pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠肿瘤血管内皮细胞的作用

目的:研究pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠中肿瘤血管内皮细胞的作用.方法:建立人鼻咽癌裸鼠模型,将16只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/丙氧鸟苷(GCV)组(治疗组)和AdKDR-tk/PBS组(对照组),每组8只.观察治疗前后肿瘤体积变化、病理组织形态学及用免疫组织化学的方法观察肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达.结果:治疗组在前6 d肿瘤缓慢增长,第6天后肿瘤生长受到抑制,移植瘤体积逐渐缩小,而对照组瘤体体积持续迅速增长.治疗后第6、9、14天治疗组瘤体均明显小于对照组(均P＜0.01).治疗组鼻咽癌细胞形态与对照组无明显区别,但瘤组织中有大量的细胞坏死灶;对照组MVD 6.63±1.41,治疗组MVD 3.50±0.93,组间差异有统计学意义(P＜0.05);对照组比治疗组具有较高VEGF阳性表达,2组间VEGF表达的差异具有统计学意义.结论:AdKDR-tk/GCV系统具有抑制裸鼠鼻咽癌肿瘤血管增生及肿瘤生长的作用.     

pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗鼻咽癌的体内实验

目的:探讨pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗人鼻咽癌的杀伤效应。方法:分别以pAdKDR-tk/GCV、60Coγ射线放疗及两者联合治疗裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型,比较疗效;利用肿瘤生长曲线及肿瘤抑瘤率评价该自杀基因系统联合放疗的疗效。结果:单纯基因治疗与放疗对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为58.43%和70.88%,而基因治疗与放疗联合应用的抑瘤率达到84.39%,与前两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);第21天基因治疗与放疗联合治疗组肿瘤平均体积仅为对照组的13.5%,明显低于单纯基因治疗与放疗。结论:pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合放疗的疗效较单一治疗方案有显著的提高,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮自杀基因联合放疗研究奠定了良好的理论和临床基础。     

microRNA抑制鼻咽癌VEGF基因表达的实验研究

目的:观察人工构建的microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞VEGF基因表达的调控效应,探讨microR-NA在鼻咽癌基因治疗中的应用前景.方法:构建靶向VEGF基因的microRNA表达质粒,脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基冈的mRNA水平,Western Blotting法观察microRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,CCK-8比色法检测靶向VEGF的人工构建microRNA对鼻咽癌细胞生长的抑制作用,皮下注射稳定转染microRNA质粒的CNE-2细胞,构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤牛长情况.结果:在mi-croRNA表达质粒转染CNE-2细胞后,VEGF的mRNA表达水平下调,蛋白表达水平降低,但是光镜和荧光显微镜下的初步观察显示CNE-2细胞牛长未发生变化,以CCK-8比色法检测的细胞增殖抑制率也无明显改变,而在初步的裸鼠移植瘤实验中,发现调控VEGF表达的microRNA重组质粒能有效抑制肿瘤生长.结论:人工构建表达microRNA的质粒,可在鼻咽癌CNE-2细胞中有效F调VEGF基因的表达水平,抑制裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础.     

鼻咽癌组织中转移抑制基因和血管内皮生长因子蛋白表达及其临床意义

目的 探讨转移抑制基因（non—metastatic gene-23-H1，nm23-H1）和血管内皮生长因子（vessel endothelium growth factor，VEGF）蛋白表达与鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）预后的相关性。方法 对108例鼻咽癌放疗前活检标本进行检测，应用免疫组织化学技术检测nm23-H1和VEGF基因蛋白在鼻咽癌组织中的表达情况，并分析两基因的表达与鼻咽癌分期、放疗敏感性、生存率、转移及复发之间的关系。结果 鼻咽癌组织中nm23-H1和VEGF蛋白阳性表达率分别为48．1％和59．3％。单因素分析表明，鼻咽癌分期、淋巴转移、生存率及远处转移与nm23-H1蛋白低表达均有密切关系，而VEGF的高表达则与鼻咽癌的分期、淋巴转移、放疗敏感性、生存率及复发均有密切关系。nm23-H1蛋白表达与VEGF表达呈负相关（r=-0．577，P〈0．05）。结论 nm23-H1蛋白低表达和VEGF高表达对判断病变进展，预测放疗敏感性，生存率及转移和复发有重要参考价值。     

