环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究Ⅱ

目的 为有效地控制预防流行区犬科动物的棘球绦虫感染情况,建立一种快速检测棘球绦虫感染犬的粪便DNA检测方法—环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification. LAMP)。方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA ND2基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内的其它寄生虫DNA来验证LAMP方法的特异性;将转入ND2基因片段的质粒作为标准阳性对照,并做梯度稀释后同时用 LAMP 和 PCR 方法进行检测比较两者的敏感性。此外,将采集的46份犬粪便标本提取DNA,分别运用LAMP和犬尸体剖检进行感染犬的初步检测评估。结果 E.g mtDNA ND2基因的LAMP引物能够鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫这两个相近的种属,并不与其它待检寄生虫发生交叉反应,且最低检测限度为4×10¹拷贝(灵敏度比普通PCR高出10³倍)。在初步对46份犬粪便DNA检测结果中 ND2 LAMP 引物显示出较好的灵敏度和特异度,χ²检验结果该方法与犬尸体剖检方法的诊断效果无统计学差异。结论 本研究初步建立了LAMP技术检测细粒棘球绦虫感染犬的新方法,在各项特异度、灵敏度和样本检测中展现出较好的效果。该方法不需要昂贵的仪器设备和繁琐的电泳分析过程,有望成为流行区和基层兽医站细粒棘球绦虫感染犬检测的新方法。     

犬细粒棘球绦虫感染LAMP检出日期的确定

目的确定犬细粒棘球绦虫感染环介导等温扩增技术(LAMP)最早检出日期。方法家犬8只,口服喂饲细粒棘球绦虫原头节,建立细粒棘球绦虫感染动物模型。感染后40d收集犬粪,用LAMP检测粪便中细粒棘球绦虫目的基因并与传统的PCR比较。结果 8只犬均获得细粒棘球绦虫感染,感染后第18dLAMP法检查犬粪中细粒棘球绦虫目的基因均阳性,较普通PCR法提早2d。结论 LAMP法简便、快捷、灵敏,有望成为早期诊断犬细粒棘球绦虫感染的重要手段。     

环介导等温扩增技术(LAMP)检测棘球绦虫感染犬粪DNA的研究

目的 建立快速检测棘球绦虫感染犬粪便的DNA检测方法一环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification.LAMP).方法 针对细粒棘球绦虫线粒体DNA Cox1基因6个位点特异性的设计4条LAMP引物,利用LAMP法和普通PCR方法同时检测棘球绦虫、肥胖带绦虫以及犬肠道内...     

PCR诊断犬感染细粒棘球绦虫方法检出日期的确定

目的确定犬细粒棘球绦虫感染PCR检测的窗口期。方法家犬8只,口服喂饲细粒棘球绦虫原头节,感染后40 d,收集犬粪,用PCR方法检测粪便中的目的DNA。结果6只犬获得细粒棘球绦虫重度感染,感染后21 dPCR检出目的DNA片段。结论犬重度感染细粒棘球绦虫后粪便PCR检测的窗口期为20 d。     

