耐药嗜水气单胞菌毒力与六类抗菌药物耐药元件基因研究

目的 了解嗜水气单胞菌毒力基因与耐药基因的分布情况,为嗜水气单胞菌感染的治疗提供参考依据。方法 分离自2014年1月至2017年10月本院内科住院病人的10株嗜水气单胞菌;采用PCR法,对10株嗜水气单胞菌检测3种毒力基因与54种耐药基因,并对检测结果作样本聚类分析。结果 10株耐药嗜水气单胞菌3种重要的毒力基因检测结果,hlyA基因检出率为100.00%,aerA基因检出率为20.00%, rtxA基因无检出。10株耐药嗜水气单胞菌6种β-内酰胺酶基因, blaAQU与blaMOX基因表达AmpC型β-内酰胺酶,10株中有5株同时检出blaAQU与blaMOX基因,1株仅检出blaMOX基因, 6株AmpC酶三维试验均呈阳性。对10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌3种毒力基因与6类抗菌药物54种耐药元件基因检测结果作UPGMA法样本聚类分析, 10株耐药嗜水气单胞菌和1株敏感嗜水气单胞菌可分为A与B二个群。结论 10株耐药嗜水气单胞菌共检出β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类等5类抗菌药物17种获得性耐药基因。7种可移动遗传元件标记基因,有5株检出1~3种可移动遗传元件标记基因。10株耐药嗜水气单胞菌3种毒力基因与54种耐药元件基因同步检测显示,每株至少检出1种毒力基因和2种耐药基因,嗜水气单胞菌对抗菌药物的耐药率上升必须严密监测。     

福建省鼠伤寒沙门菌β-内酰胺耐药表型及ESBLs耐药基因分析

目的 调查福建省鼠伤寒沙门菌β-内酰胺耐药状况及其与ESBLs耐药基因之间的关系。方法 利用微量肉汤稀释法测定83 株鼠伤寒沙门菌对β-内酰胺类及ESBLs菌株其他18种药物的最小抑菌浓度(MIC)并计算耐药率;同时用PCR方法检测菌株ESBLs相关基因bla_TEM、bla_CTX-M、bla_OXA及bla_SHV的携带情况,并对bla_CTX-M阳性基因进行测序分型。结果 两类不同来源菌株均对氨苄西林和氨苄西林-舒巴坦的耐药率较高,腹泻患者来源株对第三、四代头孢有不同程度的耐药。腹泻患者来源株中检出10株ESBLs阳性菌株,检出率16.39%(10/61),该类菌株全部为多重耐药。腹泻患者来源株bla_TEM、bla_CTX-M和bla_OXA基因检出率分别为55.74%(34/61)、16.39%(10/61)和19.67%(12/61);健康人员来源株bla_TEM和bla_OXA基因检出率分别为22.73%(5/22)和18.18%(4/22),未检出bla_CTX-M基因,两类菌株均未检出bla_SHV基因。10株bla_CTX-M基因阳性株测序表明bla_CTX-M-14基因型4株、bla_CTX-M-15和bla_CTX-M-55基因型各3株。相关性分析表明bla_TEM基因与氨苄西林耐药表型具有较好的一致性(P<0.001, Ka=0.546),bla_CTX-M基因与头孢噻肟和头孢吡肟耐药表型高度一致(P<0.001, Ka=1.000),与头孢他定(P<0.001, Ka=0.626)和氨曲南(P<0.001, Ka=0.668)一致性较好。结论 福建省鼠伤寒沙门菌对头孢菌素及ESBLs耐药主要由bla_CTX-M基因介导且ESBLs菌株多重耐药现象严重。     

