构建重组大鼠pEGFP-N1-IGF-1基因表达质粒

目的:构建胰岛素样生长因子1基因的真核表达质粒(pEGFP-N1-IGF-1),为基因治疗脊髓损伤提供前提。方法:实验于2005-04/06在上海基康生物公司实验室完成。应用反转录-聚合酶链反应方法从大鼠肝脏组织总RNA中提取并扩增胰岛素样生长因子1基因的全长cDNA,并将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1。结果:实验从大鼠肝脏组织中提取总RNA,以反转录-聚合酶链反应方法获取编码胰岛素样生长因子1基因的全序列cDNA。构建胰岛素样生长因子1cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实。结论:构建重组质粒pEGFP-N1-IGF-1成功,实验中将能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因融合在胰岛素样生长因子1基因的3'端,并以编码柔软肽段的核苷酸连接,即保留了胰岛素样生长因子1的神经营养活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达。     

重组pEGFP-N1-IGF-1质粒体内转染骨质疏松大鼠的可行性

背景:胰岛素样生长因子1水平的下降与骨质疏松密切相关,目前应用基因技术是骨质疏松等骨代谢疾病治疗的发展方向,但病毒载体可能引起严重免疫反应,质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1活体转染骨质疏松大鼠可能成为一种有效的治疗手段.目的:观察质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1转染骨质疏松大鼠中胰岛素样生长因子1的表达.方法:雌性SD大鼠随机分为假手术组、pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组.后2组予双侧卵巢切除.术后12周,3组依次给予生理盐水、pEGFP-N1载体和质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1分别复合脂质体转染.转染后48 h荧光活体成像及肝脏切片观察,定期测定血清胰岛素样生长因子1质量浓度.结果与结论:转染后pEGFP-N1组和pEGFP-N1-IGF-1组大鼠均可见全身大部出现明显荧光表达,以肝脏及尾部为著,肝脏切片镜下观察可见明显荧光表达.去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度显著降低(P＜0.05);pEGFP-N1-IGF-1转染使去卵巢大鼠血清胰岛素样生长因子1质量浓度明显升高(P＜0.05),而后随时间延长而逐渐降低(P＜0.05).结果证明质粒重组体pEGFP-N1-IGF-1能够在骨质疏松大鼠体内成功转染并表达胰岛素样生长因子1蛋白,为应用胰岛素样生长因子1基因治疗骨质疏松症提供了理论基础.     

重组pEGFP-N1-IGF-1体内转基因预处理对脊髓损伤后一氧化氮合酶活性的影响

目的:观察阳离子脂质体介导的重组pEGFP-N1-IGF-1体内转基因预处理对脊髓损伤后血清一氧化氮合酶及脊髓组织诱导型一氧化氮合酶影响,进一步探讨转基因治疗脊髓损伤的机制。方法:实验于2005-07/11在解放军第二军医大学动物实验中心完成。取54只雄性SD大鼠单纯随机分为3组:①生理盐水组(24只):采用脊髓内直接注射法,将2μL生理盐水 6μLTransfectamreagent共8μL注入T8～T10脊髓内,无下肢功能障碍者1周后按改良Nystr"m’s压迫法制作大鼠脊髓不完全损伤模型(压迫总质量35g,压迫时间5min)。②pEGFP-N1-IGF-1转基因组(24只):给药方法、部位、剂量以及造模方法与生理盐水组相同,但脊髓内注入6μLTransfectamreagent 2μg质粒pEGFP-N1-IGF-1。③正常组(6只):不损伤脊髓,不给药,作为正常对照。前2组损伤后1,4,8,24h、1,2周,取尾静脉血和损伤区域脊髓,测定血清一氧化氮合酶活性及局部脊髓组织诱导型一氧化氮合酶活性变化。结果:经补充后54只大鼠进入结果分析。①血清一氧化氮合酶活性:正常组为(305.4±52.0)μkat/L,其他2组在损伤后1～8h迅速升高,并于伤后24h达到高峰[pEGFP-N1-IGF-1转基因组:(522.6±60.3)μkat/L;生理盐水组:(757.0±83.7)μkat/L],其后逐渐降低,术后一两周仍维持在较高水平。pEGFP-N1-IGF-1转基因组各个时间点均低于生理盐水组(P<0.05,0.01)。②脊髓组织诱导型一氧化氮合酶活性:正常组为(72.5±17.3)μkat/g,其他2组在损伤后1～8h迅速升高,并于伤后24h达到高峰[pEGFP-N1-IGF-1转基因组:(140.2±24.2)μkat/g;生理盐水组:(207.2±36.8)μkat/g],其后逐渐降低,术后一两周仍维持在较高水平。pEGFP-N1-IGF-1转基因组各个时间点均低于生理盐水组(P<0.05,0.01)。结论:阳离子脂质体介导胰岛素样生长因子1基因转染预处理能够有效地下调大鼠一氧化氮合酶活性,特别是其可有效抑制诱导型一氧化氮合酶,从而减轻继发性损伤所致的神经组织的损害,侧面证明了胰岛素样生长因子1转基因治疗的可行性。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的:构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒,分析pcDNA3.1-hIGF-1体内转基因的可行性。方法:实验于2004-06/09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组,4只/组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3.1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中;模型对照组注射等剂量pcDNA3.1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果:实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果:琼脂糖电泳显示,扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果:酶切鉴定显示,重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果:基因转染1周后,胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组(48.2±5.3,29.3±4.2,23.8±8.3,P<0.01)。结论:阳离子脂质体介导pcDNA3.1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的：克隆大鼠神经营养因子4全长基因，构建真核细胞表达质粒。 方法：实验于2004—06／2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠，用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板，应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中，构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。 结果：提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带，聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带，测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致（M86742），说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。 结论：正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

