人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能.方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的GJIC功能.结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26 0.76)%.结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式.     

电磁场的促癌效应研究

浙江医科大学公共卫生学院采用电渗法,进行了工频磁场对细胞间缝隙连接通讯功能(GJIC)     

全反式维甲酸对脑胶质瘤细胞缝隙连接细胞间通讯功能的影响

目的 观察大鼠脑胶质瘤C6细胞缝隙连接细胞间通讯（GJIC)功能，并研究全反式维甲酸(ATRA)对C6细胞GJIC功能的影响。方法 (1)全反式维甲酸(ATRA)上调(36胶质瘤细胞GJIC功能；(2)划痕荷载染料传输实(SLDT)检测C6细胞ATRA处理前、后的细胞GJIC功能强弱；(3)光学显微镜观察ATRA处理前、后的细胞形态学变化。结果 (1)C6细胞GJIC功能低下；(2)ATRA上调C6胶质瘤细胞GJIC功能；(3)上调C6胶质瘤细胞GJIC功能后细胞增殖受到抑制。结论 (1)ATRA是C6细胞GJIC功能上调剂之一；(2)GJIC功能强弱可影响肿瘤细胞增殖。     

Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化中作用的研究

【立论依据】 在神经系统的发育和修复过程中,神经元间的细胞通讯在细胞的静息、增殖、分化和凋亡过程的发生发展中发挥着重要作用。细胞间通讯有缝隙连接、膜表面分子接触通讯和化学通讯三种方式,而缝隙连接(GJ)是细胞间直接通讯的唯一方式。缝隙连接蛋白(connexin)是GJ结构和功能的基础,在缝隙连接蛋白家族中,Cx43在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。功能性缝隙连接(GJIC)是通过缝隙连接在相邻细胞间传递氨基酸、离子、小分子等的一种通讯方式。研究表明,神经生长因子(NGF)可以促进Cx43磷酸化,同时可以诱导嗜铬细胞瘤PC12细胞分化而产生与交感神经元相似的神经元。但是Cx43形成的功能性缝隙连接(GJIC)在NGF诱导PC12细胞分化中的作用尚不清楚。因此,本研究拟阐述Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化中的作用。 【设计思路】 本实验拟构建Cx43稳定转染的PC12细胞系,并检测Cx43形成的GJIC的功能。 NGF诱导PC12细胞和Cx43稳定转染的PC12细胞,分析Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化过程中的作用,为神经损伤和修复提供新的研究靶点。 【实验内容】 (1)构建Cx43稳定转染的PC12细胞系;(2)实验分组:NGF诱导PC12细胞组,NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组,NGF诱导PC12细胞组+缝隙连接抑制剂(CBX),NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组+CBX;(3)形态学观察和NES免疫荧光细胞化学染色检测细胞分化率;(4)Dye Coupling检测Cx43形成的GJIC。 【材料】 PC12细胞;NGF;Cx43真核表达质粒;Cx43引物和抗体;CBX;NES单克隆抗体;FITC-IgG。 【可行性】 本研究前期研究工作通过形态学观察及Image软件测量显示在一定范围内,NGF量的增加可以有效提高PC12细胞的分化水平,课题组成员熟练掌握相关实验的方法和技术;研究室能提供相关的仪器和材料。实验思路清晰,实验过程明确。 【创新性】 本研究应用NGF诱导PC12细胞分化模型,探究Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化过程中的作用,从而为神经损伤和修复提供新的研究依据和调控靶点。     

大蒜素抑制化学性致癌因素的实验研究

从氧自由基、细胞间缝隙连接通讯(GJIC)及DNA含量三个不同角度观察了大蒜素对肿瘤发生的预防作用。结果显示,大蒜素可显著减轻氧自由基对细胞的毒害,并能解除苯巴比妥对GJIC的抑制(P<0.01)。证明大蒜素有很强的预防肿瘤发生的作用。     

全反式维甲酸增强HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的观察

目的体外观察全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对BIU-87细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及旁观者效应的影响.方法用染料划痕标记技术观察ATRA对BIU-87细胞GJIC功能的影响,MTT法观察ATRA处理后HSV-TK/GCV对BIU-87细胞旁观者效应的变化.结果ATRA显著改善BIU-87细胞GJIC功能,并提高HSV-TK/GCV的旁观者杀伤作用.结论ATRA可以改善BIU-87细胞间通讯功能,可能是ATRA增强HSV-TK/GCV旁观者效应的重要原因之一.     

