ质粒,采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性;选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株,阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2h,RNA-Sequencing结果表明:eha基因缺失株转录水平和野生株相比,147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2Ratio|≥1),其中113个上调,34个基因下调,qRT-PCR随机抽样,和RNA-Sequencing表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论在酸性生存环境,Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。     

eha基因调控迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞氧化杀菌作用

目的 迟缓爱德华菌(E.tarda)能够在巨噬细胞内生存和繁殖,必须抵抗细胞产生活性氧的杀菌作用。eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨eha基因调控E.tarda抵抗巨噬细胞氧化杀菌的机制。方法 光镜观察野生株和缺失株分别感染RAW264.7巨噬细胞的过程,及菌落计数法测定细菌胞内存活数目;测定细菌在不同H₂O₂浓度中的存活率;流式法检测细菌感染巨噬细胞后产生活性氧的细胞比率;qRT-PCR测定细菌超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB的转录水平。结果 eha基因的缺失,使E.tarda在巨噬细胞内的繁殖速率明显下降(P<0.05),使该菌在不同H₂O₂浓度中的存活率显著降低(P<0.05),使该菌感染细胞组产生活性氧的细胞比率升高;qRT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得该菌的超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB转录水平下降。结论 eha基因通过调控E.tarda菌分解H₂O₂相关基因的表达,从而影响该菌分解巨噬细胞中活性氧的能力和在胞内外的存活率。因此,eha 基因调控了E.tarda菌抵抗巨噬细胞内氧化杀菌作用,有助于该菌在巨噬细胞内生存和繁殖。     

eha基因调控迟缓爱德华菌的毒力

目的 eha基因是E.tarda毒力株ET-13一个重要的转录调控基因,本文研究其对该菌株毒力的影响。方法 利用菌落计数法比较野生株和eha缺失株感染小鼠毒力(LD₅₀)的差异,以及比较两菌株在小鼠每个肝脏、脾脏和肾脏中细菌菌落数目的差异;利用组织HE染色观察两菌株对宿主组织损伤的差异;利用RT-PCR,比较两种细菌毒力基因表达的差异。结果 eha缺失株相比野生株其毒力下降了2.5倍;eha缺失株在宿主体内的生存能力明显降低。小鼠感染野生株后,出现肝细胞水肿和中性粒细胞浸润,脾小体内细胞坏死,肾小管水肿等病变,以及上述脏器外观出现改变。提示野生株对小鼠的肝脏、脾脏和肾脏有毒性作用,而eha缺失株对上述脏器无明显毒性作用。RT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得E.tarda菌的Ⅲ型分泌系统分泌蛋白基因eseC和外膜蛋白基因(pagC)的转录水平下降,菌毛蛋白基因(fimA)的转录水平没有改变。结论 eha基因缺失后,E.tarda菌 ET-13株的毒力因子表达降低,使该菌毒力明显减弱,对宿主的致病性和病理损伤减轻。因此,eha基因是一个毒力正调控基因。     

eha,迟缓爱德华菌一个毒力调控基因

目的探讨迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)溶血相关基因(E.tardahaemolysin activator gene,eha)基因调控该菌毒力基因的作用。方法利用自杀质粒pHM5,缺失E.tarda的eha基因,得到△eha缺失菌株,再构建△eha株的互补菌株。通过平板溶血性法、接触溶血法、上清溶血法,观察野生株、△eha缺失株与及互补株溶血性的差异。利用MTT法比较三种细菌培养物的过滤液对Vero细胞的毒性的差别。利用H2O2抗性纸片扩散法,比较三种菌对过氧化氢抵抗力的差异。利用RT-PCR和SDD-PAGE电泳超速酸化离心法提取的鞭毛蛋白,比较三种细菌鞭毛基因的转录和表达的差异。结果△eha缺失株和互补株不溶血,而野生株溶血。eha基因的缺失降低E.tarda菌对过氧化氢的抵抗力,△eha缺失株较野生株的细胞毒性明显减弱,eha基因可以调控迟缓爱德菌鞭毛基因的转录和表达。结论 eha基因可以调控迟缓爱德华菌毒力基因的表达,是一个毒力调控基因。     

