幽门螺杆菌热休克蛋白60基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌热休克蛋白60（Hsp60)的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增Hsp60基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21（DE3）大肠杆菌中表达并通过动物实验研究其免疫原性。结果 克隆的Hsp60基因序列与Genbank公布的一致，Hsp60重组蛋白表达量占菌体总蛋白的27.2%，并可被幽门螺杆菌感染者血清所识别，用其免疫小鼠可产生抗该重组蛋白的抗体。结论 Hsp60有可能成为一种有效的疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌热休克蛋白60脂质体疫苗的制备及其免疫预防作用

目的 探讨制备脂质体包裹重组幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白60(Hsp60)口服疫苗的方法,并用Hp感染的小鼠模型评价其在预防Hp感染中的作用.方法 将PET-22(+)/Hsp60在BL21(DE3)大肠杆菌表达,Ni-NTA琼脂糖树脂纯化Hsp60重组蛋白,用薄膜分散法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的Hsp60重组蛋白口服疫苗,并用透射电镜测定其粒径.75只BALB/C小鼠分为5组,分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、Hsp60重组蛋白+霍乱霉素(CT)、脂质体包裹Hsp60重组蛋白、脂质体包裹Hsp60重组蛋白+CT,每周1次共次,末次攻击2周再用活Hp攻击3次,3周后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验、Hp的定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分.结果 可溶性表达产物占全菌总蛋白的27%,经纯化获得纯度为95%的重组蛋白,制备的脂质体粒径为(0.7±0.)μm.PBS组和空白脂质体组保护率均为0,而Hsp60重组蛋白+CT组、脂质体包裹Hsp60重组蛋白组、脂质体包裹Hsp60重组蛋白+CT组的保护率分别为73.3%、66.7%和86.7%,且均能使免疫小鼠胃粘膜Hp感染数目明显减少,炎症反应减轻.结论 口服脂质体能分地代替免疫佐剂,作为Hp疫苗的免疫佐剂,将具有广泛的应用前景.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及初步应用

目的　获取重组表达人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori ,Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位 ,并应用于临床诊断。方法　利用PCR技术扩增HpHspA基因 ,将其构建至PinPointTMXa 3载体中进行诱导表达 ,并对其产物进行SDS PAGE、免疫印迹等检测。同时 ,将纯化的重组蛋白结合ELISA方法对幽门螺杆菌感染患者清除治疗前后血清中的抗HspA抗体进行检测。结果　所克隆的HspADNA由 3 5 4个碱基组成 ,可编码 118个氨基酸残基的多肽 ,SDS PAGE和免疫印迹显示所表达的蛋白分子量约为 14× 10 3 ,并可与相应的抗血清发生特异反应 ;ELISA结果发现 ,消化性溃疡患者在清除治疗后早期只出现明显的抗HspA抗体滴度下降 ,而抗幽门螺杆菌抗体要在治疗后 6月才出现明显下降。结论　重组表达HspA为诊断、预防和治疗幽门螺杆菌的进一步研究奠定了重要实验基础     

幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.     

表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株，为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段，克隆入pET32a（＋），鉴定无误后，再亚克隆入大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pLA71，构建pLA71-omp载体，将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌，经卡那霉素筛选后，抽提质粒用PCR法鉴定，Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性，Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌一分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli／MS间进行穿梭，并在耻垢分枝杆菌中表达。     

