重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。     

XAF1基因对胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响

目的 探讨Ad5/F35腺病毒介导的X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)基因对胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响.方法 构建和包装Ad5/F35- XAF1重组腺病毒并感染胰腺癌细胞SW1990(Ad5/F35-XAF1组),设立对照病毒感染组(Ad5/F35-Null组)和空白组.运用RT-PCR技术和Western blotting分析对感染细胞进行鉴定.流式细胞仪检测细胞凋亡并分析细胞周期,TUNEL法测定细胞凋亡率;MTT法检测细胞增殖.结果 Ad5/F35-XAF1组SW1990细胞XAF1mRNA和蛋白表达水平均明显上调.与空白对照组和Ad5/F35-Null组比较,Ad5/F35-XAF1组细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低,G2/M期细胞比例显著增加,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞SW1990后,能促进细胞凋亡并抑制细胞增殖.     

基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响

目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入体外培养的肺癌A549细胞,ELISA检测外源基因内皮抑素,在体外培养的肺癌A549细胞中的表达。体外培养血管内皮细胞,以MTT法评价重组血管内皮抑素基因腺病毒(Ad.Endostatin)转染肺癌细胞后含内皮抑素的上清液对内皮细胞增殖的抑制作用。结果:ELISA检测结果:重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在转染的肺癌A549细胞中高效表达,在转染肺癌细胞后第1天即有内皮抑素的表达,在第3天达到高峰,5～7天后逐渐减弱。缺陷型腺病毒组及PBS组未见有表达。MTT检测结果:Ad.Endostatin转染肺癌A549细胞后表达的内皮抑素可抑制体外培养的血管内皮细胞的增殖,而缺陷型腺病毒组及PBS组对血管内皮细胞的增殖未见有抑制作用。结论:腺病毒介导的血管内皮抑素基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素,能很好抑制血管内皮细胞的生长和增殖,为进一步开展肺癌基因治疗打下基础。     

沉默APE1对非小细胞肺癌细胞的放射敏感性的影响研究

目的 研究脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶-1（APE1）对非小细胞肺癌细胞放射敏感性的影响。方法 采用免疫组化染色检测手术标本切片（非小细胞肺癌组织20例及癌旁组织5例）中APE1的表达,Western blot与实时荧光定量（qRT）-PCR检测非小细胞肺癌细胞系（A549,H460,H1299）及肺正常上皮细胞系中APE1的表达;Western blot检测辐照A549与H460细胞0~6 Gy后APE1的表达;构建沉默APE1的A549与H460稳定细胞株后,Western blot检测其辐照6 Gy后APE1的蛋白表达;细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成率;CCK-8检测细胞增殖;细胞术流式检测细胞凋亡。结果 非小细胞肺癌组织及细胞系中APE1的表达明显上调;辐照能诱导非小细胞肺癌细胞APE1的表达,且表达随辐照剂量增高而上调;沉默APE1能有效地抑制辐照诱导A549与H460细胞中APE1的表达;成功构建沉默APE1的A459、H460稳定细胞株;沉默APE1联合辐照进一步抑制了非小细胞肺癌细胞克隆形成率、细胞增殖率,同时促进细胞凋亡（ PAPE1可增强非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。     

XAF1基因对胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响

目的探讨Ad5／F35腺病毒介导的X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1（XAFl）基因对胰腺癌细胞株SW1990增殖和凋亡的影响。方法构建和包装Ad5／F35-XAF1重组腺病毒并感染胰腺癌细胞SW1990（Ad5／F35-XAF1组）,设立对照病毒感染组（Ad5／F35-Null组）和空白组。运用RT—PCR技术和Western blotting分析对感染细胞进行鉴定。流式细胞仪检测细胞凋亡并分析细胞周期,TUNEL法测定细胞凋亡率;MTT法检测细胞增殖。结果Ad5／F35-XAF1组SW1990细胞XAF1mRNA和蛋白表达水平均明显上调。与空白对照组和Ad5／F35-Null组比较,Ad5／F35-XAF1组细胞凋亡率明显增加,增殖活性明显降低,G2／M期细胞比例显著增加,组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞SW1990后,能促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。     