ElA基因下调人鼻咽癌细胞血管内皮生长因子的表达提高放疗敏感性

目的:探讨腺病毒ElA基因通过下调人鼻咽癌CNE-2Z细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达,来提高人鼻咽癌CNE-2Z细胞对放疗的敏感性.方法:选用人鼻咽癌CNE-2Z细胞为靶细胞,分别用PBS、Ad-β-gal、Ad-ElA作用48 h后,用6MV X线分别给予0、2、4、6、8和10 Gy剂量照射后.用MTT法和流式细胞仪检测3组细胞存活率及细胞周期变化来观察ElA基因对人鼻咽癌CNE-2Z细胞放疗敏感性的影响,同时用RT-PCR和免疫细胞化学法检测3组细胞VEGF水平的表达.结果:经照射后Ad-ElA组的细胞存活率明显低于PBS对照组和Ad-β-gal对照组.Ad-ElA组细胞的生长速度明显慢于PBS对照组和Ad-β-gal对照组.RT-PCR和免疫细胞化学结果显示Ad-ElA组比PBS对照组和Ad-β-gal对照组的人鼻咽癌CNE-2Z细胞的VEGF表达明显下降.结论:ElA基因通过下调VEGF的表达来提高人鼻咽癌细胞对放疗的敏感性.     

新型重组人肿瘤坏死因子抗荷鼻咽癌裸鼠的实验研究

目的 寻找理想的鼻咽癌生物治疗及联合治疗的新方法。方法 利用国内建株的鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ－２）制造了裸鼠鼻咽癌模型，用新型重组人肿瘤坏死因子（ＮｒｈＴＮＦ－α），通过不同的用药途径（局部、全身）和模式（单独、联合）观察治疗荷鼻咽癌裸鼠的疗效。并在光镜和透射电镜下观察ＮｒｈＴＮＦ－α作用后肿瘤组织细胞组织病理学及超微结构，探讨其作用机理。结果和结论 ①荷鼻咽癌裸鼠经ＮｒｈＴＮＦ－α作用后肿瘤组织细     

E1A基因下调人鼻咽癌细胞血管内皮生长因子的表达提高放疗敏感性

目的:探讨腺病毒E1A基因通过下调人鼻咽癌CNE-2Z细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达,来提高人鼻咽癌CNE-2Z细胞对放疗的敏感性。方法:选用人鼻咽癌CNE-2Z细胞为靶细胞,分别用PBS、Ad-β-gal、Ad-E1A作用48h后,用6MVX线分别给予0、2、4、6、8和10Gy剂量照射后,用MTT法和流式细胞仪检测3组细胞存活率及细胞周期变化来观察E1A基因对人鼻咽癌CNE-2Z细胞放疗敏感性的影响,同时用RT-PCR和免疫细胞化学法检测3组细胞VEGF水平的表达。结果:经照射后Ad-E1A组的细胞存活率明显低于PBS对照组和Ad-β-gal对照组。Ad-E1A组细胞的生长速度明显慢于PBS对照组和Ad-β-gal对照组。RT-PCR和免疫细胞化学结果显示Ad-E1A组比PBS对照组和Ad-β-gal对照组的人鼻咽癌CNE-2Z细胞的VEGF表达明显下降。结论:E1A基因通过下调VEGF的表达来提高人鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

五种基因的蛋白分子表达与鼻咽癌放疗疗效的关系

目的探讨上皮钙黏附蛋白（E-cadherin）、黏附分子CD44H、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、肿瘤转移抑制基因nm23H1和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达与鼻咽癌放疗疗效的关系，并分析其预测鼻咽癌疗效的价值。方法应用免疫组织化学SP法检测62例鼻咽癌组织中E-cadherin、CD44H、MMP-3、nm23H1和VEGF的蛋白分子表达水平。结果CD44H（χ^2=18．739，P=0．028）和VEGF（χ^2=18．523，P=0．030）的表达与鼻咽癌放疗后近期疗效密切相关，表达增强则近期疗效下降。CD44H和nm23H1低表达组的3年生存率分别为65．5％、45．5％，5年生存率分别为47．3％、22．7％；高表达组的3年生存率分别为54．6％、75．9％，5年生存率分别为27．8％、53．2％；CD44H（χ^2=7．31，P=0．0069）和nm23H1（χ^2=15．64，P=0．0001）两表达组的生存率差异有统计学意义。结论检测CD44H和VEGF的表达可能作为预测鼻咽癌放疗后近期疗效的指标，检测CD44H和nm23H1的表达可能作为预测鼻咽癌放疗后远期疗效的指标。     