缝隙连接细胞间通讯对顺铂疗效的影响研究进展

缝隙连接(gap junction,GJ)是细胞间直接进行信息交换的重要通道,由其介导的通讯方式缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)在细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程中发挥着关键的调节作用[1].顺铂是临床治疗肿瘤中广泛应用的化疗药物之一,但是肿瘤细胞对顺铂产生耐药性明显降低顺铂的疗效,关于顺铂耐药性产生的具体原因至今仍未阐明.研究发现GJIC与顺铂的治疗效果之间具有一定的关系,但目前对于这方面的研究还不是很深入,因此,进一步阐明GJIC与顺铂之间的关系对于解决顺铂耐药性问题具有重要的意义.     

乙酰胆碱对大鼠海马神经细胞内钙信号及细胞间通讯的影响

目的:探讨乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)对大鼠海马细胞间通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)的影响.方法:原代混合培养海马细胞;利用激光共聚焦扫描显微镜观察Ach作用后细胞内游离钙的变化;用荧光染料的刮除负载法检测Ach作用后GJIC的变化.结果:Ach(0.05～0.10 mmol/L)可引起海马细胞内钙离子浓度变化.共聚焦扫描显微镜观察显示Ach作用后细胞内钙离子浓度升高,该变化大小依赖于Ach浓度,并能被东莨菪碱拮抗.荧光染料的刮除负载法检测发现细胞与0.05 mmol/L Ach共同孵育60h后GJIC明显增强.结论:Ach使细胞间由缝隙连接介导的细胞间通讯明显增强.     

缝隙连接:一个潜在的肿瘤治疗新靶点

正连接蛋白(connexin,Cxs)及其形成的缝隙连接细胞间通讯(gap junction cell-cell communication,GJIC)在肿瘤的生长、增殖、转移中起着重要的作用。研究[1]证实,在培养的正常细胞和肿瘤细胞,缝隙连接(gap junction,GJ)能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用。大量研究[2]表明,靶向Cxs     

木犀草素增强Cx32/Cx26组成的细胞缝隙连接功能

【目的】 体外观察木犀草素对转染并稳定表达缝隙连接蛋白32/ 26(Cx32/Cx26)的Hela细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)和Cx26蛋白表达水平的影响。【方法】 用SRB法检测不同浓度木犀草素对Hela细胞的毒性;用细胞接种荧光示踪法观察不同浓度木犀草素对GJIC的影响;用western blotting 研究木犀草素在影响GJIC功能浓度范围内对Cx26表达的影响。【结果】 木犀草素在0 ~ 1 μmol/L浓度时对Hela细胞无毒性作用;木犀草素(0.01 ~ 1 μmol/L)能浓度依赖性地增强GJIC及Cx26蛋白表达量。【结论】木犀草素增强转染并稳定表达Cx32/Cx26的Hela细胞GJIC;这种增强作用可能与其增加Cx26蛋白表达水平有关。     

不稳定逼尿肌Cx43基因表达及其与逼尿肌细胞间缝隙连接通讯功能的关系研究

目的研究连接蛋白Cx43基因在体外培养不稳定逼尿肌细胞中的表达及不稳定逼尿肌细胞间缝隙连接通讯(gap junction intercelluar communication,GJIC)功能的变化,初步探讨二者与逼尿肌不稳定(destrusor instability,DI)的关系.方法健康雌性Wistar大鼠40只,分为DI组和正常组.RT-PCR及Western blot法检测各组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白表达变化,划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)检测各组逼尿肌细胞间GJIC功能变化.结果RT-PCR及Western blot检测结果显示DI组逼尿肌细胞中Cx43 mRNA及蛋白含量明显高于正常组(P＜0.01),SLDT结果表明DI组逼尿肌细胞间GJIC明显强于正常组(P＜0.01).结论体外培养不稳定逼尿肌细胞中Cx43基因表达增加,细胞间GJIC增强,二者可能与DI的发生有密切关系.     