多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

基于重组酶介导等温扩增技术的3种棘球绦虫核酸检测方法的建立及初步应用

目的　基于重组酶介导的等温扩增技术（recombinase⁃aided isothermal amplification assay, RAA）建立一种快速检测多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫的多重核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法　分别以多房棘球绦虫（GenBank登录号：NC_000928）、细粒棘球绦虫（GenBank登录号：NC_044548）和石渠棘球绦虫（GenBank登录号：NC_009460）线粒体基因组序列为靶序列,依据RAA引物设计基本原则设计、合成3对引物,并进行多重RAA扩增。分别扩增不同浓度3种棘球绦虫基因组DNA和不同浓度含3种靶基因的重组质粒,以评价多重RAA检测方法的敏感性;同时采用该方法检测3种棘球绦虫及多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫基因组DNA,以评价该方法的特异性。优化建立的多重RAA法的条件,再检测棘球蚴病病变组织样本、模拟犬粪便样本和现场狐狸粪便样本,以评价该方法的应用价值。结果　所建立的多重RAA检测方法可在39 ℃时40 min内特异性扩增多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫线粒体基因片段,长度分别约为540、430 bp和200 bp。该多重RAA法对多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA的最低检测限为2.0、2.5 pg/μL和3.1 pg/μL,对含多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫靶基因的重组质粒的最低检测限均可达到200拷贝/μL;该多重RAA法可以同时检测出多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫单一感染和多重感染,对多头带绦虫、牛带绦虫、亚洲带绦虫、犬复孔绦虫、泡状带绦虫、犬弓首蛔虫、肝片形吸虫、豆状带绦虫、中线绦虫和犬隐孢子虫无扩增。优化后的多重RAA法能够检测出全部棘球蚴病病变组织样本及模拟犬粪样本和现场狐狸粪便样本中的阳性样品,且与单一PCR法检测结果完全一致。结论　成功建立了一种可用于多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和石渠棘球绦虫基因组DNA快速检测的多重RAA法,特异性和敏感性均较高。     

细粒棘球蚴线粒体nad1基因的克隆与序列分析

目的 为完善细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)的分子分类学体系,提供更优化的种间和种内遗传标记基因。方法 在内蒙古地区采集患羊肝脏细粒棘球蚴和肝包虫病患者棘球蚴。采用提取虫体DNA的方法,扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因并进行测序,运用DNAstar5.0软件构建系统发育树并采用MEGA4.0软件进行自居检验。结果 细粒棘球蚴DNA 扩增出的羊株、人株nad1基因序列片段长度为895 bp。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫的同源性最高,相似性为86.5%;羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,为100%。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列所属分支与裂头目、裂头科Diplogonoporus balaenopterae所属分支相隔最远。结论 nad1基因有较高保守性,同时也存在种间差异,可广泛应用于研究细粒棘球绦虫的种间和种内遗传变异。     

细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 为建立高效、特异的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)检测方法。方法 本研究设计了一组基于Eg线粒体基因的特异性引物和TaqMan探针,通过反应体系及条件的优化,建立了Eg荧光定量PCR检测方法。结果 该方法线性关系好,灵敏度高,在10⁹~10²拷贝/μL相关系数达0.998,灵敏度达10²拷贝/L;在特异性试验中,与其他病原虫株无交叉反应,特异性较好;重复性试验变异系数均低于3%。应用该方法对50份临床样品进行检测,发现6份为Eg感染阳性。结论 由此可见,建立的荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异地检测细粒棘球绦虫,具有一定的实际应用价值。     

家犬粪便中的细粒棘球绦虫DNA PCR检测方法的建立

目的 建立检测家犬粪便中细粒棘球绦虫DNA的PCR方法，为开展流行病学监测提供检测手段。方法 犬粪经液氮反复冻溶后提取DNA，PCR扩增编码细粒棘球绦虫12srDNA检测该靶DNA片段（255bp）。结果 10只细粒棘球绦虫感染犬，8只（体内成虫数〉80条）阳性，2只（体内成虫数分别为4条和5条）阴性。4只未感染家犬粪样及其他3种绦虫DNA样本均为阴性。结论 初步建立了灵敏、特异的检测家犬粪便中细粒棘球绦虫的PCR方法。     

PCR方法诊断家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及在临床诊断中的应用价值

目的验证PCR方法检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫的特异性及其在临床诊断中的应用价值。方法取感染细粒棘球绦虫家犬粪便,显微镜下计数细粒棘球绦虫虫卵,稀释后PCR检测其敏感性。同时取家犬小肠内水泡带绦虫、多头绦虫、羊绦虫,将其DNA与细粒棘球绦虫DNA一起进行PCR扩增,观察其特异性。对133 bp的目标条带进行序列测定,对比分析。结果PCR检测终宿主家犬感染细粒棘球绦虫具有高度的灵敏性,即使粪便中有1个虫卵(8pg的DNA),也能测出,但扩增后特异性较差,无法利用扩增带型进行诊断。4种寄生虫均具有相同的133 bp DNA重复序列,在400 bp均可检测出相同条带。结论PCR方法检测终宿主感染细粒棘球绦虫DNA重复序列尽管有优良的灵敏性,因其特异性差,不适合用于临床诊断和推广。     