编码hsp60和IL-2的幽门螺杆菌减毒沙门菌核酸疫苗

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)hsp60基因和细胞因子IL-2的核酸疫苗,体外转染COS-7细胞,并鉴定其表达蛋白的免疫原性,体内检测其免疫保护作用.方法:以H. pylori菌株基因组DNA为模板,PCR扩增hsp60基因,从pCIneo-IL-2扩增小鼠IL-2基因,检测hsp60及IL-2的核苷酸序列;通过酶切、连接反应把hsp60和IL-2同时克隆入pIRES;通过脂质体法将pIRES-hsp60-IL-2转染COS-7细胞,SDS-PAGE及Western 印迹法检测表达蛋白的免疫性.重组载体转化入LB5000,抽提质粒,再转化入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性.以该疫苗菌接种小鼠,4周后H. pylori攻击,再4周后鉴定感染状况.结果:成功扩增出长约1 640 bp的hsp60基因和510 bp的IL-2,测序结果表明扩增出的hsp60基因与H. pylori hsp60序列一致,IL-2序列和小鼠的IL-2序列一致.PCR和酶切鉴定结果证实hsp60和IL-2基因克隆入载体pIRES,成功构建了含hsp60基因和IL-2基因的幽门螺杆菌核酸疫苗pIRES-hsp60-IL-2,并且Western 印迹法检测到相对分子质量为60 000 hsp60蛋白和14 000的IL-2蛋白条带.体内实验显示pIRES-hsp60-IL-2及pIRES-hsp60疫苗接种组分别有79.9%、62.5%小鼠获免疫保护.结论:成功构建了编码hsp60和IL-2基因幽门螺杆菌减毒沙门核酸疫苗,体外实验验证了其免疫原性,体内实验证实其具有免疫保护性.     

高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株的构建

目的构建高效表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株。方法从幽门螺杆菌标准株NCTC11639中扩增出幽门螺杆菌黏附素基因Hp0410,克隆入穿梭质粒pMG36e中,通过电穿孔将重组质粒转入嗜酸乳杆菌,表达的目的蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与硝酸银染色及Western blotting鉴定,并检测重组质粒的稳定性。结果扩增的黏附素Hp0410基因与基因库公布的一致,构建的重组质粒成功转入嗜酸乳杆菌中,表达出分子量约34kD的目的蛋白,Western blotting证实该蛋白可被幽门螺杆菌感染患者血清所识别。重组质粒pMG36e-Hp0410在含有红霉素和不含有红霉素的环境下均稳定。结论成功构建了高效组成型表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的重组嗜酸乳杆菌菌株。     

口服幽门螺杆菌多价表位疫苗的构建及其免疫效果研究

目的 构建口服幽门螺杆菌多价表位疫苗CTB-HapA-UreA-UreB-CagA(CTB-HUUC),并初步研究其在BABL/c小鼠体内的免疫治疗效果.方法 文献查找幽门螺杆菌相关抗原的显性表位序列 HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561、CagA149-164、CagA196-217,通过 Linker 将其串联,并在 N 端引入分子内佐剂 CTB序列,构建重组质粒 pET28a(+)/ctB-hpaA-ureA-ureB-cagA〔pET28a(+)/ctB-HUUC〕.再将重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)中,IPTG进行诱导表达、层析纯化,获得高纯度的 CTB-HUUC 重组蛋白,并采用 Western Blot 对其进行鉴定.GM1-ELISA检测重组蛋白CTB-HUUC体外结合 GM1的能力.6周龄BABL/c小鼠,感染幽门螺杆菌1次/d,连续感染4次;末次感染后4周,灌胃CTB-HUUC重组蛋白200 μg/次,1次/周,连续免疫4次.末次免疫后2周,处死小鼠,取小鼠胃组织进行幽门螺杆菌培养计数.结果 成功获得高纯度的CTB-HUUC重组蛋白,Western blot检测CTB-HUUC可与抗幽门螺杆菌悉尼株(SS1株)小鼠血清及鼠抗 CTB 单抗产生特异性反应.GM1-ELISA检测重组蛋白CTB-HUUC体外可结合 GM1,具有良好的佐剂活性.CTB-HUUC组小鼠胃组织进行幽门螺杆菌培养计数结果为6.14×103CFU/g、CTB组为5.72×106CFU/g、PBS组为6.70×106CFU/g.结论 口服幽门螺杆菌多价表位疫苗CTB-HUUC对感染幽门螺杆菌的BABL/c小鼠具有显著的治疗效果.     

