交叉引物恒温扩增法检测甲型H1N1流感病毒及临床应用

目的建立交叉引物恒温扩增(Cross Priming Amplification,CPA)技术对甲型H1N1流感病毒进行检测的方法,并对该方法通过临床标本进行评价。方法根据甲型H1N1流感病毒的保守序列设计特异性引物,并在同一温度下实现RNA的逆转录和DNA扩增,该扩增产物可通过全封闭式核酸检测装置进行检测。14份健康人咽拭子标本、7个其他呼吸道病毒和6个虫媒病毒株被用来检测CPA反应的特异性;已知病毒滴度的甲型H1N1毒株进行对照梯度稀释,以测试CPA的敏感性;102份甲型H1N1临床咽拭子标本为检测对象,评估其临床的检测的可行性。结果 CPA反应未出现对健康样本以及其他病毒产生交叉反应;对已知滴度的病毒进行梯度稀释检测,证明CPA的敏感性为10拷贝/μL。对甲型H1N1流感临床病例发病1~3d临床标本新建检测方法的检出率为100%,4~6d临床标本检出率为79.31%,≥7d临床标本检出率为9.09%。讨论CPA具有较高的敏感性、特异性,对设备要求低,适合基层医疗单位对甲型H1N1流感发病早期诊断使用。     

内引物在环媒恒温基因扩增技术中的作用研究

目的研究内引物在环媒恒温基因扩增（LAMP）中的作用,确定利用LAMP的同一套特异性引物区别具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌基因的可行性。方法采用PCR介导定点突变法对沙门氏菌invA基因定点突变,使其T669→A669、T725→A725,用原LAMP特异性引物扩增含单核苷酸差异序列,观察扩增结果。结果制备的点突变模板C大小与预期值（1 371 bp）一致。LAMP扩增的伤寒沙门氏菌CMCC50098标准株DNA产物的电泳条带呈梯状,而扩增模板C未扩出反应产物。结论LAMP不能利用同一套引物扩增具有单核苷酸差异的不同株型或同一株型的病原菌,即可利用同一套引物区分这些病原菌。     

创伤弧菌溶细胞毒素单克隆抗体制备及其鉴定

目的制备创伤弧菌(Vibrio vulnificus)溶细胞素vvhA基因产物鼠源性单克隆抗体并鉴定其特异性和免疫性,为进一步研制创伤弧菌检测试剂盒奠定基础。方法采用IPTG诱导目的重组蛋白rvvhA表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rvvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果。采用杂交瘤技术和rvvhA-ELISA制备并筛选分泌rvvhA单克隆抗体的细胞株,有限稀释法进行细胞克隆。采用免疫双扩散法鉴定单克隆抗体类型。采用ELISA、免疫双扩散法和Western Blot鉴定单克隆抗体的效价和特异性。结果在0.5mmol/L IPTG诱导下,rvvhA产量可占细菌总蛋白的18%。提纯的rvvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带。共获得9株rvvhA抗体阳性的杂交瘤细胞株,其中A5E8和C3B6株可持续分泌高效价特异性单克隆抗体,其抗体类型分别为IgG1和IgG2a。A5E8和C3B6单克隆抗体有较高特异性,与多种其它细菌蛋白不发生免疫反应,对rvvhA及创伤弧菌GTC333株和WZ01株蛋白的ELISA检测阳性的效价可达1∶4000~1∶8000、免疫双扩散效价为1∶4~1∶8,Western Blot结果显示此等单克隆抗体均能有效识别rvvhA。结论本研究成功地获得了2株稳定分泌rvvhA特异性单克隆抗体的鼠源性杂交瘤细胞株,rvvhA单克隆抗体可用于检测自然表达的创伤弧菌溶细胞素。     

环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究

目的建立藤黄微球菌的环媒恒温基因扩增检测方法。方法基于藤黄微球菌23SrRNA基因部分序列设计1套（共4条）能够识别6个区域的特异性引物；优化扩增条件；评估该方法的特异性与敏感性。结果用7个参考株和大肠埃希菌等8种其他临床病原菌检验本检测法，成功地建立了环媒恒温基因扩增（LAMP）检测法。结论环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌快速、灵敏高、特异性强。     

RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定偶发分枝杆菌的研究

目的建立RNA恒温扩增实时检测技术快速鉴定偶发分枝杆菌(RIARD-MF)的方法,评估其在鉴定分枝杆菌临床分离株中的应用效果。方法将偶发分枝杆菌的16SrRNA特异序列作为目的靶标进行检测,设计含T7启动子逆转录扩增引物和RNA探针,分别对5种非分枝杆菌细菌、20种分枝杆菌标准株和259株临床分枝杆菌分离株进行42℃恒温扩增实时检测,参考标准为PCR基因测序结果。结果RIARD-MF方法学检测灵敏度可达60CFU/mL。在25种细菌的RIARD-MF特异性检测中:只有偶发分枝杆菌检测结果为阳性,其余24种细菌均为阴性,与测序检测结果一致。在检测分枝杆菌临床分离菌株时,RIARD-MF鉴定偶发分枝杆菌5株,其余为非偶发分枝杆菌,与测序结果一致,检测灵敏度和特异度均为100%。结论 RIARD-MF鉴定偶发分枝杆菌具有较高的特异度、灵敏度和准确性,且检测快速,有望成为一种新的偶发分枝杆菌临床分离菌株鉴定方法。     

