粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用

目的 探讨粪肠球菌心内膜炎抗原EfaA在生物膜形成中的作用。方法 微量滴定板法测定生物膜形成能力,将efaA⁺、efaA^- 粪肠球菌S₁₄、S₁₄-pAT28、S₁₄-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37 ℃培养24 h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部生物膜的OD₅₇₀ 值;MTT法比较S₁₄、S₁₄-pAT28、S₁₄-pAT28-efaA所形成的生物膜的活菌含量OD₄₉₂;共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察比较efaA⁺、efaA^-肠球菌形成的生物膜的平均厚度、最大厚度。结果 efaA⁺ 转化株在各培养时间点微量滴定板法测定的生物膜形成能力OD₅₇₀ 值、MTT法测定的OD₄₉₂活菌含量、CLSM观察的生物膜的平均厚度、最大厚度均大于野生株及空质粒转化株,P<0.05;空质粒转化株与野生株比较无显著性差别,P>0.05。结论 粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

粪肠球菌心内膜抗原efaA基因转化株的构建及其对生物膜形成的影响

目的构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株,探讨efaA基因在肠球菌生物膜形成及感染性心内膜炎致病中的作用。方法PCR扩增粪肠球菌efaA基因,构建pAT28-efaA重组子,经PCR、双酶切及测序鉴定,将重组子转化到eraA野生株S14做为转化株（S14-pAT28-efaA）;同时将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株（S14-pAT28）;IPTG诱导efaA表达,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。微量滴定板法测定生物膜形成能力。将s14、S14-pAT28、S14-pAT28-efaA分别接种到96孔板,37℃培养24h形成生物膜,结晶紫染色,测定孔板底部在595nm的0D值,比较efaA基因转化前后的生物膜形成能力。结果成功构建粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因转化株;转化株的OD595值大于野生株及空质粒转化株,P〈0．05,空质粒转化株的OD595值与野生株比较差异无统计学意义,P〉0．05。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA基因有利于肠球菌生物膜的形成。     

动物源性粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多抗的制备及其对生物被膜形成的影响

目的 研究制备动物源粪肠球菌Ebp菌毛亚单位蛋白多克隆抗体及其可能的免疫学作用。方法 运用生物信息学软件对粪肠球菌菌毛EbpA、EbpB和EbpC蛋白的抗原表位进行预测,发现6个抗原表位,将其构建重组质粒,表达、纯化,免疫新西兰大白兔后获得了6个菌毛亚单位多克隆抗体,再进行抗体特异性和生物膜阻断分析。结果 6个菌毛亚单位重组蛋白与预测的分子量相符,均对新西兰大白兔具有免疫原性,EbpA1、EbpA2、EbpA3、EbpB1、EbpC1和EbpC2亚单位蛋白多克隆抗体效价经双向免疫琼脂扩散实验检测分别达到1∶16、1∶8、1∶32、1∶32、1∶64和1∶64。经WB检测和生物膜阻断试验,6个多克隆抗体均具有抗原特异性和野生菌株生物膜阻断作用,而且以EbpA1、EbpC1和EbpA3的生物膜阻断作用最强。结论 粪肠球菌EbpA1、EbpC1和 EbpA3亚单位蛋白可能为粪肠球菌免疫预防和治疗奠定基础。     

耐万古霉素肠球菌临床菌株毒力基因携带情况及差异

目的检测不同种类耐万古霉素肠球菌(VRE)毒力基因携带情况及其差异,为研究VRE致病机制提供基础。方法采用微量稀释法检测浙江地区490株屎肠球菌和862株粪肠球菌临床分离菌株对万古霉素的耐药性。采用PCR检测VRE菌株ace、asa1、cylA、efaA、esp、gelE、hyl七种毒力基因。结果 10%(49/490)屎肠球菌株和0.8%(7/862)粪肠球菌株为VRE。万古霉素耐药屎肠球菌株中,5株未检出任何毒力基因,其余44株仅可检出asa1、esp、gelE和hyl基因,其中esp基因(73.5%,36/49)和hyl基因(53.1%,26/49)为优势基因,以单或双基因为主要携带模式。万古霉素耐药粪肠球菌株中可检出除hyl基因以外其他6种毒力基因,且每株菌均同时携带3~6种致病基因。结论本地区VRE以屎肠球菌为主,耐万古霉素屎肠球菌和粪肠球菌毒力基因携带率、携带种类和模式均有明显差异。     