重庆地区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物耐药的相关基因特征分析

目的 分析重庆地区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类(FQs)药物耐药的相关基因特征,以及与结核分枝杆菌基因型的相关性。 方法 收集2015年1月至2017年6月重庆市39个区(县)967例耐多药结核病(MDR-TB)可疑患者的所有耐多药(MDR)结核分枝杆菌临床分离株229株,通过微孔板Alamar blue显色法检测4种FQs药物[氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)、加替沙星(Gfx)]的耐药性,用PCR测序方法对FQs药物耐药相关基因gyrA、gyrB进行分析,并采用实时荧光定量熔解曲线方法进行北京基因型鉴定。 结果 在229株MDR菌株中,94株(41.0%,94/229)对任一FQs药物耐药。其中,Ofx耐药率最高(41.0%,94/229);Lfx、Mfx耐药率居中,分别为31.4%(72/229)、30.6%(70/229);Gfx耐药率最低(20.1%,46/229)。94株对FQs耐药菌株中,81株(86.2%,81/94)发生gyrA基因突变,第94位密码子突变最常见(60.6%,57/94);10株(10.6%,10/94)发生gyrB基因突变。7株gyrA基因双位点突变均显示为高水平耐药;9株gyrA与gyrB联合突变中,2株为高水平耐药。重庆地区对FQs耐药菌株中北京基因型80株(85.1%,80/94),其中,现代北京基因型占60.0%(48/80)。 结论 重庆地区MDR结核分枝杆菌 对FQs耐药的菌株以现代北京基因型为主,其耐药相关基因突变主要发生于gyrA基因。     

成都市人源沙门菌基因组特征分析

目的 基于全基因组测序技术,探究成都市人源沙门菌的基因组特征, 为监测与预防沙门菌感染提供资料。方法 收集35株成都市人源沙门菌(分离自腹泻患者粪便)进行全基因组测序。根据测序数据,进行血清型预测、耐药基因及可移动遗传元件预测、毒力因子注释及分布分析。结果 35株沙门菌分离株经全基因组测序,共预测到5种血清型,包括15株I 4,[5],12:i:-沙门菌(13株为ST34、2株为新ST型)、12株鼠伤寒沙门菌(ST19)、5株肠炎沙门菌(ST11)、2株德比沙门菌(ST40)与1株火鸡沙门菌(ST463)。35株沙门菌分离株共预测到10类42种不同的耐药基因,其中氨基糖苷类aac(6')-Iaa携带率为100%(35/35)。I 4,[5],12:i:-沙门菌的耐药基因、质粒及插入序列数目及种类多于其他血清型菌株。I 4,[5],12:i:-、鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌的毒力因子数目大于其他血清型菌株。部分鼠伤寒沙门菌有更高的毒力质粒、质粒编码菌毛和血清抗性毒力因子分布。结论 成都市人源沙门菌不同血清型菌株之间耐药基因、可移动遗传元件、毒力因子分布差异明显,值得在转录组、蛋白组进一步探究其耐药与毒力机制。     

气单胞属菌粪便分离株分子鉴定与耐药元件检测

目的 调查一组14株气单胞属菌的菌种分子鉴定情况,以及β-内酰胺酶类、氨基糖苷类耐药的遗传学背景。方法 14株气单胞属菌均分离自2012年1月至12月宁波市第一医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本,再作通用引物16SrDNA测序比对判定菌种,然后用聚合酶链反应(PCR)的方法分析23种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记。结果 本组14株菌经16SrDNA测序比对,10株为嗜水气单胞菌, 水簇箱气单胞菌、温和气单胞菌、肠棕气单胞菌、斑点气单胞菌各1株。14株气单胞菌共检出5种β-内酰胺酶基因、4种氨基糖苷类修饰酶基因和3种可移动遗传元件遗传标记基因。其中4号株(嗜水气单胞菌)AQU基因是新的基因亚型,命名为AQU-2, 11号株(水簇箱气单胞菌)AQU基因也是新的基因亚型,命名为AQU-3。结论 气单胞菌属的菌种鉴定应该以分子鉴定法为准。本组14株气单胞属菌耐药严重,已呈多重耐药。     

