超声微泡介导血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制裸鼠膀胱肿瘤

目的 探讨利用超声辐照微泡造影剂介导血管内皮生长因子(VEGF)-反义寡核苷酸(ASODN)对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制效应. 方法 建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型后,将24只成瘤裸鼠随机分为4组:UM+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂与VEGF-ASODN混合物,并对移植瘤体用超声波进行辐照;脂质体+ASODN组每只裸鼠尾静脉注射VEGF-ASODN与脂质体混合物;UM组每只裸鼠尾静脉注射微泡造影剂并以同样的条件进行体外超声辐照;单纯对照组每只裸鼠尾静脉注射生理盐水,各组处理每隔2 d进行一次,共计5次.观察裸鼠移植瘤生长情况,免疫组化SP法测Ki67、CD34、VEGF的表达,计算微血管密度、细胞增殖指数,TUNEL法测细胞凋亡指数. 结果 UM+ASODN组裸鼠皮下肿瘤生长速度较对照组明显减慢,肿瘤组织VEGF的表达及微血管密度较对照组降低(P＜0.05);与对照组相比,UM+ASODN组肿瘤细胞的凋亡增加(P＜0.01),而细胞增殖减少(P＜0.05). 结论 超声微泡介导的VEGF-ASODN转染能有效抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤.     

诊断超声提高脂质体介导血管内皮生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声破坏微泡造影剂的方法提高脂质体介导的血管内皮生长因子(VEGF)基因在内皮细胞中转染率的可行性。方法 脂质体介导VEGF基因转染1h后，将6孔板中的内皮细胞每孔加入造影剂10μl或100μl或500μl，然后置于水槽中，暴露在超声下30s、60s、90s。2d后，用荧光显微镜观察标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。结果 超声照射细胞30s和60s，EGFP基因表达显著提高，照射90s时杀死了大多数细胞。每孔加入微泡造影剂100μl时，其在超声作用下产生的空化作用提高了基因转染效率，造影剂为500μl时，细胞死亡率较高。结论 超声破坏微泡造影剂可以提高脂质体介导的基因细胞转染效率，为今后治疗基因的体内转染提供了经验。     

超声辐射微泡配合内皮祖细胞移植治疗糖尿病大鼠阴茎勃起功能障碍

目的探讨超声微泡配合内皮祖细胞(EPCs)移植至海绵体组织治疗大鼠糖尿病阴茎勃起功能障碍的可行性。方法体外培养、分离EPCs。将54只成功建立糖尿病勃起功能障碍模型的SD大鼠随机分为空白对照组、EPCs治疗组、1.0W/cm2超声+微泡+EPCs组(US+MB+EPCs治疗组)。EPCs移植7天后,以脱水吗啡(APO)诱导实验检测大鼠阴茎勃起次数和勃起率,组织学观察阴茎海绵体,计数毛细血管数目,计算血管密度,免疫组化检测EPCs移植大鼠阴茎海绵体的情况,Western blot检测VEGF蛋白的表达。结果 US+MB+EPCs治疗组勃起次数和勃起率、毛细血管密度、EPCs染色强度的阳性指数均高于其他两组(P均<0.05),且VEGF蛋白表达水平最高(P<0.05)。结论超声微泡联合EPCs移植可提高EPCs的转染率和靶向性,改善糖尿病大鼠的阴茎勃起功能。     

超声介导血管内皮生长因子基因促外周血管新生

随着平均寿命的提高及人口老化,外周血管闭塞性疾病的治疗不容忽视,美国每年多达1.5×10 5患者由于本病需接受截肢治疗[1] 。一、外周血管闭塞性疾病治疗现状目前外周血管闭塞性疾病的治疗方式主要有药物治疗、血管置换术、导管扩张及支架安置术等。以上治疗方法中药物治疗效果差;手术治疗、导管扩张和支架安置术均为有创性方法,危险性大,需用价值昂贵的辅助装置及麻醉,成本高,不易在临床危重患者及基层医院推广应用。慢性严重肢体缺血的预后往往很差。外周血管性疾病的治疗尽管在近几十年有了长足的提高,可通过药物、外科及微创技术治疗,但…     

