K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

K562细胞及其耐药细胞株K562/A02细胞白血病耐药相关microRNA筛选

目的 通过检测慢性粒细胞白血病急变细胞系K562及其阿霉素耐药株K562/A02的微小RNA(microRNA、miR)表达差异,探讨microRNA与白血病化疗耐药的关系.方法 MTT法检测K562/A02及其亲本细胞系K562的耐药性能;流式细胞术检测K562与K562/A02细胞的P-gp表达;运用microRNA芯片技术筛查K562与K562/A02细胞之间差异表达的microRNA,随后用实时荧光定量RT-PCR方法进一步证实.结果 阿霉素耐药株K562/A02相对于其亲本细胞系K562对阿霉素的耐药倍数为180倍;K562细胞P-gp的表达率为0.2%,K562/A02细胞P-gp的表达率为86%;microRNA芯片结果显示K562/A02与K562细胞之间有22种microRNA表达存在显著的差异(P<0.01),表达差异在2倍以上的有9种,其中miR-221、miR-155、miR-451在K562/A02细胞表达上调,而miR-98、miR-181a、let-7f、miR-424、let-7g和miR-563则表达下调.实时荧光定量RT-PCR进一步证实了上述结果,并显示miR-451、miR-155、miR-221、let-7f、miR-424在两种细胞中表达差异显著.结论 K562/A02与K562细胞存在microRNA表达差异,其中miR-451、miR-155和miR-221在K562/A02中表达显著上调,而let-7f、miR-424则显著下调,提示microRNA可能参与白血病耐药形成,差异表达的microRNA可能为逆转白血病耐药提供新的作用靶点.     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用

本研究旨在探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对K562/A02细胞株的耐药逆转作用及其逆转机制。采用MTT法检测GA对K562和K562/A02细胞的增殖抑制作用及对K562/A02细胞阿霉素(ADM)耐药逆转效应;用流式细胞术检测GA联合ADM对K562及K562/A02细胞凋亡率的影响;DAPI荧光染色观察ADM联合GA作用后细胞的形态学改变;Western blot法检测K562及K562/A02细胞P-糖蛋白(P-gp)、存活蛋白(Survivin)基因的表达。结果表明:ADM作用48 h抑制K562和K562/A02细胞增殖的IC50值分别为(1.42±0.07)μg/ml和(28.42±1.40)μg/ml。GA≤0.0625μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显增殖抑制作用;0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞能增加其对ADM的敏感性,耐药逆转倍数为1.53。0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞48 h能提高细胞的凋亡率(P<0.05),下调Survivin及P-gp蛋白的表达(P<0.05)。结论:GA可以逆转K562/A02细胞的耐药性,增强耐药细胞对ADM的敏感性,其机制可能与提高K562/A02细胞凋亡、下调Survivin和P-gp蛋白的表达有关。     

米非司酮逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

目的研究孕激素拮抗剂米非司酮对白血病多药耐药细胞K562／A02的逆转作用及其机制。方法MTT法检测米非司酮作用72h后K562／A02细胞增殖及其对阿霉素杀伤敏感性的变化；流式细胞术检测米非司酮作用前后K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达和细胞内柔红霉素的浓度；免疫组化法观察米非司酮作用前后K562／A02细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达；RT—PCR检测米非司酮作用后对K562／A02细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶（GcS）mRNA表达的影响。结果2．5、5．0和10．0μmol／L米非司酮不抑制K562／A02细胞的增殖，但上述浓度的米非司酮作用后K562／A02细胞对阿霉素的敏感性较前分别增强了1．68、4．17和10．71倍。K562／A02细胞表面P糖蛋白的表达为（49．03±5．32）％，10μmol／L米非司酮作用72h后降低到（28．60±2．13）％（P〈0．01）；K562／A02细胞内柔红霉素的浓度为（61．07±8．61）％，而10μmol／L米非司酮作用后升高到（92．72±3．48）％（P〈0．01）。经10μmol／L米非司酮作用后，bcl-2蛋白表达由（56±9）％降低到（37±6）％（P〈0．05）；Bax蛋白由（40±5）％升高到（87±10）％（P〈0．01）；caspase-3蛋白则由（36±7）％升高到（89±6）％（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞GcS mRNA的表达较K562细胞明显升高，10μmol／L米非司酮能明显降低K562／A02细胞内GcS mRNA的表达。结论米非司酮可逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，且具有剂量依赖性。10μmol／L米非司酮能明显逆转白血病K562／A02细胞的多药耐药，其机制与降低P糖蛋白的水平，调节凋亡相关蛋白bcl-2、Bax、caspase-3的表达，降低GcS mRNA有关。     