安徽地区腹泻患者感染肠致病大肠埃希氏菌的耐药特征

目的 对安徽地区腹泻患者粪便标本中肠致病大肠埃希氏菌(EPEC)进行检测,了解本地区EPEC的检出情况、耐药特征及耐药机制。方法 使用多重实时荧光定量PCR法对分离疑似菌株进行鉴定,微量肉汤稀释法对EPEC进行药物敏感性检测,使用双纸片扩散法检测ESBLs,采用多重PCR法检测ESBLs基因型;根据药敏结果,进行基因扩增和测序分析检测喹诺酮类耐药基因。结果 2013-2017年,本地区10家哨点医院共检出不典型EPEC 85株,典型EPEC和艾伯特埃希氏菌各1株;87株菌对红霉素、氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、萘啶酸和头孢噻肟耐药率分别为:100%、51.7%、40.2%、34.5%和20.7%,对亚胺培南、头孢他定、头孢西丁和环丙沙星耐药率分别为:0、3.4%、5.7%和6.9%。87株菌中检测出产ESBLs 18株,TEM阳性14株、CTX-M group 1阳性6株、CTX-M group 9阳性7株。喹诺酮类耐药机制有:药物靶位及编码基因gyrA和parC突变;质粒介导的qnrA、qnrB、qnrS和aac(6′)-Ib耐药基因阳性;药物外排泵qepA和oqxAB基因阳性。结论 EPEC是本地区重要的肠道致病菌之一,对青霉素、红霉素和萘啶酸耐药率较高,对亚胺培南、环丙沙星和阿奇霉素耐药率较低;ESBLs检出率较高,基因型以TEM、CTX-M group 1和CTX-M group 9为主,对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA、parC突变和Qnr蛋白家族相关,少数与QepA 和OqxAB外排泵相关。     

肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染状况及耐药性分析

目的 了解江苏某肉鸡屠宰加工厂不同环节弯曲菌的污染状况及耐药现状。方法 采集屠宰前肉鸡泄殖腔、不同环节鸡酮体以及环境等样品,运用无血弯曲杆菌选择性培养基(modified charcoal-cefoperazone-deoxycholate agar,CCDA)平板法进行分离纯化,PCR鉴定后,采用K-B法测定6大类14种抗生素耐药情况。PCR检测弯曲菌Ⅰ型整合子、四环素耐药基因tet(O)、氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3以及弯曲菌gyrA基因第257位碱基的突变情况。结果 细菌分离结果显示170份样品分离到124株弯曲菌(72.95%)。分离株对链霉素、妥布霉素、卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、红霉素和四环素耐药率为100%,多重耐药现象普遍,多重耐药率高达100%,其优势耐药谱主要为CTX-CRO-cDA-K-NOR-S-AZM-CIP-TE-NA-E-LEV-ENR-TOB。分离株经PCR扩增未检测到Ⅰ型整合子,所有菌株在gyrA喹诺酮类耐药决定区发生了C-257-T点突变,tet(O)基因和aadE-sat4-aphA-3检出率分别为100%和90.23%。结论 江苏某肉鸡屠宰加工生产链中弯曲菌污染及耐药情况比较严重,gyrA基因突变、tet(O)基因及aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇的携带,与弯曲菌对喹诺酮类、四环素类和氨基糖苷类耐药密切相关。     