超声微泡介导VEGF基因治疗下肢血管闭塞

目的探讨用超声微泡造影剂促进VEGF基因治疗兔下肢缺血的可行性.方法将30只大白兔左股动脉结扎后随机分为3组: A组采用局部注射VEGF质粒DNA; B组采用局部注射VEGF质粒与超声微泡造影剂的混合物;C组作为对照.于治疗后4周进行数字减影血管造影(DSA)和免疫组织化学方法检测侧支循环建立和血管新生.结果 DSA可见用超声破坏微泡后促进侧支循环建立较好,新生血管较多;单纯局部注射质粒可促进部分血管新生,而对照组的侧支循环和新生血管较少.各组免疫组化所测血管计数均有显著性差异.结论用超声微泡介导的VEGF基因转染,可促进缺血骨骼肌的血管新生和侧支循环建立,为下肢缺血性疾病的基因治疗提供了一种新途径.     

低频超声联合微泡影响前列腺癌DU145细胞血管内皮细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨低频超声联合微泡对前列腺癌DUl45细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法体外培养前列腺癌DUl45细胞,细胞呈对数生长时分为4组进行实验：对照组（细胞悬液1ml）、单纯微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue）、单纯低频超声组（1ml细胞悬液以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30S）、低频超声联合微泡组（800μl细胞悬液加入200μl微泡剂SonoVue后立即以频率80kHz、声强0．45W／cm2超声辐照30s）。MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,Western印迹法检测细胞VEGF蛋白的表达。采用单因素方差分析比较对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率、凋亡率、VEGF蛋白表达量差异,进一步组间两两比较采用SNK-q检验。结果对照组、单纯微泡组、单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞存活率分别为100％、（96．50±12．49）％、（93．20±5.31）％、（81．30±9．32）％;凋亡率分别为（1．10±0．26）％、（1．78±0．63）％、（5．85±0．45）％、（9．36±0．90）％;VEGF蛋白表达量分别为0．81±0．05、0．79±0．06、0．58±0．04、0．38±0．05。单纯微泡组、单纯低频超声组细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义,低频超声联合微泡组细胞存活率较对照组降低,且差异有统计学意义（q=5．88,P〈0．05）。单纯微泡组细胞凋亡率、VEGF蛋白表达量与对照组比较差异均无统计学意义;单纯低频超声组、低频超声联合微泡组细胞凋亡率均高于对照组,VEGF蛋白表达量均低于对照组,且差异均有统计学意义（q=14．09、24．51、8．06、14．89,P均〈0．05）。低频超声联合微泡组细胞凋亡率高于而VEGF蛋白表达量低于单纯低频超声组,且差异亦均有统计学意义（q=10．42、6．83,P均〈0．05）。结论微泡能增强低频超声抑制前列腺癌DUl45细胞增殖及促进凋亡,其机制可能与其下调前列腺癌DUl45细胞VEGF表达有关。     

超声辐照联合微泡造影剂介导血管内皮生长因子基因转染损伤动脉的研究

A及蛋白在各组血管中的表达情况.结果 免疫组化可见4、5组血管中大量棕黄色的VEGF阳性颗粒.RT-PCR、Western Blot检测提示第5组VEGF表达高于其他4组(P<0.05),第4组VEGF表达高于前3组(P<0.05),第1、2组间和第1、3组间的VEGF表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 单纯质粒难以有效转染血管内皮,靶向超声组和超声微泡组均可实现VEGF基因转染血管内皮,其中靶向超声组的转染效率高于超声微泡组.     

超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因逆转大鼠肝纤维化

目的 探讨超声辐照载肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的超声微泡造影剂逆转大鼠肝纤维化的可行性. 方法 将成模后的40只Wistar大鼠随机分为5组,即(1)超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+ US/MB),(2)超声+单纯质粒组(HGF+ US),(3)质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),(4)单纯质粒组(HGF),(5)单纯模型组(MA).经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 kHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s,共20 min.于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织HE染色,观察肝纤维化恢复情况;Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达. 结果 HGF+ US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数(exponential apparent diffusion coefficient,EADC)低于其他各组;病理组织片可见HGF+ US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组.同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05). 结论 超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径.     