姜黄素、红霉素逆转K562/A02细胞多药耐药机制的研究

目的研究姜黄素（curcumin，Cur）及红霉素（erythromycin，EM）对多药耐药（MDR）细胞株K562／A02的影响及作用机制。方法MTF法测定Cur、EM作用后K562／A02细胞对阿霉素（ADM）敏感性的变化。流式细胞仪测定细胞内柔红霉素的平均荧光强度（DNR MFI）。免疫组化法检测细胞膜上P—gP的表达。RT—PCR法检测细胞mdr1 mRNA水平：结果Cur、EM均可减低ADM对K562／A02细胞的IC50值，两药合用时逆转倍数可达11．3倍。K562／A02细胞内DNR MFI明显低于K562细胞（P〈0．01），Cur、EM均可明显增加K562／A02细胞内DNR MFI（P〈0．05），以两药合用时作用最为明显，Cur2．5μg／ml处理组细胞内DNR MFI略高于EM120μg／ml处理组，但差异无统计学意义（P〉0．05）。免疫组化检测结果显示K562／A02细胞P—gP表达明显高于K562细胞（P〈0．01），各组药物分别处理后，K562／A02细胞膜P—gP表达减低（P〈0．01），但仍高于K562细胞（P〈0．01）；各药物组处理5d细胞膜P—gP表达均低于3d组（P〈0．01），Cur与EM合用时细胞膜P—gP表达降低最为明湿，低于其它处理组（P〈0．01）。RT—PCR结果显示K562／A02细胞mdr1 mRNA水平明显高于K562细胞（P〈0．01），各组药物处理后，K562／A02细胞mdr1 mRNA水平均减低（P〈0．01），5d组低于3d组，但仍高于K562细胞（P〈0．01）；Cur与EM合用时K562／A02细胞mdr1 mRNA水平降低最为显著，Cur 2．5μg／ml处理5dK562／A02细胞mdr1 mRNA水平低于EM120μg／ml处理5d组（P〈0．01）。结论Cur、EM均可部分逆转K562／A02细胞的MDR，降低其P—gP的表达和功能，逆转作用有时间依赖性；两药联合应用时逆转作用明湿增强，Cur2．5μg／ml逆转作用略强于EM120μg／ml。     

三氧化二砷对K562及其多药耐药细胞系K562/A02细胞的诱导凋亡研究

Ｐ170表达阳性的白血病细胞往往对多种不同化学结构和作用靶点的药物同时发生耐药。我们观察了三氧化二砷(Ａｓ2 Ｏ3 )对体外培养的人急性红白血病细胞系Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞的凋亡诱导作用 ,以探讨Ａｓ2 Ｏ3 对多药耐药白血病细胞的作用。材料和方法1　药品　Ａｓ2 Ｏ3 (Ｓｉｇｍａ公司 )溶于Ｈａｎｋｓ缓冲液中 ,配制成 1ｍｍｏｌ/Ｌ ,保存于 4℃。2　细胞株及细胞培养　Ｋ5 6 2及其多药耐药细胞系Ｋ5 6 2 /Ａ0 2细胞 (中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供 )置于含体积分数为 10 %小牛血清的ＲＰＭ…     

核酶对白血病耐药细胞株K562/A02耐药性逆转的研究

肿瘤耐药及其逆转是当今肿瘤治疗研究的热点。耐药的发生与多药耐药基因 (ｍｄｒ1)及其编码的Ｐ糖蛋白 (Ｐ ｇｐ)过度表达关系密切。我们采用电击基因导入法将特异切割ｍｄｒ1ｍＲＮＡ的锤头状核酶基因导入白血病耐药细胞株Ｋ5 6 2 Ａ0 2 ,研究该核酶抑制ｍｄｒ1基因及Ｐ ｇｐ表达 ,逆转肿瘤细胞耐药性的作用。材料和方法1　细胞株　Ｋ5 6 2细胞株系人红白血病细胞株[1 ] ,由上海血液学研究所提供。Ｋ5 6 2 Ａ0 2细胞株为阿霉素诱导Ｋ5 6 2细胞建立的多药耐药细胞株 ,由中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所提供。2　质粒　真核…     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562/A02 细胞株耐药的影响