利奈唑胺体外诱导粪肠球菌耐药株23S rRNA V区基因突变位点分析

目的阐明体外诱导利奈唑胺耐药粪肠球菌的核糖体23SrRNA V区基因位点变异特征。方法收集1株血流感染的粪肠球菌和1株粪肠球菌质控菌ATCC29212（编号分别为F3和F4菌株,均为利奈唑胺敏感株）,通过体外浓度倍增法诱导利奈唑胺耐药;挑取单克隆,经E-test条测定MIC值,获得各菌株的耐药浓度梯度;提取耐药菌株基因组DNA,PCR扩增23SrRNA V区基因,扩增产物经测序后与野生株比较,获得V区的突变位点。结果经体外多步法诱导利奈唑胺耐药的不同MIC值粪肠球菌共13株。PCR测序分析2株母株均无变异位点,23SrRNA V区的突变位点主要是G2576U,此外还有T2504A、G2505A、C2610A、C2424U。结论体外多步法可诱导粪肠球菌利奈唑胺耐药,耐药机制与23SrRNA V区位点突变密切相关,突变位点随着MIC值的增高而增多。     

肠球菌表面蛋白基因与生物膜形成关系的探讨

目的探讨肠球菌表面蛋白（esp）基因与生物膜形成之间的关系，以利临床采取预防措施和选药治疗。方法应用PCR方法检测145株临床分离肠球菌中esp的携带率．并用斑点杂交确证。用96孔聚苯乙烯板进行生物膜形成试验。结果96株粪肠球菌和49株屎肠球菌中esp的检出率分别为34．4％和36．7％；生物膜形成率分别为93．8％和91．8％；esp阳性的肠球菌生物膜形成率为100％。结论肠球菌普遍具有形成生物膜的能力，但生物膜的形成并不仅限于携带esp的肠球菌。     

结核分枝杆菌感染对BALB/c小鼠B细胞发育分化的影响

目的 探讨结核分枝杆菌感染对小鼠B淋巴细胞分化发育的影响。方法 建立Mtb感染BALB/c小鼠模型,在感染早期(4周)及晚期(8周)分别取小鼠骨髓细胞及脾脏细胞,或经培养后,荧光抗体染色,用流式细胞术对感染早期及晚期小鼠的B细胞表型进行分析,设生理盐水处理的小鼠作为对照。结果 Mtb感染组与对照组比较,pro-B细胞(CD45R⁺CD43⁺)(4周:t=2.886,P<0.05)、未成熟B细胞(CD45R⁺IgM⁺IgD^-)(4周:t=4.760,P<0.05)减少,骨髓成熟B细胞(CD45R⁺IgM^+/-IgD⁺)(4周:t=-3.485,P<0.05;8周:t=-2.594,P<0.05)与脾脏成熟B细胞(CD45R⁺IgMlowIgDhi)(4周:t=-2.275,P<0.05;8周:t=-2.97,P<0.05)增多;小鼠脾脏B细胞活化分子CD69表达升高(4周:t=-2.271,P<0.05;8周:t=-2.052,P<0.05);小鼠脾脏记忆性B细胞 (CD45R⁺CD27⁺IgD^+/-)升高(4周:t=-4.203,P<0.05;8周:t=-5.280,P<0.05)。结论 Mtb感染能影响B细胞的分化发育,促使B细胞向成熟细胞分化,并能促使B细胞活化,使机体更有利于抗结核的感染。     

山东省潍坊市农村人群海氏肠球菌恶唑烷酮类耐药基因流行情况研究

目的 了解农村地区无症状人群中氟苯尼考耐药海氏肠球菌的耐药性和恶唑烷酮类耐药基因cfr、optrA、poxtA的携带情况。方法 对来自山东省潍坊市的12个村620份粪便样品,用氟苯尼考 (10 mg/L) 肠球菌培养基进行细菌分离,利用飞行时间质谱仪鉴定菌种,采用琼脂稀释法对15种抗生素进行药敏试验,PCR鉴定耐药基因,对poxtA阳性的海氏肠球菌进行脉冲场凝胶电泳 (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 分析。结果 共分离获得29株海氏肠球菌。所有海氏肠球菌均对四环素、克林霉素耐药,对氯霉素表现为高耐药率,但未检出氨苄青霉素、万古霉素、阿莫西林/克拉维酸耐药菌株,利奈唑胺耐药率为10.3% (3/29)。未检测到携带cfr的海氏肠球菌,optrA和poxtA检出率分别是86.2% (25/29) 和17.2% (5/29)。聚类分析显示,5株poxtA阳性海氏肠球菌属于5种PFGE带型。结论 山东潍坊市农村地区健康人群中,海氏肠球菌耐药情况严重,optrA和poxtA的携带率很高,呈现高度多态性,提示可能存在公共卫生隐患,应加强相关监测。     

