紫杉醇联合放疗治疗鼻咽癌裸鼠移植瘤Survivin mRNA的表达及其意义过程中

目的：研究紫杉醇联合放疗治疗鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的疗效及凋亡抑制基因Survivin的表达和意义。方法：建立鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤,分别进行紫杉醇（紫杉醇组）、放疗（放疗组）、紫杉醇＋放疗（紫杉醇＋放疗组）处理,测量移植瘤体积并对移植瘤标本进行苏木精-伊红染色、流式细胞仪检测凋亡指数及onestep RT—PCR检测Survivin mRNA的表达。结果：紫杉醇＋放疗组对裸鼠移植瘤的生长抑制最为明显,抑制率为99．3％。与对照组相比,紫杉醇组、放疗组和紫杉醇＋放疗组的凋亡指数均明显增加（P〈0．05）,其中紫杉醇＋破疗组更为明显（P〈0．05）。紫杉醇组和放疗组的裸鼠移植瘤组织中Survivin mRNA的表达与对照组无明显差异（P〉0．05）,但紫杉醇＋放疗组中Survivin mRNA的表达显著下降（P〈0．05）。结论：紫杉醇联合放疗对鼻咽癌低分化移植瘤具有明显的杀伤作用,紫杉醇对鼻咽癌裸鼠移植瘤具有放疗增敏作用,这种作用可能与凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关。     

pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗鼻咽癌的体内实验

目的:探讨pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗人鼻咽癌的杀伤效应。方法:分别以pAdKDR-tk/GCV、60Coγ射线放疗及两者联合治疗裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型,比较疗效;利用肿瘤生长曲线及肿瘤抑瘤率评价该自杀基因系统联合放疗的疗效。结果:单纯基因治疗与放疗对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为58.43%和70.88%,而基因治疗与放疗联合应用的抑瘤率达到84.39%,与前两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);第21天基因治疗与放疗联合治疗组肿瘤平均体积仅为对照组的13.5%,明显低于单纯基因治疗与放疗。结论:pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合放疗的疗效较单一治疗方案有显著的提高,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮自杀基因联合放疗研究奠定了良好的理论和临床基础。     

pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠肿瘤血管内皮细胞的作用

目的:研究pAdKDR-tk自杀基因系统对鼻咽癌裸鼠中肿瘤血管内皮细胞的作用.方法:建立人鼻咽癌裸鼠模型,将16只成瘤鼠随机分成AdKDR-tk/丙氧鸟苷(GCV)组(治疗组)和AdKDR-tk/PBS组(对照组),每组8只.观察治疗前后肿瘤体积变化、病理组织形态学及用免疫组织化学的方法观察肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达.结果:治疗组在前6 d肿瘤缓慢增长,第6天后肿瘤生长受到抑制,移植瘤体积逐渐缩小,而对照组瘤体体积持续迅速增长.治疗后第6、9、14天治疗组瘤体均明显小于对照组(均P＜0.01).治疗组鼻咽癌细胞形态与对照组无明显区别,但瘤组织中有大量的细胞坏死灶;对照组MVD 6.63±1.41,治疗组MVD 3.50±0.93,组间差异有统计学意义(P＜0.05);对照组比治疗组具有较高VEGF阳性表达,2组间VEGF表达的差异具有统计学意义.结论:AdKDR-tk/GCV系统具有抑制裸鼠鼻咽癌肿瘤血管增生及肿瘤生长的作用.     

EB病毒BHRF1基因抗辐射作用的研究

为了解EB病毒编码基因BHRF1的表达对鼻咽癌细胞抵抗放射线损伤能力的改变，构建携有BHRF1的高表达载体，并转染鼻咽癌细胞株CNE2细胞，观察转染前后的癌细胞在放射线照射后于裸鼠体内成瘤能力改变的情况。结果发现，在放射线照射前，BHRF1表达细胞在裸鼠体内形成肿瘤时间较晚，肿瘤重量较轻（P＜0．01）；而经放射线照射后，BHRF1表达细胞在裸鼠体内的成瘤能力强于对照组（P＜0．01），经原位末端标记检查发现其凋亡指数小于对照组（P＜0．01）。提示BHRF1的表达能通过阻止细胞的凋亡，增强鼻咽癌细胞抵抗放射线对其DNA的损伤作用。     