RNA干扰抑制KM3细胞APE1蛋白表达对其增殖与凋亡的影响

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1)基因RNA干扰对KM3人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞APE1蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响,以期为转基因治疗多发性骨髓瘤提供实验依据.方法将构建的APE1 siRNA表达载体导人人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞,应用Western blot检测APE1蛋白表达的改变,并通过细胞增殖曲线、MTT法和流式细胞术、DNA片段化百分率检测观察靶细胞的增殖与凋亡.结果 Western blot分析表明APE1 siRNA表达载体使KM3细胞APE1蛋白表达下降,细胞生长曲线观察、MTT法检测显示,转染的KM3细胞生长受抑,流式细胞术和DNA片段化百分率检测观察到APE1 RNA干扰使靶细胞凋亡明显增加.结论 APE1 RNA干扰通过降低APE1蛋白表达,抑制KM3细胞生长和促进其凋亡.     

索拉非尼联合吉非替尼对人肺癌细胞株A549的生长抑制作用

目的探讨索拉非尼联合吉非替尼对肺癌细胞株A549增殖的抑制作用。方法用索拉非尼联合吉非替尼处理培养的肺癌细胞株A549,MTT法检测细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bec-lin1蛋白表达;加用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和两药联用,检测自噬和凋亡情况。结果索拉非尼与吉非替尼单药及联用均能抑制A549细胞生长,表现为时间-剂量依赖效应,两者具有协同作用;索拉非尼与吉非替尼联用使A549细胞的凋亡率显著升高,Beclin1蛋白表达增加;加用3-MA处理后,Beclin1蛋白表达减少,凋亡减少。结论索拉非尼联合吉非替尼对肺癌细胞株A549体外增殖的抑制作用具有协同效应,其机制与诱导自噬和凋亡两种途径相关。     

肺腺癌细胞A549 hnRNP B1基因RNA干扰的体外研究

目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.     

β-榄香烯对肺腺癌细胞增殖作用的影响

目的:探讨β-榄香烯对肺腺癌细胞的抗肿瘤作用及其机制。方法:使用RT-PCR和Western blot法检测β-榄香烯对肿瘤细胞中P53mRNA和蛋白表达的影响;同时使用差速离心法提取外泌体,利用电镜和Western blot法进行分析。通过转染P53siRNA构建P53下调细胞株。对BABL/c裸鼠肿瘤模型皮下注射A549细胞,探索体内环境下β-榄香烯对肿瘤生长的影响。结果:1通过siRNA技术构建P53下调细胞株,观察到β-榄香烯对A549细胞的作用依赖于P53的表达;2A549细胞源性的外泌体能够抑制肺癌细胞的增殖;3体内实验证实β-榄香烯通过上调P53表达和外泌体的释放实现抑制肿瘤生长的作用。结论:β-榄香烯通过调控P53的表达和外泌体的释放来影响肺癌细胞的增殖。     

miR-494对肺癌细胞株A549及SPCA1生长及侵袭的抑制作用

目的探讨miR-494对肺癌细胞增殖、侵袭的影响及分子机制。方法利用化学合成的miR-494mimics转染A549及SPCA1肺癌细胞株,通过MTT、Transwell小室迁移实验、Boyden小室侵袭实验等观察过表达miR-494后细胞迁移、侵袭能力及生长的变化;利用Western blot检测细胞周期、上皮间叶转变(EMT)标志物相关蛋白。结果 MTT法显示,与对照组比较,过表达miR-494组细胞生长速度减慢,差异有统计学意义(P<0.001)。Transwell及Boyden实验显示过表达组细胞穿过聚碳酸酯膜的数量少于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。Western blot结果显示,与对照组比较,过表达miR-494的A549和SPCA1细胞中,CCND1、N-CA、VIMENTIN表达下调。结论miR-494可能通过下调CCND1、VIMENTIN、N-CA对肺癌细胞株A549及SPCA1的增殖、迁移及侵袭起到抑制作用。     