结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物耐药相关基因突变特征分析

目的 分析宁波地区耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug-resistant tuberculosis, MDR-TB)不同基因型构成及氨基糖苷类药物耐药相关基因突变特征,为本地区耐多药结核病防控提供科学依据。方法 宁波市疾病预防控制中心2014-2016年耐药监测组共收集106例MDR-TB临床分离株,对其进行3种氨基糖苷类药物卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)耐药检测。应用RD105缺失基因检测法鉴定北京基因型及非北京基因型菌株。采用DNA直接测序法对所有MDR-TB菌株氨基糖苷类药物耐药相关基因rrs、tlyA、eis、gidB进行测序分析。结果 106株MDR-TB菌株中,北京基因型83株78.3%(83/106),非北京基因型23株(21.7%,23/106)。耐氨基糖苷类药物的菌株中北京基因型10株12.0%(10/83),非北京基因型0株0.0%(0/23)。10例耐氨基糖苷类药物的耐多药菌株中有4株发生耐药基因突变,突变率为40.0%(4/10),96例对氨基糖苷类药物全敏感的耐多药菌株中有24株发生耐药基因突变,突变率为26.7%(24/96),差异无统计学意义(χ²=1.048, P>0.05)。结论 宁波地区MDR-TB中北京基因型与氨基糖苷类药物耐药相关,目前已知的耐药相关基因突变不能完全解释结核分枝杆菌对氨基糖苷类药物耐药的原因。     

江苏地区金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

目的 研究江苏省不同地区金葡菌的耐药性、耐药基因和分子分型的特征联系。方法 收集2017年全省各市哨点医院金黄色葡萄球菌227株,采用微量肉汤稀释法测定15种抗生素最小抑菌浓度, PCR方法检测7种不同的耐药基因,并用多位点序列分型(multilocus sequence typing MLST)进行分子分型。结果 本研究中金葡菌对青霉素、红霉素、头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、左氧氟沙星、四环素、庆大霉素的耐药率较高,而对替考拉宁、利福平、复方新诺明、达托霉素、利奈唑胺以及呋喃妥因多呈敏感,耐药率均低于10%,且所有菌株均对万古霉素敏感。共计检出117株MRSA,MRSA平均耐药种数和平均耐药基因携带数高于MSSA(P< 0.05)。江苏省苏北地区的菌株耐药种数要高于苏中和苏南地区(P< 0.05),而苏中地区的耐药基因平均携带数高于苏南地区(P< 0.05)。在227株金葡菌中发现了60个ST型,以ST59和ST398分布数量最多,并有29个新ST型。成簇菌株中,CC59的平均耐药种数和MRSA检出率均高于其他克隆群。结论 江苏省内不同地区的金葡菌耐药率和耐药机制存在差异,且以CC59克隆群耐药情况最为严峻。     

1株携带质粒介导喹诺酮耐药基因qnrS1和qepA1的多耐药沙门菌的基因特点分析

目的 分析一株多重耐药沙门菌SM846的遗传背景,研究其对喹诺酮耐药的机制。方法 测定SM846对14种药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)。用三代测序技术对菌株进行全基因组测序,根据耐药数据库注释SM846序列中的耐药基因。使用NCBI的BLAST工具搜索与耐药质粒相似的序列,并进行生物信息学分析。结果 SM846对14种测试抗生素中的12种表现出耐药,包括喹诺酮类抗生素萘啶酸和环丙沙星。SM846包含1条染色体和1条质粒。染色体序列不含可导致耐药的基因和突变,质粒携带13个耐药基因,包括喹诺酮类耐药基因qepA1和qnrS1。qepA1和qnrS1位于质粒内部的可移动原件I类整合子上。13条相似质粒的分析表明中国分离的此型别的质粒耐药性强于美国和加拿大分离的。结论 QnrS1和qepA1基因通过IS6和可移动元件整合到质粒的I类整合子上,说明SM846可能迫于抗生素压力通过获得耐药基因来快速适应环境。中国分离菌株的耐药性强,地区间的耐药情况差异,尤其是与不发达国家之间的差异提示我们应当继续监测各地区的耐药表现型,以制定本地的耐药控制策略。     