肿节风对鼻咽癌裸鼠移植瘤凋亡和端粒酶活性的影响

目的:评价肿节风提取物诱导鼻咽癌裸鼠移植瘤细胞凋亡作用和抑制端粒酶活性的能力。方法:将移植人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞的裸鼠随机分为肿节风组、环磷酰胺组和对照组,定期检测裸鼠的体重及肿瘤体积,给药一个疗程(30d)后解剖获取肿瘤组织,称量瘤体重量,计算抑瘤率。运用透射电镜观察瘤组织细胞超微结构的改变;免疫组织化学法检测瘤组织Bcl-2和Bax的表达;流式细胞仪进行细胞周期、细胞凋亡分析;TUNEL法检测细胞凋亡;TRAP-ELISA方法观察药物处理前后组织端粒酶活性的变化。结果:动物实验表明,肿节风对CNE1、CNE2移植瘤有明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为40.8%和46.8%(与对照组比较P<0.01);且Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P<0.01),而Bax蛋白表达明显高于对照组(P<0.01);电镜下肿节风组瘤组织中可见较多典型的凋亡形态学改变;TUNEL法肿节风组凋亡指数明显高于对照组(P<0.01);流式细胞技术显示肿节风组G0/G1期细胞高于对照组(P<0.01),细胞阻滞在G0/G1期,凋亡率明显高于对照组(P<0.01);端粒酶活性检测中可见肿节风组比对照组端粒酶活性降低(P<0.01)。结论:肿节风在体内具有抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的作用,其抑瘤作用机制与诱导凋亡有关,抑制端粒酶活性可能起部分作用。     

EGCG对鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤的放疗增敏作用以及对Survivin表达的影响

目的研究凋亡抑制基因Survivin的表达与EGCG对鼻咽癌CNE 2裸鼠移植瘤放疗增敏作用的关系。方法将低分化鼻咽癌细胞CNE 2接种于4～6周龄的雌性裸鼠皮下,待移植瘤生长至4～6?mm时,随机分为4组,分别采用NS、EGCG［50?mg/(kg·w）］、放疗（15?Gy）、EGCG给药24?h后再行放疗等方法分别处理各组裸鼠,处理前后分别测量裸鼠移植瘤的短径、体积。21?d后处死裸鼠,取出肿瘤并称重,将肿瘤组织分成两份,分别用来进行病理切片TUNEL染色以及RT PCR检测Survivin mRNR的表达。结果EGCG＋放疗对裸鼠移植瘤的生长抑制最为明显,肿瘤生长抑制率为89.3%,消退率为40.0％。与对照组EGCG组、放疗组相比,EGCG＋放疗组的凋亡指数均明显增加（P＜0.05),同时,伴有Survivin mRNR的表达显著下降（P＜0.05）。结论EGCG对鼻咽癌裸鼠移植瘤可能具有放疗增敏作用,这种作用可能与凋亡抑制基因Survivin的表达下调有关。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

E6．BARFlpN控自杀基因CD／UPRT．UL49的表达对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应

目的体外实验观察及检测E6．BARFlP．CD,UPRT．UL49,5-Fc系统对鼻咽癌上皮细胞系2（nasopharyngealcarcinomaepithelial-2,CNE-2）的杀伤效应。方法用高效液相色谱法测定Y射线干预对前体药物5．氟胞嘧啶（5．fluorocytosine,5．Fc）转换效率的影响：用相对存活率表示γ射线联合前体药物5．Fc对转染自杀基因E6．BARFlP．CD／UPRT．UL49的CNE-2细胞和野生型CNE-2细胞的杀伤作用;流式细胞仪检测1,射线联合前体药物5-Fc对转染自杀基因E6．BARFlP．CD／UPRT．UL49的CNE-2细胞的杀伤作用及旁杀效应。统计分析采用SPSSl0．0软件进行f检验及方差分析,P〈0．05表示有统计学意义。结果转染自杀基因E6．BARFlP．CD／UPRT．UL49的CNE．2细胞在接受放射治疗联合前体药物5．Fc的作用后,其生长受到不同程度的抑制。即使仅有10％的CNE一2细胞成功转染了自杀基因E6．BARFlP．CD／UPRT．UL49,亦可因旁杀效应而杀死37．46％的肿瘤细胞。结论E6．BARFlP．CD／UPRT．UL49／5．Fc自杀基因,前体药物系统对鼻咽癌CNE-2细胞具有直接杀伤和旁杀效应。     

