缝隙连接对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的影响

目的 探讨缝隙连接(GJ)在脑缺血再灌注血脑屏障通透性变化中的作用及其可能机制.方法 ①应用激光共聚焦显微镜技术观察GJ蛋白Cx43在缺血再灌注半暗带区脑毛细血管周终足上含量及分布情况的变化.②将Wistar大鼠随机分成假手术组,手术组.线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型.通过荧光分光光度定量的方法测定不同时间点脑组织中的伊文蓝含量来观察血脑屏障的通透性的改变.③取伊文蓝漏出最多的时间点,增设辛醇干预组和DMSO溶剂对照组,与相同时间点手术对照组比较,观察辛醇对血脑屏障通透性的影响.结果 缺血2 h再灌注3 h脑组织伊文蓝含量开始增加,再灌注24 h达高峰.激光共聚焦显微镜发现GJ蛋白Cx43在脑内毛细血管周围的星形胶质细胞终足上分布密集.在缺血2 h再灌注24 h半暗带内,终足上的Cx43分布发生变化,聚集成较大斑块.在缺血2 h再灌注24 h组术前给予辛醇干预,脑组织伊文蓝含量[(4.924±0.296)μg/g]低于手术对照组[(5.543±0.506)μg/g],二者差异有统计学意义(P＜0.05).结论 GJ在脑缺血再灌注后半暗带终足上分布变化明显,可能加重了血脑屏障通透性的增加;辛醇阻断GJ可以降低脑缺血再灌注血脑屏障的通透性,从而起到减轻脑水肿的作用.     

缺血后处理对大鼠脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白43的影响

目的 观察缺血后处理对脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白43(Cx43)的影响.方法 30只Wistar雄性大鼠随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注(I/R)组、缺血后处理(IP)组.采用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,脑缺血2h后,I/R组予再灌注,IP组给予大脑中动脉血流再通30s,之后阻断血流30s,如此进行3个循环之后予永久再灌注.于脑缺血再灌注后24h行TTC染色观察脑梗死体积、神经功能缺损评分,应用激光共聚焦显微镜观察Cx43蛋白表达量及分布的变化,行各组间比较.结果 IP组脑梗死体积明显小于I/R组,IP组神经缺损评分低于I/R组,与Sham组相比,I/R组Cx43数量明显减低、分布紊乱,IP组Cx43表达数量及分布明显好于I/R组.结论 缺血后处理可减小脑梗死体积、减轻神经功能缺损,缺血后处理能抑制Cx43表达减少、改善Cx43分布情况.     

应用激光共聚焦显微镜对脑脊液中脑膜癌细胞线粒体分布的研究

目的通过激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)对脑脊液中脑膜癌细胞线粒体进行立体、动态、定量研究,得到脑膜癌线粒体分布特点,为脑膜癌的诊断、鉴别诊断、细胞分化程度和功能状态判断提供依据。方法将标本分为脑膜癌组、阳性对照组、阴性对照组,用荧光探针Mitotrackcr Grccn FM标记线粒体,得到线粒体的断层扫描图像、荧光强度地形立体分布图。结果脑膜癌组线粒体分布与阳性对照组无明显差别,脑膜癌组线粒体分布与阴性对照组有明显差别。结论采用激光扫描共聚焦显微镜技术对脑膜癌的诊断、鉴别诊断、细胞分化程度和功能状态判断有一定的临床意义。     

七氟醚预处理对脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接的影响

目的探讨七氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43(CX-43)以及缝隙连接超微结构的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血对照组(对照组)和七氟醚预处理组。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。脑缺血再灌注24 h后,采用透射电镜观察星形胶质细胞间缝隙连接超微结构的改变;脑缺血再灌注24和72 h后,免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测缺血侧脑组织内CX-43的表达。结果脑缺血再灌注24 h后,对照组仅残留少量缝隙连接,七氟醚预处理组细胞间缝隙连接超微结构完整。脑缺血再灌注24 h后,对照组CX-43含量显著低于七氟醚预处理组(P0.05)。结论七氟醚预处理可能通过减轻脑缺血再灌注损伤后缝隙连接的破坏和CX-43的缺失起到神经保护作用。     