APE1/Ref-1 siRNA抑制多发性骨髓瘤骨髓基质细胞IL-6及IL-8分泌的体外研究

目的 体外通过APE1/Ref-1 siRNA敲低多发性骨髓瘤骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)APE1/Ref-1的表达,观察BMSCs的增殖及分泌细胞因子IL-6、IL-8的变化,初步探讨BMSCs APE1/Ref-1表达的功能特点.方法 通过免疫细胞化学染色法定量榆测35例初治、11例复发/难治多发性骨髓瘤患者及10例正常人BMSCsAPE1/Ref-1的表达特点及其差异,经Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后,流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;ELISA法检测BMSCs分泌IL-6、IL-8的水平变化情况.结果 多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1蛋白阳性表达率显著高于正常BMSCs APE1/Ref-1蛋白阳性表达率(P<0.05),且多发性骨髓瘤BMSCs的APE1/Ref-1呈细胞核及核浆共间表达方式.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染敲低多发性骨髓瘤及正常BMSCs APE1/Ref-1的表达量呈进行性减少(P<0.01),同时发现APE1/Ref-1 siRNA对多发性骨髓瘤BMSCs抑制作用更明显.Adv5-APE1/Ref-1 siRNA感染BMSCs后对正常人及骨髓瘤患者BMSCs分泌细胞因子IL-6、IL-8的量有显著的抑制作用,特别是感染72 h后,骨髓瘤患者及正常人的BMSCs分泌IL-6[初治患者(246.29±46.51)pg/ml,复发/难治患者(365.09±75.25)pg/ml]、IL-8[初治患者(118.77±18.08)pg/ml,复发/难治患者(188.71±33.76)pg/ml]的量最低,与其他时段比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 多发性骨髓瘤BMscs APE1/Ref-1的表达特点不同于正常BMSCs,可能导致其功能差异;APE1/Ref-1 siRNA敲低了MM BMSCsAPE1/Ref-1的表达,同时明显抑制了其IL-6、IL-8的分泌,减少了对骨髓瘤细胞的促增殖和凋亡作用.     

RNA干扰骨髓基质细胞和/或骨髓瘤细胞APE1表达对共培养骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)及骨髓瘤细胞株U266 APE1表达对共培养的U266细胞增殖、凋亡的影响.方法 将构建的APE1 siRNA表达载体分别导入BMSCs及U266细胞中.Western blot法检测2种细胞中APE1蛋白表达;2株细胞经APE1 siRNA处理后采用Transwell插入式培养皿构建BMSCs与骨髓瘤细胞共培养模型,采用MTT法、Annexin V-PE/7-AAD双染法、RT-PCR分别检测U266细胞增殖、凋亡及细胞中IL-6/IL-8 mRNA表达水平.结果 APE1 siRNA 可明显降低BMSCs及U266细胞APE1蛋白表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);在APE1 siRNA同时处理BMSCs和U266细胞后的共培养体系中,U266细胞增殖抑制及细胞凋亡明显高于单一细胞APE1敲低组及APE1 siRNA末处理组(P＜0.01);U266细胞中IL-6及IL-8 mRNA表达水平亦降低(P＜0.01).结论 抑制APE1在BMSCs和/或骨髓瘤细胞株U266的表达,可明显抑制共培养体系中U266细胞的增殖活性并促进其凋亡.     

