多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究

摘要：目的 利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法 根据布鲁氏菌特异性基因Bcsp31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌（汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌）验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果 应用多重Taqman荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL（13-24fg /μL）,是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。     

人感染布鲁氏菌检测方法的研究进展

布鲁氏菌病是遍布全球170多个国家和地区的人兽共患传染病。人感染布鲁氏菌后临床表现多样,其诊断方法备受关注。近年来,免疫磁珠分离、飞行时间质谱鉴定以及宏基因组测序等新技术应用于对布鲁氏菌的检测。本文将对目前国内外对布鲁氏菌分离培养、生化鉴定、快速检测方法的研究进展进行阐述并比较其优缺点,为布鲁氏菌的实验室检测提供参考。     

149株布鲁氏菌病原快速诊断方法的评价

目的 评价细菌培养快速准确诊断布鲁氏菌的方法。方法 采用细菌生长曲线、革兰染色、石碳酸复红单染、尿素、氧化酶、触酶等快速实验方法分离的149株布鲁氏菌与疾病控制中心(CDC)标准试管凝集法(STA)结果进行比较,对实验室诊断方法进行评价。结果 分离并确诊的149株布鲁氏菌中,有2株的STA结果为阴性。结论 实验室快速诊断布鲁氏菌的方法准确性高、易操作、生物安全性高,不易漏诊。     

一种直接检测结核病痰标本的PCR技术的建立与评价

目的建立并评价聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)在结核病痰标本检测中的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合体IS6110序列设计引物INS1和INS2,并建立PCR反应体系和反应条件。运用PCR方法分别检测标准菌株、结核分枝杆菌PCR检测标准品和拟诊结核病患者痰标本,采用痰涂片和细菌培养为对照。结果比较的统计学分析采用卡方检验。结果PCR方法对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、卡介苗标准株的最小检出浓度分别达到102,103,103个细菌/毫升,能够特异地检出结核分枝杆菌复合体。在PCR检测的574例拟诊病例中,PCR检测阳性病例241例,42%;痰涂片和细菌培养的阳性率分别为19.69%和26.31%,PCR检测阳性率高于传统细菌学检验方法,经χ2检验,差异具有显著统计学意义(χ2=103.67,P<0.01)。以痰培养结果为标准,计算PCR检测方法的敏感度为67.53%。结论PCR检测方法与传统的细菌学检测方法相比可以提高阳性标本检出率,而且具有快速、特异、简便的特点,有望成为结核病大规模筛查和临床快速检测方法。     

布鲁氏菌病的鉴别诊断

对布鲁氏菌病的鉴别诊断除了在临床上需要与临床表现相似的疾病鉴别外，主要应考虑人工免疫与自然感染的鉴别诊断。     

MALDI-TOF-MS鉴定布鲁氏菌方法建立和评价

目的 为了快速、准确、便捷的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究拟建立鉴定布鲁氏菌属的MALDI-TOF-MS方法,利用现场分离菌株对该方法进行特异性和敏感性评价。方法 收集布鲁氏菌标准菌株和地方流行株,应用MALDI-TOF-MS采集图谱,获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,建立布鲁氏菌鉴定数据库。并用39株布鲁氏菌菌株,对建立的数据库进行验证。结果 经数据库鉴定,39株布鲁氏菌菌株与数据库中布鲁氏菌的匹配分数全部大于2.300,均报告为布鲁氏菌,表明鉴定结果的可信度很高。 聚类分型结果表明,在蛋白质水平,MALDI-TOF-MS将测试的布鲁氏菌分成3大类。结论 MALDI-TOF-MS对布鲁氏菌进行鉴定,具有快速、准确、灵敏等优点,可以实现对布鲁氏菌属的准确鉴定,对布鲁氏菌病的临床诊断具有较高的使用价值。     

PCR快速检测临床标本中结核杆菌的研究

本文用PCR(聚合酶链反应)技术检测238份临床标本中结核杆菌,并与培养及ELISA法进行对比观察。结果:用PCR扩增出123bp区带者142份(59.7％);培养出结核杆菌者55份(23.2％)。139份体腔液及尿标本还同时检测了抗PPD抗体,其中50份标本阳性(36％)。PCR检出率明显高于培养及ELISA(P<0.005)方法简便,快速,是一种检测结核杆菌的实用技术。     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

多重PCR快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的研究与应用

目的利用多重PCR方法建立一种同时快速检测鉴别牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的方法。方法根据牛布鲁氏菌具有种特异性的BCSP-31K基因和牛分枝杆菌23SrRNA，设计并合成了两对分别扩增牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的特异性引物，建立了多重PCR同时快速检测鉴别以上两种病原体的方法。其扩增片段大小牛布鲁氏菌为311bp、牛分枝杆菌为838bp。对所建立的多重PCR方法进行特异性试验和敏感性试验。并应用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该多重PCR方法对所有供试的牛布鲁氏菌都能扩增出311bp，结核分枝杆菌都能扩增出838bp目的片段，对其它参试牛的菌株则无311bp和838bp条带，该多重PCR方法对牛布鲁氏菌和牛分枝杆菌的DNA最低检出量为10pg。305份临床样品中10份牛奶样品为牛布鲁氏菌阳性，41份包括36份PPD阳性鼻粘液样品、3份PPD可疑鼻粘液样品和2份PPD阳性牛奶样品为牛分枝杆菌阳性，其余样品均为阴性。     