缝隙连接蛋白-43阻断剂辛醇对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

目的观察小鼠脑缺血再灌注后缝隙连接蛋白-43(Cx43)表达变化及缝隙蛋白阻断剂辛醇对小鼠梗死体积的影响。方法采用线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞模型(MCAO模型),应用免疫印迹(Western blot)方法观察脑缺血再灌注损伤前后Cx43表达变化和辛醇对Cx43表达的影响,并计算各组死亡率及脑梗死体积。结果小鼠脑缺血2h再灌注损伤24h条件下,缺血区Cx43表达在损伤前后无明显变化(P>0.05)。辛醇能显著抑制脑缺血再灌注损伤后Cx43表达,降低死亡率及减少脑梗死体积,具有统计学差异(P<0.05)。结论由Cx43组成的缝隙连接蛋白在脑缺血再灌注损伤过程中具有重要作用,缝隙蛋白-43阻断剂辛醇通过抑制海马及皮质Cx43表达,进而降低死亡率及梗死体积,从而发挥神经保护作用。     

激光扫描共聚焦显微镜在脑血管形态研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）是目前最先进的分子生物学分析仪器之一，本文就ＬＳＣＭ在脑血管疾病的病理形态学、内皮细胞生理功能、脑部微循环、脑部炎症时血管变化的研究中的作用进行介绍。     

缺血再灌注对大鼠海马CA1及DG神经元内19S蛋白酶体影响的激光扫描共聚焦显微镜研究

目的探讨缺血再灌注对大鼠海马CA1及海马齿状核(DG)神经元内19S蛋白酶体的影响。方法采用20min全脑缺血的大鼠模型,20只大鼠分为5组,分别为假手术组及按照再灌注时间分为30min组,4h组,24h组,72h组,每组4只。采用含有4%多聚甲醛的PBS液体进行灌注,取出脑组织,放于多聚甲醛中固定24h后行冠状切片,应用免疫组织化学法标记抗19S蛋白酶体抗体,应用激光共聚焦显微镜对组织切片进行观察。结果大鼠海马区CA1神经元内19S蛋白酶体在缺血再灌注30min后开始减少,4h略增高,然后逐渐减少,直至72h细胞大部份死亡;DG神经元内的19S蛋白酶体也于再灌注30min后减少,4h略增高,然后逐渐减少,至24h程度最重,72h则有所恢复。结论全脑缺血再灌注后,海马CA1及DG神经元内19S蛋白酶体的变化影响了神经元内蛋白的降解,是导致缺血后神经元死亡的一个因素。     

神经细胞膜NMDA受体蛋白激光共聚焦显微镜亚细胞定位研究

目的明确神经元膜NMDA受体蛋白分子在神经元表面的分布规律，对单个NMDA受体簇进行定位。方法应用免疫荧光标记激光共聚焦显微镜方法，对原代培养大鼠皮层神经元进行观测。结果与细胞核标记的碘化丙啶红色荧光对比，NMDA受体蛋白分子标记的FITC绿色荧光主要分布于神经元树突干膜和胞体近树突起始部分的胞膜上，呈明显的颗粒点状分布。结论NMDA受体簇在单细胞上主要与突触后膜分布一致，位于树突起始部及树突干膜上，激光共聚焦技术可以精确地定位标记后单个膜蛋门分子。     

人参皂甙Rb1通过调控缝隙连接蛋白40治疗脑缺血再灌注损伤的机制

目的观察人参皂甙Rb1(GS-Rb1)通过调控缝隙连接蛋白40(Cx40)表达在治疗脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia and reperfusion injury,Cerebral I/R injury)的相关性机制。方法选取100只体重350～450 g的4月龄的SD雄性大鼠随机分为5组,每组20只,脑缺血再灌注模型建立为采用夹闭颈总动脉法。具体分组为:(1)假手术(sham)组;(2) GS-Rb1(I/R+GS-Rb1)治疗组;(3) GS-Rb+H-89阻断(I/R+GS-Rb1+H-89)组、(4)溶媒(I/R+DMSO)组及;(5)损伤(I/R)组,每组20只。实验时间均设定为I/R后8 h。每组取10只大鼠进行行为学检测和脑组织含水量测定,另10只则获取海马区皮质通过蛋白免疫印记法(Western Blot,WB)测定神经元Cx40蛋白的变化、采用酶联免疫荧光(ELFA)及酶联免疫吸附(ELISA)检测神经元氧化应激因子NAPDH氧化酶活性、炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-a等含量的变化。结果实验结果显示,治疗组的NSS评分、脑水肿程度、NAPDH氧化酶活性、炎性因子及海马皮质Cx40表达均较溶媒组及损伤组明显下降(P 0. 05)。而H-89可明显抑制上述GS-Rb1对Cx40蛋白表达下调、降低NAPDH氧化酶活性及缓解炎性因子产生的作用(P 0. 05)。结论 GS-Rb1可能通过激活PKA途径而对Cx40蛋白表达下调,从而产生抑制损伤性物质的释放及传递,以达到脑损伤缓解作用。     