导尿管相关粪肠球菌生物被膜形成的分子机制探讨

目的 探讨经筛选分离的导尿管生物被膜粪肠球菌的明胶酶编码基因gelE、菌毛操纵子ebpA,毒力调控器fsr系统的fsrB基因与粪肠球菌生物被膜形成的相关性,为深入研究粪肠球菌生物被膜形成的分子机制奠定基础.方法 运用刚果红培养基筛选导尿管生物被膜阳性菌并对其进行生物被膜半定量检测;通过细菌生理生化反应进行鉴定;采用PCR技术检测分离得到的生物被膜粪肠球菌及其相应的浮游菌的gelE、ebpA和fsrB基因.结果 从导尿管中分离鉴定筛选到21株生物被膜粪肠球菌和21株浮游状态粪肠球菌.21株粪肠球菌生物被膜菌组gelE、ebpA和fsrB基因检出的阳性率分别是9.52％(2/21)、95.24％ (20/21)、9.52％(2/21);其相应的21株浮游菌组粪肠球菌检出的阳性率分别是85.71％(18/21)、9.52％ (2/21)、90.48％(19/21),P均＜0.05.结论 gelE、ebpA和fsrB基因与粪肠球菌生物被膜的形成密切相关.ebpA基因能够促进粪肠球菌生物被膜的形成,gelE和fsrB基因会抑制粪肠球菌生物被膜的形成.     

重症肺结核患者T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子的表达及其预后意义

目的 探讨重症肺结核患者T淋巴细胞亚群、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM-1,TIM-3)的表达及其预后意义。方法 回顾性分析2019年1月至2021年6月在我院收治的1 056例重症肺结核患者为研究对象,并将其定义为重症肺结核组,另选同期在我院进行治疗的1 000名轻症肺结核患者作为轻症肺结核组。比较两组患者TIM-1、TIM-3以及外周血T细胞亚群(CD4⁺、CD8⁺)水平;检测并比较外周血单个核细胞中TIM-1、TIM-3的mRNA水平;分析重症肺结核患者外周血T细胞亚群、TIM-1、TIM-3与患者预后的关系。结果 重症肺结核组CD8⁺、TIM-1和TIM-3水平均高于轻症肺结核组,CD4⁺水平低于轻症肺结核组(均P<0.001)。重症肺结核组TIM-1 mRNA和TIM-3 mRNA水平均高于轻症肺结核组(均P<0.001)。死亡组CD8⁺、TIM-1和TIM-3水平均高于存活组,CD4⁺水平低于存活组(均P<0.001)。相关性分析发现:存活组患者TIM-1、TIM-3与CD4⁺均呈负相关(r值分别为-0.114和-0.211,P<0.05),而与CD8⁺均呈正相关(r值分别为0.571和0.680,P<0.05)。结论 重症肺结核患者免疫功能紊乱可能与其体内外周血T细胞亚群水平异常以及TIM-1、TIM-3 表达水平升高有关。     

滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物感染贝氏柯克斯体的调查

目的调查滇西鼠疫疫源地野外鼠形动物贝氏柯克斯体感染情况。方法2015年12月至2016年10月,课题组以云南省玉龙县、剑川县和梁河县鼠疫疫源地为采样点,使用夹夜法在不同季节、不同海拔、不同生境捕获野外鼠形动物,收集到2 524份肝脾样本。采用巢氏PCR方法对Q热病原体贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)Com1基因的保守片段进行扩增。应用SPSS20.0软件,采用χ²检验或Fisher确切概率法分析不同疫源地、海拔梯度、生境、季节、性别间Cb在野外鼠形动物中的流行分布情况。结果检测2 524份样本,Cb阳性23份,阳性率为0.91%。检出Cb的鼠形动物包括齐氏姬鼠、中华姬鼠、黄胸鼠、社鼠、锡金小鼠、大绒鼠、臭鼩鼱和毛猬。不同生境、性别间野外鼠形动物Cb阳性率无差异(χ_生境²=6.514,χ_性别²=0.076,P>0.05);季节间Cb阳性率春季(2.44%)高于秋季(0.37%)(χ²=11.550,P<0.008);剑川鼠...     