CDglyTK融合自杀基因杀伤喉癌Hep-2细胞的体外实验研究

目的：研究融合自杀基因CDglyTK联合前体药物对喉癌Hep-2细胞的杀伤效应。方法：构建质粒表达载体pcDNA3．1（-）CMV．CDglyTK,XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定,测序分析CDglyTK基因序列。电穿孔法将重组质粒转染Hep-2细胞,400mg／LG418筛选14d获得稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞,RT—PCR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。以转染空白载体pcDNA3．1（-）的Hep-2细胞为对照,MTT法观察5-FC、GCV、5-FC加GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果：酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因,RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段,Western-blotting检测到该基因表达的分子量为59000的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5-FC、GCV、5-FC加GCV干预下生长受到抑制,5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论：CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

TNFRⅡ转基因诱导喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型肿瘤细胞凋亡的实验研究

目的：探讨肿瘤坏死因子受体2（tumor necrosis factor receptor 2,TNFRⅡ）转基因结合TNFα局部注射诱导喉鳞状细胞癌裸鼠模型肿瘤细胞的凋亡和杀伤肿瘤的效果,为喉鳞状细胞癌的基因治疗开辟新途径。方法：在利用人喉鳞状细胞癌Hep2细胞建立人喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型的基础上,以脂质体为载体采用体内转基因技术,活体转染人类TNFRⅡ并联合局部TNF-α注射,采用肿瘤大体观察、流式细胞术、免疫组织化学、TuneⅠ、透射电镜等方法观察TNFRⅡ转染前后肿瘤细胞TNFRⅡ表达水平、肿瘤细胞凋亡情况,综合评价对肿瘤杀伤和抑制的效果。结果：裸鼠喉癌移植瘤模型的成瘤率为94．5％。活体转基因48h TNFRⅡ表达水平达最高峰并在72h内维持较高水平。免疫组织化学方法证实TNFRⅡ主要表达在肿瘤细胞的细胞膜上,空质粒转染组肿瘤细胞几乎无TNFRⅡ表达。2000U TNFα局部注射对肿瘤的诱导凋亡和杀伤的抑制效率最高,表现为在TNFRlI转基因组动物治疗结束时肿瘤的体积为（1161．333±166．555）mm^3,瘤体重量为（1．100±0．832）g,瘤／鼠重为0．044±0．332,凋亡率为（38．226±13．671）％,与空质粒转染对照组相比具有明显差别。Tunel和超微结构观察发现前者的细胞凋亡明显高于后者。结论：通过TNFRⅡ活体转基因提高其蛋白表达水平可以明显提高TNFα局部注射杀伤喉癌移植瘤模型动物肿瘤细胞的效果,其机制是通过更有效诱导细胞凋亡来实现的。活体TNFRⅡ转基因结合TNFα局部注射有可能成为喉癌基因治疗的一个有效方法。     

鼻咽癌患者外周血γδ T细胞的体外扩增及对鼻咽癌细胞的体外杀伤活性

目的：通过体外扩增鼻咽癌（NPC）患者外周血γδT细胞，研究对NPC细胞体外细胞毒作用，以探讨γδT细胞在NPC免疫机制中的作用。方法：用抗体固相法体外扩增7例NPC患者（NPC组）及6例健康者（对照组）的外周血γδT细胞，以流式细胞仪检测γδT细胞亚型，对MTT法观察不同来源的γδT细胞在不同效靶比条件下，对Daudi、CNE1和CNE2细胞的细胞毒作用。结果：对照组与NPC组外周血γδT细胞经体外扩增，纯度可达到82％以上，其中90％为Vγ/Vδ2亚型；γδT细胞对Daudi、CNE1和CNE2细胞显示出作用强度相同的细胞毒作用（P＞0．05）。随效靶比升高，γδT细胞对CNE1和CNE2的细胞毒作用明显增强，在相同效靶比时对Daudi细胞的细胞毒作用最强。结论：NPC患者外周血γδT细胞对NPC细胞有明显体外杀伤作用。     