脑缺血再灌注损伤机制研究进展

脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）。缺血再灌注损伤涉及极其复杂的病理生理过程，其中各个环节、各种影响因素间的相互作用尚未完全阐明。现对脑缺血再灌注损伤一些重要机制进行简述如下。     

胰岛素治疗局灶脑缺血再灌注损伤的实验研究

目的 :观察胰岛素对脑缺血再灌注损伤的治疗作用并探讨其作用机制。方法 :制备易卒中型肾血管性高血压大鼠 ( RHRSP) ,用线栓法复制大脑中动脉阻塞 ( MCAO)模型。实验一 :造成缺血 6h再灌注 1 8h,治疗组于不同时程使用胰岛素 ,测定脑梗死体积及脑水肿的变化。实验二 :造成缺血 2 h再灌 1、3、5天 ,治疗组于再灌注后立即使用胰岛素 ,采用 TUNEL法原位标记 DNA片段 ,检测 TUNEL阳性细胞的变化。结果 :治疗组的梗死灶体积及其占全大脑体积百分比、两半球体积差值显著减小 ,TUNEL阳性细胞亦明显减少 ( P<0 .0 5)。结论 :胰岛素能减轻脑缺血再灌注损伤 ,早期用药效果更好 ,减少再灌注后细胞损伤很可能是其作用机制之一。     

脑缺血再灌流脑微血管损害及u-PA表达的实验研究

目的探讨脑缺血再灌流后继发的脑水肿、出血的发生机制。方法应用光镜、透射电镜、免疫组织化学、显微镜－计算机图像分析等技术，观察大鼠局部脑缺血２小时再灌流不同时间，脑微血管结构、Ⅳ型胶原抗原及尿激酶型纤溶酶原激活物（ｕ－ＰＡ）表达。结果局部脑缺血再灌流２４小时，缺血侧ＭＣＡ区脑微血管外细胞间质水肿最严重，基底膜节段性溶解、缺损，有红细胞漏出，微血管壁及管外细胞间质ｕ－ＰＡ大量表达达高峰，同时微血管基底膜Ⅳ型胶原抗原减少。随再灌流时间延长，微血管基底膜损害加重，Ⅳ型胶原抗原逐渐消失，ｕ－ＰＡ表达减少。结论脑缺血再灌流后脑微血管结构损害是导致脑水肿、出血的主要病理基础，而脑微血管壁和管外细胞间质ｕ－ＰＡ表达可能是引起微血管损害的主要机制之一。     

高血压对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤组织病理结构的影响

目的研究高血压对脑缺血性损伤的病理及其超微结构的影响。方法用线栓法将肾性高血压大鼠和正常大鼠制成局灶性脑缺血再灌注模型；TTC染色及图像分析系统测定局部脑缺血后不同时间的梗死灶体积．同时HE染色及透射电镜观察大鼠局灶脑缺血再灌注后及假手术组的组织病理及超微结构的变化。结果高血压大鼠与正常血压大鼠相比局部缺血再灌注在同等时间内梗死灶的面积较大，超微结构改变也较明显。结论高血压引起脑内微小动脉的改变．侧支循环减少．加重脑缺血损伤。     

亚低温对局灶脑缺血再灌注后脑血流、血脑屏障、神经细胞损伤作用的研究

目的对比研究不同时期亚低温（ＭＨＴ３２℃±０．２℃）对局灶脑缺血再灌注损伤的作用。方法６４只雄性ＳＤ鼠被随机分成常温（ＮＴ）、缺血期亚低温（ＭＨＴｉ）、再灌注期亚低温（ＭＨＴｒ）、缺血期加再灌注期亚低温（ＭＨＴｉ＋ｒ）四组,并用改良Ｋｏｉｚｕｍｉ＇ｓ局灶脑缺血模型,分别观察了动物缺血３小时再灌注３小时过程中,缺血周边和核心区局部脑血流（ｒＣＢＦ）改变,再灌注３小时后血脑屏障（ＢＢＢ）破坏及再灌注７２小时后缺血梗塞灶体积。结果ＭＨＴｉ＋ｒ及ＭＨＴｉ均有改善缺血周边区再灌注后急性高灌注和继发低灌流及核心区持续低灌流、减轻血脑屏障破坏、减少缺血梗塞灶体积的作用。该作用尤以ＭＨＴｉ＋ｒ为明显。ＭＨＴｒ作用有限。结论ＭＨＴｉ＋ｒ对皮层的保护作用较ＭＨＴｉ好。由此可推知,局灶脑缺血再灌注损伤是个持续的过程,亚低温治疗不但要考虑开始时间,其持续时间对疗效具有同样重要价值     