超声微泡介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染鼠缺血心肌的实验研究

目的 探讨超声激活携基因微泡对外源基因在梗死心肌组织中表达的影响及治疗性血管新生在鼠心梗模型中的可行性研究.方法 采用心肌内注射途径,超声激活携基因微泡组注射携碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因微泡后进行超声辐照,单纯基因组和对照组分别注射等量bFGF基因质粒和生理盐水.4周后观察基因表达和促血管新生效应.结果 与单纯基因治疗组相比超声激活携基因微泡组荧光强度和bFGF mRNA表达水平显著提高(P<0.05),且血管新生更明显(P<0.05).结论 超声激活携基因微泡可明显提高bFGF基因在鼠活体心肌的表达,促进血管新生.     

靶向超声介导血管内皮生长因子基因转染对兔损伤动脉血管内皮功能的影响

目的研究超声造影剂SonoVue携带血管内皮生长因子(VEGF)基因靶向转染兔损伤动脉后血管内皮功能的恢复及程度。方法构建真核表达质粒pCDNA3.1(-)/hVEGF165。建立兔髂外动脉的球囊损伤模型,并随机分为两组:损伤后血管腔内注射携带VEGF基因质粒的造影剂并接受超声辐照的为实验组,损伤后无任何干预为对照组。2周后超声检测髂外动脉内皮依赖性舒张功能,完成后将兔处死取损伤处血管,HE染色计算血管内膜与中膜面积比值,免疫组化了解血管壁平滑肌细胞的增殖和VEGF的表达情况。结果实验组髂外动脉血管内皮依赖性舒张功能较对照组改善(P<0.05),但实验组的血管内膜面积与中膜面积比值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组化显示实验组血管壁平滑肌细胞增殖核抗原表达明显减低,且见大量VEGF阳性反应的棕褐色颗粒。结论靶向超声介导VEGF基因转染损伤的动脉管壁2周即可有效改善局部血管的内皮功能,有效增强VEGF的表达,并且抑制平滑肌细胞增殖,提示携基因靶向超声可以为早期改善介入治疗后血管内皮功能并由此防治再狭窄提供新途径。     

超声微泡破裂法联合阳离子脂质体介导基因转染的实验研究

目的 探讨超声微泡破裂法联合阳离子脂质体(cationic liposome,CL)介导绿色荧光蛋白质粒在肝癌细胞(HepG2)基因转染的可行性,并探索最佳转染条件.方法 依次采用培养液中是否含有血清和不同的CL浓度、不同超声辐照时间点、不同纳米级脂质微泡造影剂(nano-liposomal bubble,NB)浓度等处理因素进行细胞基因转染.荧光显微镜和流式细胞仪检测基因转染效率,CCK-8法检测细胞活性,以获得优化的转染参数.结果 血清能降低CL的细胞毒性,但对基因转染效率无明显影响,CL与质粒DNA质量比4∶1时可以达到相对高效低毒的转染效果,转染率(17.71±0.79)％,存活率(91.28±0.76)％.CL联合1h时间点辐照超声可以提高转染率至(24.85±0.78)％(P＜0.01),加入10％的NB可进一步提高转染率至(32.47±4.01)％(P＜0.05).结论 超声微泡破裂法可以有效增强CL介导的基因转染,联合应用为基因治疗提供了新思路.     

超声微泡介导绿色荧光蛋白基因在视网膜神经节细胞表达的实验研究

目的探讨超声微泡介导绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中的转染效率、优化转染的条件及毒性。方法体外培养RGCs,以GFP基因为报告基因,微泡造影剂(声诺维)为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染RGCs。实验组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成亚组;对照组为空白对照。荧光显微镜和流式细胞仪测定GFP的表达,MTT法检测RGCs的活性。结果与超声+质粒组相比,超声+微泡+质粒组RGCs转染率增加约5倍。优化转染条件后,频率300kHz,声强1.25W/cm2,连续波,辐照时间60s,微泡浓度45μg/ml,质粒浓度50μg/ml时,24孔板培养的RGCs转染率为(26.87±3.12)%。毒性实验证明超声微泡在该条件下进行基因转染对RGCs无毒副作用。结论在一定条件下,超声破裂微泡能增强基因的转染与表达,有望成为一种安全、有效的基因载体。     