布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043的功能和致病机制研究

目的 研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043在布鲁氏菌感染和胞内生存过程中的作用。方法 以羊种布鲁氏菌104株为起始菌株,通过同源重组的方法构建布鲁氏菌BPE043基因缺失株。将布鲁氏菌野生株104和突变株104ΔBPE043在相同的起始浓度下培养,观察它们生长变化的趋势;用野生株和突变株分别感染小鼠,构建小鼠体内感染模型,测定小鼠脾重并计算脾脏细菌载量;利用免疫共沉淀技术筛选BPE043蛋白的宿主互作蛋白。结果 成功构建了布鲁氏菌BPE043基因缺失株。与野生株相比,突变株104ΔBPE043在体外培养的生长趋势和野生株基本相同;小鼠感染实验显示,在感染1周后,两组小鼠脾均肿大,但突变株104ΔBPE043感染组小鼠脾重低于野生株104感染组小鼠脾重;在感染后两周,两组小鼠脾肿大现象开始减轻。在细菌载量方面,在感染1周后,突变株104ΔBPE043感染小鼠的脾脏细菌载量低于野生株104感染小鼠;在感染后2周,突变株感染组的脾细菌载量下降趋势更明显。免疫共沉淀实验显示BPE043蛋白与鼠源小分子GTP结合蛋白Rab4和Rab11存在相互作用。结论 布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043是布鲁氏菌重要的毒力因子。本研究为进一步探索BPE043基因在布鲁氏菌感染和胞内生存中的作用奠定了基础。     

肠炎沙门菌rfbG基因缺失株的构建及其生物学特性研究

目的 探究rfbG基因对肠炎沙门菌毒力的影响,评价肠炎沙门菌缺失rfbG基因后作为减毒活疫苗的潜力。方法 利用自杀质粒介导的同源重组技术,无痕构建肠炎沙门菌Z11ΔrfbG缺失株,并对其生物学特性进行分析。结果 成功构建肠炎沙门菌Z11ΔrfbG缺失株,与野生株相比,缺失株Z11ΔrfbG生化特性没有发生变化,在LB液体培养基中生长速率较慢;缺失株生物被膜形成能力显著弱于野生株,其感染J774A.1细胞后,产生的细胞毒性亦显著低于野生株。此外,缺失株可与吖啶橙溶液发生凝集,但与O₉血清不发生凝集。结论 rfbG基因缺失显著降低了肠炎沙门菌Z11的毒力,且缺失株符合粗糙型菌株的特点,Z11ΔrfbG不仅具有作为沙门菌减毒活疫苗或载体的潜质,也具有作为DIVA疫苗的潜力,为肠炎沙门菌减毒活疫苗的开发研究奠定了基础。     

牛种布鲁氏菌2308强毒株dsbG基因缺失突变株的构建与初步评价

目的 研究dsbG基因对布鲁氏菌2308毒力的影响。方法 以布鲁氏菌2308亲本株为模板,通过同源重组和抗性替代的方法,构建布鲁氏菌dsbG基因缺失株(2308ΔdsbG)。将毒力株2308、疫苗株RB51、2308ΔdsbG缺失株在相同起始浓度下恒温振荡培养,观察其生长变化趋势;将各菌株按200:1的感染复数侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8),比较其在胞内的生存能力和粘附侵袭力。结果 成功构建并获得了布鲁氏菌dsbG缺失株,且10代内未发现回复现象,遗传性较稳定。2308ΔdsbG缺失株与2308亲本株相比在体外具有相似的生长趋势,但其对宿主细胞的粘附侵袭和胞内的繁殖能力显著低于亲本株。结论 dsbG基因在布鲁氏菌的致病能力中发挥重要作用,dsbG基因的缺失显著降低了牛种布鲁氏菌2308的粘附侵袭和胞内生存能力。     