本研究探讨急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)对K562/A02细胞耐药性的影响及其机制。从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSC;建立K562/A02细胞株与MSC共培养的体系,应用AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素(ADM)对不同培养条件下K562/A02细胞凋亡的影响;RT-PCR检测K562/A02细胞中的凋亡基因家族中bcl-2和bax基因;荧光定量PCR检测多药耐药基因mdr1浓度。结果表明,单独培养组白血病细胞早期凋亡率为(8.38±0.29)%,而黏附培养组为(1.97±0.11)%,差异具有统计学意义(p<0.05)。相对于单独悬浮培养的K562/A02细胞,黏附共培养的K562/A02细胞bcl-2基因表达明显增强,bcl-2/bax比值显著增高;K562/A02单独悬浮培养组、黏附共培养组细胞中mdr1的水平比较无统计学差异(p>0.05)。结论:白血病患儿MSC能够使白血病细胞逃避药物的促凋亡作用,K562/A02对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后bcl-2基因表达增强有关,而与其本身含有的mdr1基因无关。     

去铁胺对白血病细胞K562/A02的影响及机制研究

本研究旨在探讨铁螯合剂去铁胺对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的影响及其作用机制。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度去铁胺作用48小时对K562/A02细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测去铁胺25、50、100和200μmol/L作用K562/A02细胞48小时后细胞的凋亡率;半定量RT-PCR检测各组细胞凋亡基因BAX、BCL-2以及多药耐药基因1(MDR1)mRNA表达变化;Western blot检测各组细胞P-糖蛋白(P-gp)表达变化。结果显示,随着去铁胺药物浓度的增加,细胞活力逐渐下降,凋亡率明显增加,呈剂量依赖性;随着去铁胺浓度增加,BAX表达水平逐渐升高,但MDR1 mRNA与P-gp的表达受到显著抑制。结论:去铁胺可以通过螯合细胞内铁,影响细胞DNA的合成;同时去铁胺可抑制阿霉素诱导的MDR1、P-gp表达,增加白血病细胞对化疗药物的敏感性,进而诱导凋亡。     

HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究

目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.     

WAVE1基因在K562/A02白血病细胞多药耐药中的作用

目的 探讨WASP家族Verprolin同源蛋白1（WAVE1）基因在K562／A02白血病细胞多药耐药机制中的作用。方法 将pEFBOS—WAVE1真核表达质粒转染K562细胞构建WAVE1高表达的K562细胞，将WAVE1基因的特异性小片段干扰RNA（WAVE1siRNA）转染K562／A02细胞构建WAVE1低表达的K562／A02细胞。Western blot和RT-PCR法检测基因转染前后K562／A02细胞及K562细胞WAVE1基因及蛋白的表达；可溶性噻唑盐WST-8染色法检测阿霉素对转染前后细胞的半数抑制浓度（IC50）；Hoechest33258染色法检测细胞形态学改变并计算凋亡细胞百分率；RT—PCR检测多药耐药基因mdrl mRNA表达；Western blot检测Bcl-2表达。结果 ①与K562细胞相比，K562／A02细胞WAVE1 mRNA表达水平增加70％，蛋白表达水平增加63％。②转染WAVE1基因的K562细胞WAVE1过表达，并降低了对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（0．05±0．00）μg／ml，增加到（2．99±0．12）μg／ml，在阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别下降30％、35％。③转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞WAVE1蛋白表达水平与未转染组相比明显降低，并可增强对阿霉素的药物敏感性，使IC50从转染前的（4．29±0．15）μg／ml下降到（1．85±0．07）μg／ml，阿霉素浓度为1.5μg／ml时，凋亡细胞分别增加24％、21％。④转染WAVE1的K562细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平均增高，而转染WAVE1 siRNA的K562／A02细胞mdr1基因和Bcl-2蛋白表达水平比转染前明显降低。结论 WAVE1参与了K562／A02细胞多药耐药的形成，其机制可能与调控mdr1和Bcl-2水平有关。     