创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PCR扩增。结果终浓度为3.0mg/L的PMA可有效抑制死细胞(1×108 CFU/mL)DNA的扩增;当PMA浓度小于或等于5.0mg/L时,对创伤弧菌DNA的扩增没有显著的影响;含有不同比例死活细菌的创伤弧菌混合液RTi-PCR结果表明,PMA RTi-PCR能选择性定量创伤弧菌中的活菌。纯培养创伤弧菌活细胞的检测灵敏度检测极限为2.5×101 CFU/mL,并且Ct值与细胞数的对数呈良好的线性关系,相关系数R2值为0.9982。结论 PMA RTi-PCR是一种快速灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。     

应用半重叠TCRγ引物扩增TCRγ基因重排检测淋巴细胞白血病的…

采用更加敏感的半重叠式Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）γ链特异性引物的多聚酶链反应（ＰＣＲ）法，对２８例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）初治，完全缓解（ＣＲ）及骨髓移植（ＢＭＴ）患儿的骨髓标本进行检测，用消化煮沸及酚抽提法分别对所有骨髓标本进行ＤＮＡ提取，将ＰＣＲ结果进行比较，结果表明，消化煮沸法用于微量标本的ＤＮＡ提取优于酚抽提法，２８例ＡＬＬ患儿１６例检出ＴＣＲγ特异性条带，其中微小残留病（ＭＲＤ）组１８例，     

交叉引物恒温扩增检测技术在疑似肺结核患者临床诊断中的价值

目的 评估交叉引物恒温扩增(cross priming amplification, CPA)检测技术在肺结核早期临床诊断中的应用价值。 方法 以2016年1—10月广东省佛山市和江门市及所辖7个县(区)级结核病防治机构(简称“结防机构”)就诊的初诊疑似肺结核患者为研究对象,共纳入患者6507例;所有患者均进行了胸部影像学检查并送检痰标本进行涂片镜检、固体培养和CPA检测,培养阳性菌株进行菌种鉴定,项目点临床医生结合实验室和临床检查结果对纳入患者进行初诊诊断,国家级临床专家对初诊临床诊断结果进行现场复核。分析项目地区确诊活动性肺结核患者中病原学阳性患者所占比例,并与专家复核后的临床诊断结果进行比较,分析涂片镜检、固体培养和CPA诊断肺结核的敏感度及特异度。 结果 6507例疑似肺结核患者中,涂片镜检、固体培养和CPA检测阳性率分别为18.2%(1187/6507)、25.0%(1629/6507)和23.9%(1555/6507)。3199例临床确诊为活动性肺结核患者中,涂片联合培养阳性检出率为48.5%(1550/3199),涂片联合CPA阳性检出率为47.9%(1531/3199),涂片、培养和CPA三种方法联合检测阳性率为54.4%(1740/3199)。以临床诊断结果为标准,涂片镜检、固体培养和CPA检测诊断活动性肺结核的敏感度分别为35.0%(1120/3199)、46.4%(1485/3199)和44.6%(1428/3199),特异度分别为98.0%(3241/3308)、95.7%(3164/3308)和96.2%(3181/3308)。 结论 县(区)级结防机构可应用CPA检测技术用于疑似肺结核患者的快速诊断,多种诊断技术联合应用可显著提高活动性肺结核患者的病原学诊断阳性率。     

环介导恒温扩增(LAMP)技术及其在寄生虫检测中的应用

近年来开发出一种新的恒温核酸扩增方法,即环介导恒温扩增(loop-mediated isithermal amplification,LAMP)法.LAMP技术具有简便、快速、高效、特异性强等优点,尤其适用于人类和动物疾病的检测.该文简要介绍了LAMP技术的原理,并对其在检测寄生虫如锥虫、疟原虫、巴贝虫、隐孢子虫和水生动物孢子虫等方面的应用进行综述.     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