X射线交错互补修复基因1多态性和EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响

目的　探讨X射线交错互补修复基因1（X-ray repair cross-complementing gene 1,XRCC1）多态性与EB病毒感染对鼻咽癌细胞基本特性的影响。方法　将鼻咽癌细胞株分组,使之分别表达不同的XRCC1基因型,转染EB病毒,比较转染前后不同基因型鼻咽癌细胞的基本特性,并检测XRCC1蛋白的表达水平。结果　XRCC1不同基因型的鼻咽癌细胞之间基本特性无明显差异,XRCC1蛋白水平无差异。EB病毒感染后,各组鼻咽癌细胞生长加快、增殖能力变强、迁移速度加快、凋亡率降低,XRCC1蛋白水平无明显改变。EB病毒感染后,194位点突变型的鼻咽癌细胞与280、399位点突变型细胞相比,细胞增殖和迁移能力改变程度较小,差异有统计学意义。其他基因型细胞基本特性及XRCC1蛋白水平无差异。结论　EB病毒感染可增加鼻咽癌易感性,EB病毒感染后XRCC1 194位点的Trp突变型基因可能对鼻咽癌有保护作用。     

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

 目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6 LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE 1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE 1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE 1和CNE 1 LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4（death receptor 4,DR4）,死亡受体5（death receptor,DR5）表达差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE 1细胞中caspase 8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase 3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE 1 LMP1细胞,而Bcl 2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式（truncated form of Bid,tBid）和caspase 9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC 1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。     

抗癌活性肽对鼻咽癌细胞周期的影响

目的探讨抗癌活性肽(anti-cancer bioactive peptide,ACBP)肝肽和科脾肽对人鼻咽癌细胞株CNE体外增殖抑制作用及细胞周期的影响。方法将人鼻咽癌CNE细胞与不同浓度的ACBP进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的ACBP对CNE细胞的生长抑制率;光镜下观察形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期与凋亡率。结果质量浓度5．0-20．0μg／ml的ACBP均能抑制CNE细胞的生长,且随浓度及作用时间延长抑制率上升,20．0μg／ml ACBP作用72 h后,肝肽组的抑制率为63．0％,科脾肽组抑制率为46．7％。光镜下可观察到ACBP作用后的细胞凋亡现象。流式细胞仪结果显示:5．0μg/ml肝肽和科脾肽作用CNE细胞24 h的早期凋亡率较高,分别为(11．8±0．3)％和(8．1±0．2)％,分别与对照组比较,差异均有统计学意义(t值分别为42．535和47．300, P值均为0．000);20．0μg／ml的肝肽和科脾肽作用CNE细胞,随作用时间延长S期细胞构成比有明显上升。结论肝肽和科脾肽对CNE细胞均有抑制增殖的作用,其抗鼻咽癌细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

莪术醇对人鼻咽癌细胞CNE2增殖、凋亡及周期的影响

目的 探讨莪术醇( curcumoI)在体外对人鼻咽癌CNE2细胞增殖、凋亡及周期的影响,为其临床治疗鼻咽癌提供理论依据.方法 不同浓度莪术醇作用于人鼻咽癌CNE2细胞后,用MTT法和流式细胞仪检测不同时间点鼻咽癌细胞CNE2的增殖、凋亡及周期分布.结果 莪术醇在体外明显抑制鼻咽癌CNE2细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖...     

Maspin蛋白在鼻咽癌放射敏感CNE2细胞株中的表达分析

目的探讨放射敏感鼻咽癌CNE2细胞株在放射条件下丝氨酸蛋白酶抑制剂Maspin蛋白的反应性变化,分析鼻咽癌放射作用的分子机制。方法采用MTT比色法检测放射线对鼻咽癌CNE2细胞株生长的影响,胎盼蓝染色法检测CNE2细胞增殖,流式细胞术检测CNE2细胞放射后的凋亡及周期改变,Western blotting分析Maspin蛋白的表达。结果鼻咽癌CNE2细胞株放射后,细胞周期重新分布,出现较多的G2/M期细胞以及较少的G0/G1期细胞;增殖受到抑制、细胞凋亡明显、Maspin蛋白表达上调,且其上调与细胞凋亡率增高呈现一致性改变,也与细胞周期分布改变相关。结论鼻咽癌CNE2细胞对放射线敏感、容易被诱发凋亡;细胞周期参与了放射诱导的CNE2放射反应调节;放射提高了CNE2细胞的Maspin蛋白表达,提示该蛋白参与了CNE2细胞的放射反应;Maspin蛋白表达提高涉及CNE2细胞周期和凋亡改变,是一个值得深入研究的鼻咽癌放射敏感相关分子。