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合，克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况．为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应，设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因（lvgA）和热休克蛋白60基因（Hsp60），经琼脂糖电泳纯化回收，再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸，实现二基因的PCR水平融合，随后采用外引物进行新一轮扩增，扩得足量lvgA／Hsp60融合基因的PCR产物，继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒，转化宿主菌BL21，经PCR、酶切及测序鉴定后，IPTG诱导表达，产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA／Hsp60融合基因，构建了原核表达重组质粒pGlvgA／Hsp60，并检测到M约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合，构建了其原核表达重组质粒．并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础．     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.     

线粒体基质蛋白Hsp70、Hsp60的表达、纯化、鉴定及抗体制备

目的:建立有效的线粒体基质蛋白Hsp70、Hsp60原核细胞表达系统,获得纯度较高的Hsp70、Hsp60蛋白,并制备抗体.方法:以HeLa细胞cDNA为模板扩增成熟的hsp70、hsp60 DNA,插入pPRO-EX-HTb质粒,IPTG诱导B21 E.coli表达,Ni2 离子螯合树脂纯化蛋白,获取被免疫的兔抗血清,纯化后进行Western-blot鉴定.结果与结论:成功构建Hsp70、Hsp60高效原核表达系统并获得特异性较好的抗体,为进一步研究线粒体基质蛋白的功能奠定了基础.     

热休克蛋白10和热休克蛋白的60表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合

目的:表达、纯化热休克蛋白10(Hsp10)和热休克蛋白60(Hsp60),研究人类线粒体DNA转录因子A(TFAM)在体外与Hsp10,Hsp60间的相互交联作用。方法:使用Escherichia.Coli(E.coli)诱导表达含有6个组氨酸标记的Hsp10和Hsp60,镍离子鳌合树脂分离纯化后,体外分别与纯化TFAM共育,抗-TFAM抗体免疫沉淀,SDS-PAGE分离蛋白,CBB探测分析。结果:Hsp10可在体外与TFAM发生免疫共沉淀,Hsp60不能。结论:Hsp10可能为TFAM-复合体组分。     

梅毒螺旋体Hsp40蛋白的生物信息学分析及基因克隆

目的分析梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)Hsp40蛋白的生物学特性并克隆其基因。方法通过GenBank查到Hsp40蛋白的序列,利用生物信息学软件分析其生物学特性。根据Tp Hsp40基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增Hsp40基因,并把该DNA片段连接到pMD19-T载体,转化大肠杆菌后挑取阳性克隆采用PCR和DNA测序进行验证。结果 Tp Hsp40基因能够编码374个氨基酸的蛋白质,其分子量为40.1 k Da,无信号肽,呈亲水性。Swissmodel预测得到Tp Hsp40的三级结构与嗜热杆菌(Thermus thermophilus)Hsp40结构最接近。从Tp基因组中扩增得到1125 bp的Tp Hsp40基因并将其连接到pMD19-T载体。结论本文预测了梅毒螺旋体毒力因子Hsp40蛋白的结构和克隆得到Tp Hsp40基因。     