多交叉置换扩增技术在单增李斯特菌检测中的应用及评价

目的 应用多交叉置换扩增(MCDA)技术建立单增李斯特菌的简单、快速、敏感且特异的诊断方法, 并对该方法进行敏感度、特异性及实际应用评价。方法 根据单增李斯特菌的种特异性基因lmo0733设计引物,采用荧光染料颜色变化、实时浊度检测及琼脂糖凝胶电泳三种方法确认MCDA产物,对MCDA引物进行最佳反应条件、敏感度、特异性评估,并对实际样本进行检测。结果 单增李斯特菌MCDA检测方法的最佳反应温度为61 ℃。单增李斯特菌MCDA检测方法的敏感度为10 fg/反应,分别是环介导等温扩增(LAMP)技术和交叉引物恒温扩增(CPA)技术的25倍和250倍。对153份鼠粪便标本2次增菌培养物的检测结果证实,本研究建立的单增李斯特菌MCDA检测方法的检测能力与分离培养方法(ISO 11290-1)相同,且优于LAMP、CPA和PCR方法。结论 MCDA方法作为一种快速、敏感和高效的检测方法可以应用于食品行业及临床标本中单增李斯特菌的检测。     

环介导等温扩增技术在嗜水气单胞菌检测中的应用

目的 建立环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对嗜水气单胞菌检测的方法,并用临床标本对该方法进行评价。方法 根据嗜水气单胞菌desA 基因的保守序列设计特异性引物,利用参考质粒评价该检测体系的灵敏度;用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性;用粪便模拟样本以及临床样本评价该检测体系的临床检测的可行性。结果 LAMP检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×10²拷贝/反应体系;LAMP检测体系在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性;LAMP检测体系在粪便模拟标本中的检测下限为5 × 10³ CFU/g;通过与qPCR技术相比较,LAMP具有更高的灵敏度以及更优秀的临床标本的检测能力。结论 本研究建立的LAMP方法是首次将LAMP技术运用到了嗜水气单胞菌的检测,所需仪器设备简单,可作为一种快速的筛查方法在临床检验和基层实验室应用。     

多重交叉置换扩增联合羟基萘酚蓝检测脓肿分枝杆菌方法的建立

目的 建立一种可视化的恒温扩增方法用于检测脓肿分枝杆菌(MAB)。方法 采用特异性全长erm(41)基因建立基于多交叉置换扩增(MCDA)结合羟基萘酚蓝(HNB)的方法,通过比色法直接检测扩增产物,采用23株脓肿分枝杆菌复合群和8种细菌标准株对该方法进行初步评价。结果 建立的MAB-MCDA-HNB检测限为100 fg的DNA模板。31株细菌菌株中,只有脓肿分枝杆菌检测结果为阳性,其它细菌包括结核分枝杆菌,卡介苗,马赛分枝杆菌、鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等均为阴性。脓肿分枝杆菌模拟痰标本检测灵敏度为1.7×10³ CFU/mL(每次反应17 CFU)。结论 MAB-MCDA-HNB方法能够快速准确诊断脓肿分枝杆菌的感染。     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的 建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法 选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1 000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物...     

rRNA扩增方法对结核分枝杆菌临床诊断作用的评估

目的 评价rRNA扩增方法 在临床应用的效果。 方法 选取到北京胸科医院、山东省胸科医院、河南疾控中心结核病防治所3个机构就诊的肺结核可疑症状者及健康志愿者的痰标本为研究对象,共纳入551例痰标本,对每例痰标本均进行涂片显微镜检查、罗氏培养、rRNA扩增试验以及实时荧光定量PCR。与罗氏培养方法 比较分析rRNA扩增方法 的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值以及与实时荧光定量PCR扩增方法 的一致性。 结果rRNA扩增方法 的敏感性为98.5%,特异性为95.0%,阳性预测值为95.0%,阴性预测值为98.5%,rRNA扩增方法 在涂阳标本和涂阴标本间的敏感度和特异度差异均有统计学意义（χ²=9.60,P=0.002;χ²=79.80,P<0.01）。与PCR检测结果的一致性为93.8%,涂阳和涂阴标本中2种方法 的一致性差异有统计学意义（χ²=4.45,P=0.035）。 结论 rRNA扩增方法 的敏感度和特异度均较好,且能明显缩短诊断时间,该方法 是一种较有前景的结核病实验室诊断方法 。     

副溶血性弧菌vpa0166基因与耐药性相关性研究

目的 了解2006-2014年江苏省部分地区的副溶血性弧菌分离株基因型特征,并探索编码推测外膜蛋白VPA0166的分子多样性与耐药性的关系。方法 对166株分离株采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定tlh、tdh、trh毒力基因、大流行株标志物orf8基因以及外膜蛋白编码序列vpa0166,并用纸片扩散法(Kindy-Bauer,KB)进行药敏试验。结果 测序分析发现vpa0166扩增片段呈现a型(996 bp)和b型(1050 bp)两个形态(同源性为94%),其中a型产物较b型产物在523 bp至580 bp之间有54个碱基缺失,药敏结果表明a型菌群对环丙沙星的敏感率显著高于b型菌群(P<0.05)。结论 vpa0166序列多样性与环丙沙星耐药性存在显著相关性。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。