辽宁省朝阳市细粒棘球病的基因型分析

目的分析本院分离到的人源性棘球蚴的基因型,为辽宁省棘球蚴病的分子流行病学提供资料。方法经外科手术方法从患者肝内获取棘球蚴囊,将囊内容物离心沉淀提取DNA,以细粒棘球绦虫线粒体细胞色素氧化酶(cox1)基因为靶基因设计引物进行PCR扩增,对PCR产物进行测序,测序结果应用Blast进行分析,并与GenBank数据库中序列进行比对。结果 cox1扩增产物及测序的结果提示,本例样本与细粒棘球幼的cox1基因型(AF297617)高度相似,差异性为0.1%,基因型属于G1亚型。并与其他国家的25个分离株序列一致。结论线粒体基因组的cox1基因分析是棘球蚴病诊断和分型的有力工具。辽宁地区首次报道了细粒棘球绦虫的基因型为G1亚型,其序列与国内外的多个分离株保持一致,为棘球蚴病的分子流行病学补充了资料。     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

四川省藏族牧区家犬棘球绦虫病流行病学调查研究

目的 对四川省甘孜县达通玛藏族牧区家犬感染细粒棘球棘球绦虫和多房棘球棘球绦虫进行流行病学调查和评价感染风险因素.方法 分别对甘孜县达通玛藏族牧区查龙、卡龙、大德和查扎等4乡的犬主进行问卷调查,了解家犬感染棘球绦虫的相关因素.剖检流浪犬,检测棘球绦虫感染率,并用此结果 评价粪抗原-ELISA方法 .用该方法 检测家犬感染棘球绦虫的阳性率,评价犬驱虫效果.用X2检验和方差分析对结果 进行统计. 结果 2000年流浪犬棘球绦虫感染率为60.9%(14/23),其中细粒棘球绦虫感染率为26.1%(6/23),多房棘球绦虫感染率为34.8%(8/23).粪抗原-EUSA特异性为80.0%,敏感性为9213%.家犬粪抗原-EUSA阳性率平均为50%(290/580).从2003年起,经每半年1次吡喹酮犬驱虫(5 mg/kg),2005年同一犬群粪抗原阳性率降为17.0%(99/580).犬感染风险因素调查发现敞放犬粪抗原阳性率[40.4%(65/161)]明显高于半栓养犬[白天拴养夜晚放养的犬32.3%(109,337);夜晚拴养白天放养的犬29.2%(21/72)]及一直栓养的犬[20%(2/10)1(P＜0.01);主人缺乏防治相关知识的犬[38.1%(121/318)]和不进行驱虫的犬[47.7%(92/193)],阳性率明显高于主人具有相关知识[28.6%(75/262)]和驱虫犬120.4%(79/387)](P＜0.05和P＜0.01).粪抗原-ELISA阳性率与犬的年龄、性别和饲养家畜的种类无关.结论 四川省甘孜县达通玛藏族牧区是家犬两种棘球绦虫病流行区.粪抗原-EUSA法可用于检测犬棘球蚴病.犬敞放和不对犬驱虫,以及牧民缺乏相关知识是造成家犬棘球蚴病传播、流行的重要原因.     