甲诺孕酮和屈洛昔芬对K562/A02细胞株多种耐药机制的调节

目的研究甲诺孕酮（ＮＯＭ）和屈洛昔芬（ＤＲＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２细胞株耐药基因ｍｄｒ１、谷胱甘肽Ｓ转移酶（ＧＳＴπ）、拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐｏⅡα）和多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）的调节。方法应用细胞培养技术,采用ＭＴＴ比色法、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术分析。结果ＮＯＭ和ＤＲＯ均可明显提高Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对阿霉素（ＡＤＭ）的敏感性,增加细胞内ＡＤＭ积累量。可显著下调ｍｄｒ１、ＧＳＴπ的ｍＲＮＡ和蛋白表达,明显上调ＴｏｐｏⅡα基因表达。Ｋ５６２敏感株的ＧＳＴπ基因表达同样被抑制。都具有明显的时间依赖性。ＭＲＰ基因表达的变化差异无统计学意义。结论ＮＯＭ和ＤＲＯ可明显逆转Ｋ５６２／Ａ０２细胞株对ＡＤＭ的耐药性。ＮＯＭ与异搏定逆转强度相似;两药对ｍｄｒ１、ＧＳＴπ和ＴｏｐｏⅡα基因表达均有明显调节作用。调节呈时间依赖性。     

Src激酶抑制剂ZD6474对白血病耐药细胞系K562/A02细胞增殖的影响及其作用机制探讨

目的 研究Src激酶抑制剂ZD6474对K562及其耐药株K562/A02细胞增殖的影响及其作用机制.方法 用不同浓度ZD6474处理K562、K562/A02细胞,观察细胞的增殖情况;用流式细胞术分析细胞周期的变化;用Western blot法分析ZD6474处理前后K562/A02细胞Src激酶及其磷酸化水平.用K562和K562/A02细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,待肿瘤直径达到0.5 ～1.0 cm,灌胃方法每天给予25、50及100 mg/kg ZD6474,生理盐水灌胃作为对照,观察ZD6474对裸鼠移植瘤的影响.并对移植瘤组织进行HE染色和免疫组化染色检测Src激酶表达(末次给药后24h)的改变.结果 ZD6474呈剂量依赖的方式抑制K562和K562/A02细胞增殖,作用48 h的IC50值分别为(1.61±0.07)μmol/L和(3.22±0.21) μmol/L.6μmol/L ZD6474分别作用K562和K562/A02细胞24 h,可以诱导G0/G1期细胞分别由(40.2±9.4)％、(25.0±7.0)％提高至(76.3±6.1)％、(54.2±6.6)％.6 μmol/L ZD6474可呈时间依赖方式抑制磷酸化(p)-Src和Src激酶的表达.用灌胃方法给予ZD6474,连续给药18 d,50 mg/kg ZD6474对K562和K562/A02移植瘤的抑制率分别为43.7％和56.3％.结论 ZD6474可通过抑制Src激酶磷酸化水平诱导K562/A02细胞凋亡;体内给药可抑制裸鼠移植瘤的生长.     

雷公藤甲素对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

本研究旨在探讨雷公藤甲素(TPL)对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响。采用MTT法检测TPL细胞毒性和阿霉素药物敏感性;流式细胞术检测P-糖蛋白表达和细胞内阿霉素浓度;双荧光素酶报告基因系统检测MDR1启动子活性。结果表明:TPL增强K562/A02细胞阿霉素敏感性。TPL作用后,K562/A02细胞P-糖蛋白表达相关平均荧光强度(MFI)由123±13下降到39±13(P<0.05);K562/A02细胞内阿霉素相关MFI由18±5上升到34±6(P<0.05),TPL能够有效抑制K562/A02细胞的药物外排。TPL降低MDR1启动子转录活性约75%。结论:TPL通过下调P-糖蛋白表达增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性,其有可能成为一种耐药逆转剂。