超声联合声诺维辐照增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞中的转染

目的 探讨超声联合声诺维微泡辐照对增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在鼠胶质瘤C6细胞中的转染增效作用及安全性.方法 实验分为4组:单纯质粒组、质粒+微泡组、质粒+超声组和质粒+超声+微泡组.辐照条件为超声频率1 MHz,声强1 W/cm2,辐照时间30 s,占空比20%.按不同实验条件辐照后,应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评估基因转染效率,台盼蓝染色法评估细胞活力.结果 经超声联合微泡辐照C6细胞后,GFP基因转染效率较其他组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),且各组均未发现显著的细胞损伤.结论 超声联合声诺维微泡辐照可显著增强GFP基因在鼠胶质瘤C6细胞的转染,为临床胶质瘤基因治疗提供了一种安全,有效的非病毒基因转染方法.     

Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances gene transfection in pancreatic cancer cells

INTRODUCTION: The purpose of this study was to determine whether ultrasound exposure combined with microbubble destruction could be used to enhance non-viral gene delivery in human pancreatic carcinoma cells (PANC-1). METHODS: The study was performed with four experimental groups: Group P, plasmid alone; Group P+M, plasmid and microbubbles; Group P+U, plasmid and ultrasound; Group P+U+M, plasmid with ultrasound and microbubbles. Plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pEGFP) was gently mixed with commercially available ultrasound microbubble contrast agents (SonoVue(R); Bracco Diagnostics Inc, Milan, Italy) in Group P+M and Group P+U+M. The different combinations of DNA and DNA plus microbubbles were added to cultured PANC-1 cells under different conditions. Transfection efficiency and cell viability were assessed by FACS analysis (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), confocal laser scanning microscopy, and trypan blue staining. RESULTS: The results demonstrated that microbubbles with ultrasound exposure could significantly enhance the reporter gene expression as compared with other groups (Group P+U+M, 21.4%+/-3.16%; Group P, 2.9%+/-0.45%; Group P+M, 3.1%+/-0.51%; Group P+U, 6.1%+/-1.27%; P<0.01). No statistically significant difference was observed in the PANC-1 cell viability between Group P+U+M and other groups (P>0.05). CONCLUSION: Our in-vitro findings suggest that ultrasound-mediated microbubble destruction has the potential to promote efficient gene transfer into PANC-1 cells without significant cell death. This non-invasive gene transfer method may be a useful tool for safe clinical gene therapy of pancreatic cancer in the future.     

超声微泡介导pEGFP-N1质粒转染人牙周膜成纤维细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在一定能量的超声波辐照下,介导质粒pEGFP-N1转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的效率及安全性.方法 体外原代培养HPDLFs,以EGFP基因为报告基因,脂质微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N1转染HPDLFs.实验组超声+微泡+质粒组根据转染条件不同分成不同亚组,对照组为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和脂质体+质粒组.转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP表达.同时用MTT法检测HPDLFs的活力.结果 超声微泡介导的质粒对HPDLFs的转染效率与脂质体介导的质粒转染效率相似,明显高于其他对照组.超声+微泡+质粒组中HPDLFs的活力明显高于脂质体+质粒组.结论 在一定条件下,超声微泡能安全、有效地介导外源基因的转染与表达.     

超声破坏SonoVue微泡介导Ang-1基因的体外体内转染

目的 探讨超声破坏微泡造影剂在体外及体内介导Ang-1基因转染的效率及其促血管新生的作用.方法 293T细胞悬液分为3组:A组(微泡+超声+质粒组),B组(单纯超声照射+质粒组)及C组(对照组,每孔仅加入目的基因质粒);转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量检测基因的转染效率,PCR及Western-blot分别检测细胞转染后的目的基因表达与蛋白翻译.27只健康成年中国家兔行急性前壁心肌梗死造模后随机分为3组:组Ⅰ(超声辐照+微泡+质粒组)、组Ⅱ(超声辐照+质粒组)、组Ⅲ(对照组,心肌梗死后不做任何处理);于基因转染前后分别行心肌超声造影(MCE)检查,并于2周后处死取心肌组织行PCR及Western blot检测Ang-1 mRNA及其蛋白的表达,心肌组织Ⅷ因子染色检测其新生毛细血管密度.结果 48 h后可在荧光显微镜下观察到A组及B组转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,其中C组未见明显绿色荧光表达,A组的绿色荧光表达量明显高于B组;流式细胞仪检测A组转染效率较B组显著提高(P＜0.01).体内转染中,心肌超声造影可见组Ⅰ转染前充盈缺损处出现片状造影剂回声,PCR可检测出Ang-1 mRNA表达,Western blot可检测出目的基因的蛋白产物,余各组则无明显造影剂充填,PCR、Western blot均无法检测出Ang-1基因及其蛋白的表达;心肌毛细血管计数显示组Ⅰ新生毛细血管数量显著提高,余各组仅见少量新生毛细血管.结论 超声破坏微泡造影剂可明显提高Ang-1基因的体外及体内转染效率,具有良好的促血管新生作用.     