荧光光漂白恢复技术在检测膀胱平滑肌细胞间通讯功能中的应用

目的　探讨膀胱平滑肌细胞间通讯的功能变化。方法　利用荧光光漂白恢复 (FRAP)技术检测膀胱平滑肌细胞GJIC功能。结果　在相同的时间内 ,对实验组和对照组膀胱平滑肌细胞漂白后平均荧光恢复率相比较 ,实验组显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论　FRAP技术可以从功能上研究缝隙连接介导的细胞间通讯     

缝隙连接通讯与认知功能障碍关系的研究进展

缝隙连接通讯(Gap junction intercellular commmunication,GJIC)是由缝隙连接(Gap junction)介导的相邻细胞间电偶联以及小分子物质进行信息交流、物质交换的直接方式.出血性脑损伤、缺血性脑损伤、颅脑外伤及神经变性疾病均可导致中枢神经系统功能损伤,而认知功能障碍是中枢神经系统损伤后的常见表现之一,近来随着分子生物学及电生理学研究的不断深入,越来越多的研究表明缝隙连接通讯参与了机体认知功能障碍发生的过程.     

全反式维甲酸对胶质瘤细胞细胞间缝隙连接通讯的作用

目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）对胶质瘤细胞细胞间缝隙连接通讯（GJIC）的调节作用。方法：分别用1,10,100umol/L三种浓度的ATRA作用于培养的大鼠C6胶质瘤细胞,24,48及72h后,通过细胞间染料传输实验检测缝隙连接功能,以半定量RT－PCR检测ATRA作用下C6胶质瘤细胞Cx43基因的转录。结果：对照组C6胶质瘤细胞GJIC功能很低,经1,10,100umol/L三种浓度的ATRA作用后,增强了GJIC。这种增强作用在ATRA作用24h后即十分明显,在1,10umol/L两种浓度下,ATRA对GJIC的增强作用可以持续到ATRA作用72h后,而经100umol/L的ATRA作用48h后,GJIC功能的增强则不如低浓度ATRA作用下明显,结论：对于C6胶质瘤细胞,ATRA是有效的GJIC功能增强剂,此种增强作用可能是通过转录后途径实现的。     

GJIC与中枢神经系统疾病的研究

中枢神经系统的结构和功能虽然极具独特性,但其细胞和组织的基本特性与其他部位也是大同小异的,比如说细胞间缝隙连接(gap junction intercellular,GJ),而作为一种通讯方式细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)普遍存在于多细胞生物体内,该研究在中外已经成为了炙手可热的研究对象,指明了很多疾病可能的发病和治疗机制,尤其是在中枢神经系统疾病方面,本文针对GJIC在中枢神经系统相关疾病发病机制中所起的作用作简要综述。     

急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞缝隙连接功能的研究

目的：研究急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞缝隙连接的功能方法：体外培养正常（正常对照组）及急性淋巴细胞白血病（急淋组）原代骨髓基质细胞,采用细胞免疫组化法及计算机灰度检测观察两组之间Connexin 43表达的变化,采用细胞划痕染料传输技术比较两组之间缝隙连接细胞间通讯（GJIC）功能的差异。结果：急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞Connexin 43的表达较正常骨髓基质细胞明显减低,GJIC功能减弱。结论：急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞缝隙连接功能下降可能与白血病骨髓造血微环境功能异常有关。     

六味地黄丸入血成分增效自杀基因杀伤肝癌细胞的缝隙连接机制

【目的】探讨六味地黄丸主要入血成分处理的淋巴上清对大鼠肝癌细胞CBRH7919缝隙连接功能的影响,以期阐明其增强自杀基因疗法杀伤肝癌细胞效应的作用机制。【方法】取大鼠脾淋巴细胞,加入六味地黄丸的5种主要入血成分,体外培养后取含药淋巴上清,采用流式细胞术结合荧光示踪法分析其对细胞缝隙连接通讯功能(GJIC)的影响;利用Western blot法检测含药淋巴上清对大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白表达的影响;利用GJ阻滞剂甘草次酸(GA)观察阻滞GJIC后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用的影响。【结果】流式细胞术结合荧光示踪法结果表明,占培养液15%(体积分数)的含药淋巴上清能促进大鼠肝癌CBRH7919细胞的GJIC功能;Western blot法结果显示,含药淋巴细胞上清能提高大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx43蛋白的表达水平;GA阻断GJIC功能后,含药淋巴细胞上清联合tk/GCV系统对细胞杀伤作用降低。【结论】六味地黄丸入血成分处理的淋巴上清可通过缝隙连接机制发挥对自杀基因杀伤大鼠肝癌细胞的增效作用。     