肠炎沙门菌sifA基因缺失株的无痕构建及其在巨噬细胞内的增殖特性研究

目的 本研究旨在探究sifA基因对肠炎沙门菌胞内寄生和增殖的影响,以探索肠炎沙门菌的致病机理。方法 根据同源重组原理,无痕构建肠炎沙门菌C50041的sifA基因缺失株,通过蓝白斑、抗生素耐药性、PCR和基因测序方法对基因缺失株进行鉴定,并从生物学特性、胞内沙门菌增殖、sifA基因在胞内外菌中表达等方面,分析sifA基因对肠炎沙门菌的影响。结果 成功构建肠炎沙门菌C50041ΔsifA,蓝白斑、抗生素耐药性、PCR和基因测序方法证明该菌株是正确的。其生长速度和生化特性没有发生改变。ΔsifA株感染巨噬细胞后,其胞内沙门菌量显著少于其野生株。sifA基因在spiC基因缺失株中表达量增加。结论 肠炎沙门菌C50041ΔsifA被成功构建,其在巨噬细胞内的增殖量显著降低,sifA基因表达可能受spiC基因调控,本研究为深入探究肠炎沙门菌在细胞内增殖及sifA基因的功能奠定基础。     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的　构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65kD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增,目的基因克隆并转化,重组子经酶切和自动测序鉴定,阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kD蛋白。结果 65kD蛋白编码基因约1.6kb,重组子单酶切和双酶切证明目的基因插入载体,3个测序反应覆盖99.1%目的基因;大肠杆菌表达重组65kD蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分支杆菌抗原的途径。     

大肠杆菌cirA基因缺失对耐药性影响

目的 研究大肠菌素受体蛋白CirA在大肠杆菌耐药中的作用。方法 利用λ-Red同源重组技术构建大肠杆菌cirA基因缺失株,通过PCR和基因测序方法对缺失株进行验证。从生长特性、生化特性、抗生素敏感性、生物膜形成能力4个方面分析cirA基因对大肠杆菌的影响。结果 成功构建了大肠杆菌cirA基因缺失株,经PCR和测序鉴定无误。与野生型菌株相比,cirA基因缺失株生长特性和生化特性无明显差异,但其对多种抗生素的敏感性增加,其生物膜形成能力下降近60%。结论 成功构建大肠杆菌cirA基因缺失株,该基因敲除能显著影响细菌的抗生素敏感性。     

迟缓爱德华氏菌新的溶血活化基因功能的研究

目的 探讨新的迟缓爱德华氏菌溶血活化基因（eha）的功能。方法 PCR扩增部分溶血活化基因,制成地高辛探针和26株Et菌进行斑点杂交和Southern blot。结果 新的迟缓爱德华氏菌（Et)溶血活化基因以单拷贝形式存在于一部分Et菌染色体上,且pED102菌的Vero细胞毒和溶血活性作用主要位于胞浆蛋白和胞隙蛋白中。将有溶血活化基因的pED102重组质粒电击入水溶血的Et菌和大肠杆菌（LE392、JM109）,Et菌仍无溶血现象,大肠杆菌有溶血现象。结论 eha基因不是溶血素结构基因,而是溶血活化基因。     

迟缓爱德华菌eha基因对大肠埃希氏菌溶血基因clyA转录的调控

目的研究迟缓爱德华菌溶血活化基因eha是否能影响大肠埃希氏菌DH5α溶血素基因clyA的转录。方法将重组eha表达质粒pED101转入DH5α中,以载体质粒pACYC184为对照,观察其溶血情况。并用RT-PCR分别检测受体菌DH5α,含pED101的DH5α菌以及含载体的DH5α菌中clyA基因的转录情况。结果eha基因表达质粒的转入,可以使DH5α出现clyA基因阳性条带,且和载体无关。结论迟缓爱德华菌eha基因能正性调控DH5αclyA基因的转录,从而使其表现为溶血。     