新一代微测序基因芯片的设计及其耐药性检测效果的初步研究

目的 设计和评价微测序基因芯片检测结核分枝杆菌(MTB)耐药性的价值。方法 于北京结核病临床数据和样本资源库选取MTB实验室标准菌株(H37Rv)和109株MTB临床分离株,采用绝对浓度法进行表型药物敏感性试验(简称“表型药敏试验”)和基因测序法检测MTB耐药相关基因突变(包括inhA、katG、rpsL、gyrA、rrs、eis、rpoB和embB基因)。以荧光标记探针为基本检测原理设计制备微测序基因芯片,检测109株MTB临床分离株耐药基因突变,分析微测序基因芯片的检测效能。结果 通过表型药敏试验及基因测序检测,明确了109株MTB临床分离株耐药相关基因(inhA、katG、rpsL、gyrA、rrs、eis、rpoB和embB基因)突变位点及突变形式。微测序耐药检测基因芯片初期设计包含了katG、inhA、rpoB、gyrA、embB、rpsL、rrs和eis基因的目前已报道的所有突变位点的全部已知突变形式,共计220条探针,并确认出67条优秀探针。采用包含67条探针的微测序耐药检测基因芯片对109株MTB临床分离株进行检测。结果发现,与测序结果相比,除检测embB基因突变的2条探针外,其余65条探针检测碱基突变形式的符合率均超过95%,其中42条探针检测的符合率达到100.00%。以测序结果为参照标准,基因芯片检测对embB基因、gyrA基因、inhA基因、katG基因、rpoB基因、rpsL基因、eis基因和rrs基因突变检测的敏感度分别为64.21%(61/95)、80.00%(8/10)、95.83%(23/24)、98.55%(68/69)、92.63%(88/95)、93.85%(61/65)、75.00%(3/4)和94.44%(17/18);特异度分别为92.86%(13/14)、100.00%(99/99)、97.65%(83/85)、87.50%(35/40)、85.71%(12/14)、63.64%(28/44)、100.00%(105/105)和98.90%(90/91);Kappa值分别为0.29、0.88、0.92、0.88、0.68、0.60、0.85、0.93。结论 本研究研发设计了一套包含67条探针微测序耐药基因检测芯片,经过初步验证后证明其检测MTB耐药相关基因突变的效能较好,对embB基因的耐药检测探针还需进一步优化,使之更好的满足临床需求。     

MTBDRplus技术快速检测结核分枝杆菌耐多药的临床应用评价

目的 评价线性探针杂交技术(简称MTBDRplus技术)对福州地区耐药结核杆菌的检测效果,并了解该地区耐药结核分枝杆菌的耐药基因特征方法 选取246株临床结核分枝杆菌分离株,以传统罗氏药敏试验为金标准,评价MTBDRplus技术在临床上应用的检测效果,分析耐药基因突变分布频率结果 与传统罗氏药敏试验相比较,MTBDRplus检测利福平(RIF)和异烟肼(INH)耐药性灵敏度分别为91.7%(11/12)和83.3%(15/18),MTBDRplus检测RIF和INH耐药性特异度分别为99.6%(233/234)和95.2%(217/228)。12例rpoB基因存在突变的结核分枝杆菌中,58.3%rpoB基因S531L突变;26例katG和inhA基因存在突变的结核分枝杆菌中,57.7%(15/26)katG基因315突变;存在C15T位点突变的菌株仅9.1%(1/11)为INH耐药菌株结论 MTBDRplus技术是一个敏感、特异的快速诊断耐多药结核病的有效方法,该技术在福州地区具有较好的应用前景。福州市耐药结核分枝杆菌以rpoB S531L和katG S315T突变型为主。建议谨慎判断结核分枝杆菌inhA基因C15T位点突变引起的INH耐药。     