四川省藏族牧区家犬棘球绦虫病流行病学调查研究(英文）

目的 对四川省甘孜县达通玛藏族牧区家犬感染细粒棘球棘球绦虫和多房棘球棘球绦虫进行流行病学调查和评价感染风险因素。 方法 分别对甘孜县达通玛藏族牧区查龙、卡龙、大德和查扎等4乡的犬主进行问卷调查,了解家犬感染棘球绦虫的相关因素。剖检流浪犬,检测棘球绦虫感染率,并用此结果评价粪抗原?鄄ELISA方法。用该方法检测家犬感染棘球绦虫的阳性率,评价犬驱虫效果。用χ2 检验和方差分析对结果进行统计。 结果 2000年流浪犬棘球绦虫感染率为60.9%（14/23）,其中细粒棘球绦虫感染率为26.1%（6/23）,多房棘球绦虫感染率为34.8%（8/23）。粪抗原?鄄ELISA特异性为80.0%,敏感性为92.3%。家犬粪抗原?鄄ELISA阳性率平均为50%（290/580）。从2003年起,经每半年1次吡喹酮犬驱虫（5 mg/kg）,2005年同一犬群粪抗原阳性率降为17.0%（99/580）。犬感染风险因素调查发现敞放犬粪抗原阳性率[40.4%（65/161）]明显高于半栓养犬[白天拴养夜晚放养的犬32.3%（109/337）;夜晚拴养白天放养的犬29.2%（21/72)]及一直栓养的犬[20%（2/10）] （P＜0.01）;主人缺乏防治相关知识的犬[38.1%（121/318）]和不进行驱虫的犬[47.7%（92/193）],阳性率明显高于主人具有相关知识[28.6%（75/262）]和驱虫犬[20.4%（79/387）] （P＜0.05 和P＜0.01）。粪抗原?鄄ELISA阳性率与犬的年龄、性别和饲养家畜的种类无关。 结论 四川省甘孜县达通玛藏族牧区是家犬两种棘球绦虫病流行区。粪抗原?鄄ELISA法可用于检测犬棘球蚴病。犬敞放和不对犬驱虫,以及牧民缺乏相关知识是造成家犬棘球蚴病传播、流行的重要原因。     

西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株nad1基因多态性分析

目的了解西藏阿里地区细粒棘球蚴人体分离株的优势基因型及遗传变异情况,为细粒棘球绦虫的溯源及阿里地区棘球蚴病预防控制策略的制定提供支持。方法收集阿里地区某医院2017年棘球蚴病患者病灶切除样品,提取DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因,扩增产物测序后用BLAST、ClustalX 1.83和MEGA 7.0软件进行同源性和系统进化分析。下载全国细粒棘球蚴人体分离株的nad1基因,利用DnaSP6分析单倍型;利用NetWork软件制作中国细粒棘球绦虫nad1基因的单倍型网络图。结果共收集80例细粒棘球蚴病患者病灶切除样品,其中38份样品PCR扩增出约550 bp的特异性条带。测序分析结果显示,4份样品为细粒棘球绦虫G6基因型,与蒙古人来源的序列(MH300971.1)一致性为99.8%;其余34份样品均为细粒棘球绦虫G1基因型,与标准序列(AF297617.1)相比,其535位的C碱基突变为G碱基,与阿尔及利亚人来源序列(MG672293.1)的一致性为100%。MEGA 7.0软件分析38份样品的序列,结果显示,T、C、A和G碱基占比依次为44.3%~46.5%、7.7%~9.1%、19.8%~21.5%和25.7%~26.0%。我国已报道的细粒棘球绦虫nad1基因共有9个单倍型,单倍型多样性为0.47,核酸多样性为0.19。单倍型网络图显示,H4为我国细粒棘球绦虫nad1基因主要的单倍型。结论细粒棘球绦虫G1、G6基因型是西藏阿里地区的主要基因型,资料分析表明H4为我国流行的细粒棘球绦虫nad1基因的主要单倍型。     

Associations of the genotypes of the CYP1A1 gene with predisposition to hydatid disease caused by Echinococcus granulosus strain G1

DNA samples isolated from peripheral venous blood lymphocytes in 73 children with hydatid disease were studied. The polymorphism of exon 7 (A4889G) of the CYP1A1 gene was analyzed by polymerase chain reaction, followed by hydrolysis with restriction endonuclease HincII. The material for E. granulosus genotypes to be studied was obtained from the germinal layer of larvocysts. The fragment of the mitochondrial gene encoding for the first subunit of cytochome-C-oxidase was as a DNA marker. The amplified E. granulosus DNA fragments underwent direct sequencing and a genotype was identified. The findings have led to the conclusion that carriage of polymorphic allele Val of exon 7 (A4889G) of the CYP1A1 gene in those infested with E. granulosus genotype G1 (common, sheep strain) is a risk factor of the development of the clinical form of echinococcosis granulosus.