抗菌肽MAF-1A衍生物体外抗白念珠菌生物膜活性及机制研究

目的 探讨抗菌肽MAF-1A衍生物体外抗白念珠菌生物膜活性及潜在机制。方法 采用微量稀释法检测MAF-1A衍生物对白念珠菌的MIC、MFC;通过扫描电镜等方法观察MAF-1A衍生物对白念珠菌生物膜形态学的影响;以XTT法测定MAF-1A衍生物对不同阶段生物膜活性的影响及生物膜 80% 抑制浓度(SMIC₈₀);采用流式细胞术、激光共聚焦显微技术、qRT-PCR等分析MAF-1A衍生物抗白念珠菌生物膜的作用机制。结果 MAF-1A衍生物对白念珠菌的MIC、MFC及SMIC₈₀均低于模板肽,分别为62.5 μg/mL、125 μg/mL和62.5~125 μg/mL。MAF-1A衍生物可明显抑制白念珠菌的黏附和菌丝形成,且抑制作用呈剂量依赖性;可使菌细胞黏附及菌丝形成相关基因(ALS3、HWP1、SUN41、UME6)的mRNA表达量降低(t_UME6=12.42,P<0.001;t_ALS3=12.20,P<0.001;t_SUN41=7.206,P<0.001;t_HWP1=22.52,P<0.001);可使形成中的生物膜和成熟生物被膜活性明显降低(t₂₅₀=3.680,P<0.05;t₅₀₀=4.153,P<0.05;t₁₀₀₀=4.934,P<0.05;t₂₅₀=0.5335,P<0.05;t₅₀₀=1.504,P<0.05;t₁₀₀₀=6.431,P<0.05)。62.5 μg/mL浓度的MAF-1A衍生物即可直接破坏白念珠菌成熟生物膜结构,引起成熟生物膜的细胞凋亡、ROS含量明显增加,线粒体膜电位显著降低。 结论 MAF-1A衍生物具有较好的体外抗白念珠菌生物膜活性,不仅能通过抑制细胞黏附、菌丝形成来干扰生物膜的早期形成,还能通过直接损伤以及ROS累积、线粒体膜电位去极化所引发的细胞凋亡来破坏成熟生物膜。     

肝泡状棘球蚴组织中HIF-1α、VEGFA的表达及对血管生成的作用

目的 探讨HIF-1α、VEGFA在沙鼠肝泡状棘球蚴组织的表达及血管生成过程中的作用。方法 126只沙鼠随机分成空白组(6只)、假手术组(60只)、模型组(60只),采用开腹直视肝脏穿刺法建立泡状棘球蚴动物模型,假手术组接种同体积的PBS,术后第3 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d、98 d、112 d随机取6只沙鼠,取临近病变的边缘区组织及正常肝组织。采用HE观察病理改变;qRT-PCR、原位杂交、免疫组化检测HIF-1α、VEGFA表达,CD34标记微血管进行MVD计数。结果 HE染色根据病理特点将病程分为早期(14 d内)、中期(14 d~56 d)、晚期(56 d后)。模型组泡状棘球蚴组织随感染时间不同,其HIF-1αmRNA随感染时间呈动态改变,术后第14 d其表达量高于空白组、低于假手术组(F=82.732,P< 0.001);术后第42 d、112 d其相对表达量均高于空白组与假手术组(χ²=11.536,χ²=15.189,P< 0.01);模型组术后第14 d VEGFA mRNA相对表达量低于空白组及假手术组(χ²=15.174,P< 0.01);术后第42 d、112 d,VEGFA mRNA表达量均高于空白组与假手术组(χ²=15.158,χ²=15.158,P< 0.01)。模型组术后第14 d、42 d、112 d HIF-1α表达均高于空白组、假手术组(χ²=8.627,χ²=9.000,F=15.690,P< 0.01);模型组术后第14 d、42 d VEGFA表达高于空白组、假手术组(F=11.250, F=70.059,P< 0.001);模型组术后第14 d、42 d、112 d,其MVD-CD34均高于空白组、假手术组(χ²=12.517,P< 0.01,χ²=13.157,P< 0.01;χ²=13.220,P< 0.01)。结论 沙鼠感染肝泡状棘球蚴中期,病变边缘区HIF-1α、VEGFA表达均升高,同时伴有大量微血管生成,可能存在HIF-1α转录因子激活并上调VEGFA的表达,促进肝泡状棘球蚴组织边缘区的血管新生。;     

MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID₅₀滴度,分析其病毒敏感性。结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10⁶ cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10⁶ cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10⁶ cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(4.35~4.68)lgCCID₅₀/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log₂HA/25 μL,CCID₅₀为(6.38~7.31)lgCCID₅₀/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(6.21~6.96)lgCCID₅₀/mL。结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。