127株结核分枝杆菌基因分型及耐药相关研究

目的 研究山西省长治及周边地区结核分枝杆菌的基因多态性及基因型与耐药的相关性。方法 收集结核分枝杆菌临床分离株,运用MLVA方法进行基因分型,对8种抗结核药物分别采用比例法进行药敏试验,应用 BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果 15个位点中Mtub21、MIRU26和ETRE多态性较高 (HGI>0.6),MIRU40、ETRB、MIRU16、ETRD、MIRU23和ETRC位点多态性较低(HGI＜0.3)。127株结核分枝杆菌共分为11个基因群102种基因型,90 株为独特型,基因群中Ⅰ群所占比例最大(80.31%)。127株菌株对一线和二线抗结核药物的总耐药率分别为47.24%和23.62%。一线药物中链霉素(40.94%)的耐药率最高,乙胺丁醇(6.30%)最低。二线药物中左氧氟沙星(14.17%)的耐药率最高,丙硫异烟胺(3.15%)最低。链霉素的单耐药率最高(11.81%);耐多药率为21.26%(27/127);广泛耐多药率为3.15%。Ⅰ群菌株的耐药率与其它菌株的差别无统计学意义。结论 初步证实山西长治及周边地区的结核分枝杆菌具有明显的多态性,Ⅰ群为主要流行群。结核分枝杆菌对二线药物的敏感性高于一线药物。主要流行菌株Ⅰ群菌株与耐药无明显的相关性。     

陕西省韩城市利什曼原虫SSU rRNA基因系统发育研究

目的 了解陕西省韩城市黑热病区利什曼原虫种类及分子遗传特征。方法 对来自韩城市的利什曼原虫阳性标本,进行SSU rRNA基因序列扩增,扩增产物进行测序,与其它不同种类、不同地区利什曼原虫的SSU rRNA基因序列进行比对,分析突变位点规律,建立系统发育树。结果 有3份标本SSU rRNA基因序列扩增测序成功,其基因序列与杜氏利什曼原虫、夏科氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫的SSU rRNA序列同源性较高,与婴儿利什曼原虫在UQ-II突变区有一个位点的变异,并与新疆荒漠虫株、甘肃省利什曼虫株聚为一类。结论 结合流行病学与SSU rRNA序列分析结果,陕西省韩城市黑热病病原体应为婴儿利什曼原虫。     

Application of next-generation sequencing technology in the diagnosis of drug-resistant tuberculosis

目的 探索新一代高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术在耐药结核病诊断中的应用价值。方法 搜集2016—2017年甘肃省结核病耐药基线调查150株临床分离株,排除非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)菌株2株,进行比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)及结核分枝杆菌耐药相关基因(包括katG、inhA、embB、rpoB、rpsL、rrs、gyrA和gyrB)的NGS技术检测,剔除测序失败的13株,最后纳入分析菌株135株。以比例法药敏试验结果为参考标准评价二代测序在耐药结核病中的检测效能。 结果 以药敏试验结果为参考标准,NGS技术检测异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素、氧氟沙星耐药的敏感度分别为:88.75%(71/80)、85.71%(18/21)、84.72%(61/72)、73.91%(51/69)、68.97%(20/29),特异度分别为100.00%(55/55)、86.84%(99/114)、96.83%(61/63)、 96.97%(64/66)、99.06%(105/106),Kappa值分别为0.87、0.59、0.81、0.71、0.76。异烟肼耐药基因突变主要在katG 315位点上,突变频率为97.18%(69/71);乙胺丁醇耐药基因突变主要在embB 306位点上,突变频率为88.89%(16/18);利福平耐药基因突变主要在耐药决定区,突变频率为93.65%(59/63);链霉素耐药基因突变主要在rpsL 43位点上,突变频率为79.25%(42/53);氧氟沙星耐药基因突变主要在gyrA 94位点上,突变频率为76.19%(16/21)。结论 抗结核药物相关耐药基因NGS利福平、异烟肼、氧氟沙星耐药检测效能较好,能够满足临床结核病诊断需要。乙胺丁醇、链霉素已知耐药位点NGS耐药检测效能一般,需要对其耐药机制进行进一步的研究。