六味地黄丸通过干预缝隙连接通讯功能调控树突状细胞抗原交叉提呈能力研究

【目的】探讨六味地黄丸是否通过提高缝隙连接通讯功能(GJIC)增强树突状细胞(DC)抗原交叉提呈能力,并对其机制进行相关探索。【方法】采用Western Blot实验、免疫荧光法观察六味地黄丸含药血清对黑色素瘤细胞(B16)缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及膜定位的影响;采用钙黄绿素(Ca-AM)/DiI荧光示踪实验观察六味地黄丸含药血清对B16细胞GJIC功能的影响;采用流式细胞术观察GJIC在六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力中的作用;采用碘化丙啶(PI)/Hoechst染色实验观察CD8⁺T淋巴细胞的免疫杀伤效果。【结果】Western Blot及免疫荧光实验结果显示,六味地黄丸含药血清上调Cx43表达;荧光示踪实验证明,六味地黄丸含药血清显著增强B16细胞GJIC功能;流式细胞术分析表明,六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力;PI/Hoechst染色结果显示,六味地黄丸含药血清干预B16-OVA后CD8⁺T细胞的免疫杀伤效果更加显著。【结论】六味地黄丸通过上调黑色素瘤细胞Cx43表达,改善GJIC功能,进而增强DC的交叉提呈能力...     

dB-cAMP和顺铂的化疗效果与肿瘤细胞间缝隙连接通讯的相互关系

为探讨肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)的功能状态对化疗药物抗癌效果的影响,本研究选用GJIC功能迥异的人膀胱癌细胞系BIU,EJ和卵巢癌细胞系CaOv3,借助多种细胞生物学手段,观察它们对广谱抗癌药顺铂(DDP)和GJIC调节剂dB-cAMP的反应。结果显示,正常培养条件下,3种细胞的GJIC均较弱,dB-cAMP对BIU,CaOv3和EJ细胞的GJIC分别呈上调、略上调和无作用。抑癌实验显示,dB-cAMP本身可在一定程度上抑制3种细胞的生长;顺铂通过诱导细胞凋亡而呈明显的杀伤效应。然而,dB-cAMP与顺铂配伍使用,并不改善顺铂的抑癌效果。这说明,1)dB-cAMP的抑癌效应未必经过调节GJIC的通路;2)GJIC的改善与否同肿瘤细胞的药物敏感性无关。因此,在肿瘤细胞的分化程度和遗传学变异未加纠正的情况下,单纯调节GJIC的功能无助于化疗效果的提高。     

高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯的影响

[目的]研究高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞通讯活性(GJIC)的影响.[方法]将人晶状体上皮细胞(SRA01/04)培养于正常葡萄糖浓度(5.5 mmol/L),传代时将其接种于16个35 mm的培养皿中,实验分为4组(每组4个培养皿):正常糖浓度组(培养基葡萄糖含量是5.5 mmol/L)、高糖组(培养基葡萄糖含量是30 mmol/L)、佛波酯(TPA)组(阳性对照)及二甲基亚砜(DMSO)组(阴性对照).当细胞生长至90%融合时,用划痕荧光染料示踪技术(SL/DT)检测其缝隙连接细胞间通讯活性.[结果]在高糖培养的人晶状体上皮细胞划痕荧光黄向两侧传递的细胞列数为2.23±0.33,明显少于正常糖浓度培养的人晶状体上皮细胞(3.75±0.57,P＜0.01).TPA显著抑制晶状体上皮细胞的GJIC,与正常糖浓度组比较差异具有显著性(1.65±0.26vs3.75±0.57,P＜0.01).[结论]人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯活性在高糖中受到抑制,可能在糖尿病晶状体渗透水肿和离子代谢紊乱中发挥作用.