迟缓爱德华菌T3SS转位因子EseC促炎反应

目的 Ⅲ型分泌系统(T3SS)是迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,简称Et)一种重要的毒力因子, EseC是T3SS一个转位因子。通过缺失eseC基因,探索Et菌T3SS与该菌感染细胞和组织后,诱导宿主产生炎症反应的关系。方法 构建Et.CD菌eseC基因缺失株及其互补株;用菌落计数法比较两菌株在RAW264.7巨噬细胞胞内存活数目;用CCK-8法比较两菌株感染巨噬细胞后的细胞存活率;利用流式比较野生株和缺失株诱发巨噬细胞的细胞坏死。分别将野生株和缺失株注射小鼠腹腔,用菌落计数法比较两菌株在肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中细菌CFU/mL,以及通过观察这些器官的大小和HE染色切片组织,比较两菌株对这些小鼠组织的炎症反应;用ELISA比较这些小鼠血清促炎性细胞因子IL-1β 和 TNF-α的浓度;用RT-PCR,比较野生株和缺失株效应蛋白基因转录水平。结果 eseC基因缺失后,Et感染巨噬细胞后,胞内细菌数目和细胞存活率均明显降低, 说明野生株感染细胞后,可通过其T3SS引起更多细胞的死亡,释放出更多细菌成份;野生株可通过其T3SS诱导更多巨噬细胞发生坏死,伴有大量促炎症因子的释放;T3SS有助于野生株在肝、肺、脾和肾中组织中的大量增殖;野生株感染小鼠后,和eseC基因缺失株相比,它们的肝脏,脾脏和肺脏外观明显肿大,肝、肺、脾和肾组织中有明显的急性炎症反应,野生株诱发产生的促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β浓度明显高于缺失株;RT-PCR结果显示,eseC基因的缺失使得Et菌的T3SS效应蛋白的eseJ和eseE基因转录水平明显下降。结论 eseC基因可以通过T3SS影响Et在组织和细胞的致炎作用。     

日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的分离与鉴定

目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和HSP60基因序列,构建了系统进化树。结果按形态特征和API-ID32E鉴定系统分别初步鉴定菌株AnGH080301和AnGH080302为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌。菌株AnGH080301的16SrRNA基因部分序列(登录号FJ646618)与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因(登录号AB050832)同源性最高,达99.7%;菌株AnGH080302的HSP60基因部分序列(登录号FJ646619)与创伤弧菌HSP60基因(登录号BA000037)的同源性最高,达99.8%。结论综合菌株的生理生化特性和分子生物学鉴定结果,可将菌株AnGH080301和AnGH080302分别鉴定为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌,迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌均为人兽共患病病原,其混合感染日本鳗鲡致病的报道尚属首次。     

迟缓爱德华菌溶血活化蛋白EHA的原核表达及生物学活性

目的研究迟缓爱德华菌(Et)溶血活化基因(eha)原核表达蛋白EHA的生物学特性。方法构建重组载体pET28a+-eha,转入大肠埃希菌BL21,得到克隆子pEHA1。克隆子pEHA1超声破碎后离心,上清用SDS-PAGE电泳分析。在不同条件下,IPTG诱导pEHA1菌表达EHA蛋白,该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,检测其溶血活性及Vero细胞毒性。结果测序结果表明,pET28a+-eha重组质粒的eha序列完全正确。SDS-PAGE电泳显示表达出一条17kDa左右的条带。在30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L的情况下,克隆子pEHA1被诱导6h产生的蛋白量最多。纯化的EHA蛋白无溶血活性及Vero细胞毒性。结论eha基因不是溶血素结构基因,可能是一个调控基因。     

欧洲鳗迟钝爱德华氏菌的分离鉴定

目的对欧洲鳗(Anguilla anguilla) 迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）菌株ET81126进行分离鉴定。方法采用形态特征观察、人工感染试验、API 20E细菌鉴定系统、16SrDNA测序以及属特异性PCR技术对菌株ET81126进行分析。结果人工感染试验表明菌株ET81126为致病菌,对欧洲鳗的半数致死量为4.55×104 cfu/g。按形态特征和API 20E细菌鉴定系统初步鉴定菌株ET81126为爱德华氏菌。通过16SrDNA测序,在GenBank上经同源性序列比对与迟钝爱德华氏菌（登录号EF467289）自然聚为一类,同源率达99％。属特异性PCR扩增图谱显示迟钝爱德华氏菌非典型菌株特有的230bp条带。结论综合生化指标和分子生物学鉴定结果,可确定菌株ET81126为欧洲鳗迟钝爱德华氏菌。