幽门螺杆菌热休克蛋白60脂质体疫苗的制备及其免疫预防作用

OBJECTIVE: To prepare oral liposome-encapsulated recombinant Helicobacter pylori (Hp) heat shock protein 60 (Hsp60) vaccine and investigate its effect against Hp infection in mice. METHODS: The recombinant vector PET-22(+)/Hsp60 was transformed into BL21(DE3) E.coli. The recombinant protein was purified with Ni-NTA agrose resin and the oral liposome-encapsulated vaccine was prepared with phosphatidyl choline and cholesterols using film method, with the size distribution of the folate liposomes measured by transmission electronic microscopy. BALB/c mice were divided into 5 groups and immunized by intragastric administration of PBS, liposome, rHsp60 plus choleratoxin (CT), liposome-encapsulated rHsp60, and liposome-encapsulated rHsp60 plus CT, respectively, given once a week for 4 weeks. All the mice were challenged by Hp for 3 times within two weeks following the last immunization and sacrificed 3 weeks after the last challenge. Hp detection was performed by fast urease test. Semi-quantitative assessment of the bacterial colonization density observation of the inflammation severity and gastric histopathology were carried out. RESULTS: The soluble expression product accounted for 27% of the total bacterial protein. The purity of recombinant fusion protein was about 95% after purification. The mean size of the folate liposomes was 0.7+/-0.4 mum. PBS or liposome alone showed no immune-enhancing effect, and rHsp60 plus CT, liposome-encapsulated rHsp60 and liposome-encapsulated rHsp60 plus CT had the protective rates against Hp infection of 73.3%, 66.7% and 86.7%, respectively. The latter 3 preparations effected significantly reduced Hp infection and alleviated the inflammation in the gastric mucosa of the mice challenged with Hp. CONCLUSION: The oral liposome may serve as a potential adjuvant for Hp vaccine in preventing Hp infection.     

小鼠睾丸缺血-再灌注损伤过程中Hsp60的变化及其作用

目的 观察小鼠睾丸扭转导致的缺血-再灌注损伤过程中Hsp60的变化及其抗凋亡作用.方法 制备小鼠睾丸的缺血-再灌注模型：小鼠睾丸逆转720°,造成缺血2 h,然后复位,分别对复位24 h、48 h、72 h的组织进行Hsp60 mRNA表达水平、免疫组化以及凋亡水平的检测.结果 检查显示Hsp60在小鼠睾丸的缺血-再灌注后表达高于正常水平,相应的细胞凋亡减少.结论 推测Hsp60在缺血状态应激高表达,暂时抑制细胞凋亡,保护机体以减少损伤.     

热休克蛋白60在高脂及高脂高糖大鼠睾丸中的表达及对生精细胞凋亡的影响

目的 探讨热休克蛋白60(Hsp60)在高脂及高脂高糖SD大鼠睾丸组织中的表达情况及对生精细胞凋亡的影响.方法 将雄性SD大鼠60只随机分成对照组15例、高脂组15例及高脂高糖组30例,对照组给予普通饲料喂养,高脂组给予高脂饲料喂养,24周后加入含0.2%丙硫氧嘧啶继续喂养;高脂高糖组给予高脂饲料喂养,24周后腹腔注射链脲佐菌素,所有大鼠均喂养36周.造模成功后取睾丸组织,用免疫组化法和免疫印迹试验分析检测大鼠睾丸组织中Hsp60表达情况,并检测组织中细胞凋亡情况.结果 对照组生精细胞数量多且按序逐层排列,管腔中央可见大量精子细胞,HSP60少量表达于次级精母细胞;高脂组及高脂高糖组生精细胞数量减少且排列紊乱,部分切片可观察到生精细胞脱落.免疫组化及免疫印迹试验结果均显示,高脂组及高脂高糖组Hsp60蛋白表达量高于对照组(P<0.05),而高脂组与高脂高糖组间比较差异无统计学意义(P>0.05).高脂组及高脂高糖组的生精细胞凋亡数量明显多于对照组,且高脂高糖组生精细胞凋亡数量多于高脂组(P<0.05).结论 高脂及高脂高糖大鼠睾丸生精细胞凋亡的发生可能与Hsp60密切相关.     

HSP70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测

目的：构建用于酵母双杂交系统的“诱饵”载体pGBKT7-Hsp70，并检测其是否具有自激活作用。方法：用PCR的方法从质粒pGBKT7-Hsp70中扩增出Hsp70基因片段，引入酶切位点EcoRⅠ，BamHⅠ，测序正确后，将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中，并检测pGBKT7-Hsp70在MATHMAK－ER GAL4 Two-Hybrid System3中的自激活作用。结果：成功构建了“诱饵”载体pGBKT7-Hsp70，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用。结论：pGBKT7-Hsp70可以用于酵母双杂交系统中，寻找与Hsp70相互作用的分子。