超声微泡造影剂介导PEDF质粒转染大鼠视网膜的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染大鼠视网膜、脉络膜的效率及治疗脉络膜新生血管(CNV)效果.方法 氩绿激光对Long-Evans大鼠视网膜进行光凝建造CNV模型.将24只造模成功的CNV大鼠分为2组:①空白组,②超声辐照微泡转染组.于转染后14 d,分别进行眼底荧光血管造影(FFA),RT-PCR和免疫荧光检查.结果 转染后14天超声微泡能介导PEDF质粒对大鼠视网膜、脉络膜的转染,并且对CNV有抑制作用.结论 利用一定能量的超声击碎携带PEDF质粒的超声微泡造影剂,能够有效地提高PEDF质粒在大鼠视网膜、脉络膜的转染效率,对大鼠脉络膜新生血管有一定抑制作用.     

超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强裸鼠移植瘤基因输送的初步研究

目的 探讨超声靶向微泡破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强裸鼠Hela细胞(人宫颈癌)移植瘤基因输送的可行性和应用价值.方法 分别将2种质粒DNA[红色荧光蛋白质粒(RFP)和荧光素酶质粒(pCMV-LUC)]与PEI以不同氮/磷酸盐比(N/P比)混合,利用凝胶阻滞实验对PEI/DNA复合物进行分析.经荷瘤裸鼠尾静脉分别注入PBS、质粒、质粒+Sono Vue微泡、PEI/DNA复合物+Sono Vue微泡,仅对一侧肿瘤行超声辐照(3 MHz、2 W/cm2、2 min、20%占空比),另一侧肿瘤作为对照,并对该转染方法 的靶向性进行分析.超声辐照3 d后处死动物,行RFP表达观察、荧光素酶活性检测和组织学检查.结果 琼脂糖凝胶电泳显示PEI可有效地缩合质粒DNA.与裸质粒组比较,UTMD(超声辐照+Sono Vue微泡)能明显提高RFP转染率.与非辐照对照侧比较,UTMD的运用使RFP表达明显增强,荧光素酶活性增加了14倍(P＜0.01).UTMD联合PEI可显著增强基因转染,受辐照移植瘤的荧光素酶活性增加了10倍(P＜0.01);与非联合PEI时比较,荧光素酶表达增加了111倍(P＜0.01).无论有否超声照射,裸鼠其他器官组织中均无明显的基因表达(P＞0.05),且未观察到明显的组织损伤.结论 UTMD联合PEI可显著增强报告基因在肿瘤组织的靶向传输和转染,是一种很有前景、新型而安全的体内基因输送方法.     

超声造影剂介导血管内皮生长因子基因治疗心肌缺血的实验研究

目的探讨超声破坏造影剂微泡介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染兔缺血心肌的有效性。方法新西兰白兔48只，结扎兔冠状动脉左旋支，建立急性心肌梗死模型。术后3d，经胸超声检查左室壁运动情况，明确心肌缺血区域，然后将VEGF真核表达质粒与新型超声造影剂JD-95混合后，经耳缘静脉输入兔体内，同时进行超声实时造影成像，照射心脏缺血区。其他对照组包括超声和造影剂组、单独基因组、基因和超声组、基因和造影剂组以及空白对照组。术后17d处死动物，取动物缺血心肌、肝、肾及下肢骨骼肌组织，用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达。结果在超声破坏造影剂微泡介导基因转染的实验组中5只兔的缺血心肌中VEGF蛋白的表达，2只兔肾有VEGF表达。而其他对照组中无VEGF蛋白表达。结论超声破坏造影剂微气泡的方法是将体外生物活性物质传递至心肌中的一种有效途径。