Development of surgical confocal scanning microscope for intra-operative imaging of brain tumors using near infrared fluorescence: Technicalnote

Abstract

We developed a confocal laser scanning microscope for intra-operative imaging of brain tumors using near infrared fluorescence. The quality of near infrared images of Indocyanine Green (ICG) was compared with the surgical confocal scanning (SCS) microscope and a conventional charge-coupled device (CCD) camera; we compared images of a tube filled with ICG, which was located in the mouse brain. Compared to the CCD camera, the SCS microscope could obtain a more precise image of ICG fluorescence through the brain tissue. In addition, the SCS microscope could image ICG fluorescence clearly in a relatively light room because of elimination of stray light, while the CCD camera required high darkness to obtain ICC images. The present SCS microscope can give useful intra-operative imaging of brain tumors, particularly detection of residual tumor tissues that extend into normal brain tissues. [Neurol Res 2000; 22: 533-536]     

免疫细胞化学染色及激光扫描共聚焦显微镜技术在脑膜癌病早期诊断中的应用

目的 探讨免疫细胞化学染色及激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术在脑膜癌病(meningeal carcinomatosis,MC)早期诊断中的应用价值.方法 将所观察脑脊液标本分为MC组、非MC组(对照组),以Shandon Cytospin 4离心沉淀仪收集脑脊液细胞.分别进行Giemsa染色(42例)、联合癌胚抗原(CEA)免疫细胞化学染色(29例,对照20名)、免疫荧光双标记染色(17例,对照20名).CEA免疫细胞化学染色采用SP法,置于普通光学显微镜下观察;免疫荧光双标记染色以CyS荧光二抗及4,6-联脒-2-苯基吲哚分别标记抗CEA单抗及细胞核DNA,置于LSCM下观察,进行定位、定性、定量分析.结果 42例患者经脑脊液细胞学检查均发现异常细胞,首次脑脊液细胞学检查阳性率为85.7%(36/42),其中29例患者结合CEA免疫细胞化学染色,阳性率为79.3%(23/29),17例经免疫荧光双标记染色,13例阳性.MC组[CEA(+)者1694.69±478.06,CEA(-)者1543.04±364.71]与对照组(603.72±178.04)比较胞核DNA荧光相对含量[CEA(+)者t=21.386,CEA(-)者t=23.144,均P<0.01]差异有统计学意义;CEA荧光相对含量CEA(+)者(1407.04±275.30)与对照组(202.51±54.05)差异亦有统计学意义(t=42.934,P<0.01).结论 免疫细胞化学染色是诊断MC的重要定性手段,结合LSCM可将MC的诊断提高到定性、定位与定量相结合的新水平.     

实验性局灶性脑缺血再灌流后bcl—2蛋白的表达

目的探讨ｂｃｌ－２在大鼠局灶脑缺血再灌流损伤中的表达与缺血所致凋亡的关系。方法采用免疫组化方法观察ｂｃｌ－２蛋白在大鼠局灶性脑缺血再灌流后皮层和基底节区动态变化。结果ｂｃｌ－２蛋白在大脑中动脉阻塞２ｈ后，随再灌流时间延长其解剖分布不同。基底节区持续时间短，而皮层区持续时间较长，其中再灌流６ｈ，ｂｃｌ－２蛋白表达最显著。结论ｂｃｌ－２蛋白表达与神经细胞存活密切相关，可能是神经细胞自我保护机制之一，防止或减少细胞凋亡的发生     

脑缺血再灌注时红细胞免疫功能变化及中性粘多糖对其的影响

本文采用脑缺血再灌注模型，观察沙土鼠红细胞免疫粘附（ＲＣＩＡ）功能变化，红细胞Ｃ３ｂ受体花环率（ＲＢＣ－Ｃ３ｂＲＲ）、红细胞免疫复合物花环率（ＲＢＣ－ＩＣＲ），和中性粘多糖（ＮＭ）对沙土鼠红细胞免疫功能的影响。结果表明：（１）缺血时ＲＢＣ－Ｃ３ｂＲＲ下降不明显（Ｐ〉０．０５），再灌注时明显下降（Ｐ〈０．００１）；（２）缺血和再灌注时ＲＢＣ－ＩＣＲ均升高（Ｐ〈０．００１）；３．提前用ＮＭ可提高再灌注