X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1抑制肝癌裸鼠移植瘤生长的研究

目的 研究X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1（XAF1)基因对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠荷瘤模型,每组5只裸鼠分别在瘤内分3点注射相同感染滴度的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、Ad5/F35-Null对照空病毒及等体积的磷酸缓冲液（PBS）,隔天注射1次,疗程2周。每3天测量各组裸鼠移植瘤的体积,观察Ad5/F35-XAF1组移植瘤的生长与其他两组的差异。原位末端标记TUNEL法检测移植瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测移植瘤中XAF1蛋白表达和微血管密度（MVD）。结果 与PBS组和Ad5/F35-Null组比较,瘤内注射Ad5/F35-XAF1组裸鼠移植瘤体积、质量和MVD显著减小（P<0.05或P<0.01）,而移植瘤细胞的凋亡指数和XAF1蛋白的表达率均明显增高（P<0.01）。结论 腺病毒介导XAF1基因可抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,可能与该基因诱导肝癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关。     

表达人IL-21的细胞因子诱导的杀伤细胞对裸鼠肝癌的治疗研究

目的 探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK细胞)作为人IL-21(hIL-21)基因的载体治疗肝癌的可行性.方法 构建携带hIL-21、CopGFP基因的质粒pDC759-hIL-21、pDC759-CopGFP并分别与pAd5、pAd5F35共转染HEK293细胞,包装表达hIL-21、CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒.分离培养CIK细胞并绘制生长曲线,将携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100、1 000)感染CIK细胞;将携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、20、50)感染SMMC-7721细胞48 h后检测hIL-21蛋白的表达;将携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100)感染CIK细胞48 h后检测hIL-21蛋白的表达.皮下注射SMMC-7721细胞致裸鼠成瘤,以表达hIL-21的CIK细胞治疗荷瘤裸鼠,评价疗效.结果 成功构建出用于Ad5、Ad5F35病毒的质粒;构建的质粒与pAd5、pAd5F35脂质体共转染HEK293细胞,包装出表达hIL-21及CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒.携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒对CIK细胞的感染实验表明Ad5F35腺病毒感染率更高;携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒对SMMC-7721细胞的感染实验表明hIL-21表达量差异无统计学意义;携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以50 MOI感染CIK细胞后hIL-21的表达量较高;动物实验统计分析说明表达hIL-21的CIK细胞对荷瘤裸鼠疗效较好.结论 hIL-21与CIK细胞在荷瘤小鼠体内联合发挥抗肿瘤作用.     

多发性骨髓瘤特异的APE1siRNA在KM3细胞中的转染与表达

目的观察APE1siRNA在KM3细胞内表达情况.方法将构建的MM特异APE1siRNA表达质粒pSilecer K-IE-IgP APE1siRNA与eGFP以脂质体共转染KM3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Western blot分析验证APE1siRNA在KM3细胞中的表达.结果 MM特异APE1siRNA表达质粒与eGFP共转染,转染效率约为38%～48%,且APE1siRNA转染细胞较对照组能有效敲除APE1基因表达.结论 APE1siRNA在KM3细胞中获得正确表达.     

嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间.方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs.用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况.结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性.MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达.MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力.结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月.本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据.     

siRNA和携带siRNA重组腺病毒抑制结肠癌移植瘤淋巴管生成的比较

目的研究RNA干扰抑制结肠癌移植瘤模型VEGF-C表达和抗肿瘤淋巴管生成的有效方法。方法建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型并随机分为3组（n=8）：腺病毒（Ad5F35-VEGF-C-siRNA-EGFP）组、siRNA组和PBS组,对肿瘤进行原位注射,记录各组肿瘤体积变化,免疫组织化学法检测肿瘤内微血管密度（MVD）和淋巴管密度（LVD）。结果VEGF-C干扰能抑制肿瘤生长,且腺病毒组比siRNA组生长更慢。同时免疫组化显示各组MVD值的差异无统计学意义（P〉0.05）,siRNA组、腺病毒组和PBS组相比,LVD值的差异有统计学意义（P〈0.05）,LVD值发生不同程度地降低,且腺病毒组降低更显著（P〈0.05）。结论病毒介导siRNA干扰VEGF-C的表达是抗肿瘤淋巴管生成的有效方法。     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。