猪伪狂犬病病毒与猪圆环病毒2型双重PCR检测方法的建立及初步应用

目的 为建立一种能同时鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染的诊断方法。方法与结果 根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒和圆环病毒2型的基因序列,分别设计一对特异性引物,扩增长度分别为612 bp和238 bp。将PCR产物进行测序,与PRV“Yangsan”株和PCV2“JX0301”株的同源性分别为98.6%和99.2%。通过反应条件的优化,建立同时检测PRV和PCV2的双重PCR方法。利用该方法对临床采集的78份疑似病料进行检测,其中59份为PCV2阳性,17份PRV阳性,其中11份为PRV和PCV2共感染。结论 建立的双重PCR检测方法可以用于PRV和PCV2的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

布鲁氏菌疫苗株S2全基因组测序及牛羊布鲁氏菌比较基因组学研究

目的 为了了解布鲁氏菌S2疫苗株全基因组结构及分子生物学功能。方法 对布鲁氏菌疫苗株S2进行全基因组测序,并与GenBank公布的6株牛羊布鲁氏菌进行比较基因组学研究。结果与结论 通过全基因组测序发现S2基因组大小为3 331 982 bp,预测基因有3 243个,GC含量为57.23 %。S2预测基因中大多数基因功能主要与糖代谢﹑氨基酸代谢﹑氨基酸转运和膜转运有关。通过比较基因组学研究发现S2有20个特有基因。另外S2与GenBank公布的S2序列进行比对发现有19个差异基因。     

布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

目的 建立可对布鲁氏菌准确定量的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)方法.方法 使用以布鲁氏菌bscp 31基因为靶标的引物和探针,摸索最佳的引物和探针工作浓度,确定反应体系和扩增条件,评价所建立方法的灵敏性、特异性及对疫情相关血液标本的检测效果.结果 ddPCR反应体系中最佳引物和探...     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方-法的建立

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方-法。方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行 Realtime-PCR扩增,评价该方-法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方-法的敏感性。结果 本方-法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10² copies/μL和10³ copies/μL。该方-法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方-法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。     

Simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus and Brucella melitensis by combinatorial PCR

ObjectiveTo evaluate simultaneous detection and differentiates of Brucella abortus (B. abortus) and Brucella melitensis (B. melitensis) through the combinatorial PCR method.MethodsThis study was designed using three primers that could simultaneously identify and differentiate two major species of pathogenic Brucella in humans and animals. Identification and differentiation of each species using the size of the PCR product were determined. To determine the specificity of the method, bacteria close to the genus Brucella were used. Finally, to confirm PCR products, In addition to the products sequence, RFLP was performed on PCR products using restriction enzymes.ResultsThe method of optimized combinatorial PCR in this study could simultaneously detect and differentiate B. abortus and B. melitensis with high specificity and sensitivity in clinical samples. Differentiation of species is based on the resulting bands; therefore, the band 494 bp for B. abortus and 733 bp for B. melitensis were obtained. RFLP and sequencing results confirmed PCR results.ConclusionsThe results of this study shows that without routine diagnostic methods such as culture and serology tests, using the molecular method of combinatorial PCR, important species of Brucella can be simultaneously identified and differentiated in clinical samples.     

布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。     

嗜血杆菌属CODEHOP PCR检测方法的建立及在树鼩检测中的应用

目的建立树鼩中嗜血杆菌的CODEHOP PCR快速检测方法,为树鼩微生物质量控制提供参考。方法应用CODEHOP在线简并引物设计工具,比对NCBI中6株嗜血杆菌的外膜蛋白序列设计简并引物。通过4株嗜血杆菌标准菌株和24株它属菌株进行特异性和敏感性评价,将建立CODEHOP PCR检测方法,应用于树鼩嗜血杆菌的检测。结果简并引物HF1/HR8和HF3/HR3扩增标准菌株副鸡嗜血杆菌(ATCC 29545)、溶血嗜血杆菌(ATCC 33390)、流感嗜血杆菌(ATCC 33391)、副流感嗜血杆菌(ATCC 33392)的目的片段分别为506 bp~535 bp和344 bp~390 bp,经测序和NCBI Blast比对,结果准确。两对引物组合,能够有效的区分嗜血杆菌属菌株与它属菌株,检测限最低可达2.1 pg/μL。在受试的野生树鼩呼吸道样本中嗜血杆菌阳性率为33.3%(20/60)。结论所建立的方法具有较好的特异性和敏感性,操作简便,能够用于动物样品的嗜血杆菌检测。