鼻咽癌患者血清血管内皮生长因子检测及临床意义

目的 :探讨鼻咽癌患者放疗前后血清中血管内皮生长因子 (VEGF)的变化及临床意义。方法 :应用酶联免疫吸附法 (ELISA)对 4 6例鼻咽癌患者放疗前后血清中VEGF水平进行检测。结果 :鼻咽癌患者放疗前血清VEGF水平明显高于正常人 (P <0 .0 1) ,并随病情进展而升高 ;放疗后VEGF水平较放疗前明显降低 (P <0 .0 1)。VEGF水平 >15 0ng/L与 <15 0ng/L者的复发或转移率有明显差异 (P <0 .0 1)。结论 :VEGF不仅与鼻咽癌发生、发展有关 ,而且与其预后也密切相关 ,可望作为鼻咽癌患者预后的一个新的检测指标     

自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的检测pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA 3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin（简写为pEC-TS）真核表达载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用。方法 pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体分别转染CNE-2细胞,在放射线照射后用RT-PCR检测和比较胞嘧啶脱胺酶（CD）、Survivin基因的表达,并通过高效液相色谱（HPLC）检测前体药物5-FC转化成5-FU转化效率。结果检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达,HPLC检测前体药物5-FC转化成5-FU;pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中Survivin基因表达明显降低。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后,CD基因能将5-FC转化成5-FU,并通过hTERT启动子特异性降低Survivin基因的表达,有效的提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性;为鼻咽癌基因治疗提供了一种新的思路。     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

腺相关病毒介导的内皮抑素对鼻咽癌移植瘤生长和转移的抑制作用

目的研究重组腺相关病毒介导的人内皮抑素对裸鼠鼻咽癌肝脏异位移植瘤生长和转移的抑制作用。方法检测携带人内皮抑素的重组腺相关病毒(RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSCARRYING HUMAN ENDOSTATIN GENE,RAAV-HENDO)体外感染效率、蛋白表达及生物活性。建立裸鼠鼻咽癌肝脏异位移植瘤动物模型,经尾静脉分别注射携带人内皮抑素基因的RAAV-HENDO(HENDO组)、携带增强型绿色荧光蛋白基因的RAAV-EGFP(RAAV-CARRYING ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN GENE,RAAV-EGFP,EGFP组)和磷酸缓冲液(PBS组),观察动物肝脏成瘤、肺转移及生存期等情况,免疫组化检测肿瘤微血管密度,原位末端标记(TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYL TRANSFERASE-MEDIATED DUTP NICK-END-LABELING,TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡指数。结果体外实验表明:RAAV体外感染效率达98%;免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞质;RAAV-HENDO感染细胞培养上清对ECV304细胞72H增殖抑制率为67·3%。动物实验表明:相对PBS组,HENDO组抑瘤率为70·7%;HENDO组、EGFP组、PBS组肺转移率分别为0·0%、50·0%、66·7%;微血管平均(X-±S,以下同)密度分别为(3·67±1·63)、(19·67±2·16)、(22·50±3·02),组间比较差异有统计学意义(P<0·01);凋亡平均指数分别为(28·83±5·27)%、(6·17±2·79)%、(4·50±2·17)%,组间比较差异有统计学意义(P<0·01);3组动物平均生存期分别为(36·50±8·46)D、(24·00±5·66)D、(21·17±3·92)D,组间比较差异有统计学意义(P<0·01)。结论重组腺相关病毒介导的内皮抑素能有效抑制裸鼠鼻咽癌肝脏异位移植瘤的生长和转移,其可能机制为抑制肿瘤新生血管形成,诱导肿瘤细胞凋亡。     

yCDglyTK融合自杀基因前药系统对鼻咽癌CNE-2细胞株放射增敏作用的研究

目的研究yCDglyTK融合自杀基因前药系统对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的放射增敏作用。方法pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-1yCDglyTK质粒经电穿孔法转染CNE2细胞,给予不同剂量γ射线照射及不同剂量前药,通过免疫组化、高效液相色谱、细胞存活率测定(MTT法)及克隆增殖实验,观察不同剂量辐射对自杀基因阳性CNE-2细胞中自杀基因表达及功能的影响,并观察前药干预及γ射线对CNE-2细胞生长的影响。结果电离辐射可诱导增强自杀基因阳性细胞株中yCDglyTK基因的表达;电离辐射与前药的联合大大增强了对自杀基因阳性CNE-2细胞的杀伤作用,其杀伤作用大于单独自杀基因前药系统和单独放射。结论yCDglyTK融合自杀基因前药系统对CNE-2细胞有放射增敏作用,其与放射联合使用对CNE-2细胞有明显协同杀伤效应。