肌腱愈合及粘连形成机制的研究：胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达

目的：探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法：组织块法培养原代肌腱细胞，体外重组真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1，并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞，反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达，ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1；RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA；ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2．873，P&;lt;0．05)。结论：重组的真核表达载体pcDNA3．1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。     

大鼠神经营养因子4基因克隆及表达载体的构建

目的:克隆大鼠神经营养因子4全长基因,构建真核细胞表达质粒。方法:实验于2004-06/2005-12在昆明医学院神经病学研究所完成。选用成年SD大鼠,用反转录聚合酶链反应以大鼠海马总RNA为模板,应用基因重组技术将大鼠神经营养因子4的全长基因克隆到真核表达载体pcDAN3中,构建重组表达质粒。用限制性内切酶酶切分析和DNA测序对重组质粒载体pcDNA3-神经营养因子4进行鉴定。结果:提取的总RNA电泳出现18S和28S两个条带,聚合酶链反应扩增目的基因为720bp的条带,测序结果为720bp。重组质粒的测序结果经比对与GeneBank上报道的序列一致(M86742),说明神经营养因子4基因已成功克隆至pcDNA3载体中。结论:正确的克隆了大鼠神经营养因子4基因全序列。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

胰岛素样生长因子1对痴呆模型大鼠学习记忆能力及突触素表达的影响

目的：观察胰岛素样生长因子1对痴呆模型大鼠学习记忆能力影响及其对突触素的保护作用。方法：实验于2004-03／2005—06在吉林大学第一医院神经内科实验室完成。实验动物选择Morris水迷宫学习正常的雄性三四个月龄的Wistar大鼠30只，随机分为痴呆治疗组、痴呆对照组和正常对照组，每组10只。采用切断成年Wistar大鼠双侧穹窿海马伞，建立隔一海马胆碱能系统损害的痴呆模型。痴呆模型制备1d后开始侧脑室给药，连续21d，痴呆治疗组给予胰岛素样生长因子110μL（4g／L），痴呆对照组则同时间给予生理盐水10μL。正常对照组不给予处理。利用水迷宫对大鼠学习、记忆能力进行测试，观察潜伏期和跨越平台次数；利用Y电迷宫观察其行为学改变，以尝试次数和再显次数分析指标。所有大鼠在建立模型后21d以40g／L多聚甲醛心脏灌注固定，取脑，连续冠状切片，利用免疫组化及图像分析测定大鼠脑内突触素的表达。每只动物取切片5张，以同张切片胼胝体的吸光度值作为背景，分别选取海马和额叶2个区域测定吸光度值，取其均值。组间比较采用t检验。结果：在实验过程中，痴呆治疗组和痴呆对照组各有1只大鼠死亡，其余动物全部进入结果分析。①痴呆治疗组大鼠的学习记忆成绩优于痴呆对照组，痴呆治疗组潜伏期明显低于痴呆对照组，差异有显著性[（31．02&;#177;2．65），（45．32&;#177;6．57）s，t=6．056，P〈0．01]；跨越平台次数明显高于痴呆对照组，差异有显著性[（4．36&;#177;1．02），（2．35&;#177;0．76）次，t=4．213，P〈0．01]；尝试次数明显低于痴呆对照组，差异有显著性[（18．67&;#177;1．86），（25．16&;#177;2．42）次，t=6．382,P〈0．01]；再显次数明显高于痴呆治疗组，差异有显著性[（6．78&;#177;0．53），（3．97&;#177;0．45）次，t=12．112,P〈0．01]②痴呆治疗组海马突触素的表达量与痴呆对照组相比明显增多，差异有显著性[（23．92&;#177;2．76），（10．95&;#177;3．05），t=9．460，P〈0．01]；额叶突触素的表达量与痴呆对照组相比也明显增多，差异有显著性[（17．69&;#177;2．34），（6．58&;#177;1．02），t=13．055，P〈0．01）。痴呆治疗组脑内突触素的表达量没有达到正常对照组水平（P〈0．01）结论：胰岛素样生长因子1对中枢胆碱能系统有保护作用，能改善学习记忆能力。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的：构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒，分析pcDNA3．1-hIGF-1体内转基因的町行性。方法：实验于2004—06／09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组，4只／组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3．1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中；模型对照组注射等剂量pcDNA3．1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果：实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果：琼脂糖电泳显示，扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果：酶切鉴定显示，重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hOGF-1所含的IGF—1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果：基因转染1周后，胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组（48．2&;#177;5.3,29．3&;#177;4．2，23．8&;#177;8．3，P〈0．01）。结论：阳离子脂质体介导pcDNA3．1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

背景:有研究表明心脏转录因子GATA结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系,但其机制不明,而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道.目的:构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒.方法:对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列,将真核表达载体pCMV-Myc和GATA4基因在双酶切后用T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4,转化至大肠杆菌,提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定.结果与结论:实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb的目的片段,聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列,证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒.     

小鼠血管紧张素转化酶2基因表达型载体的构建及体外表达

背景:通过转基因疗法使血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme,ACE2)过度表达来治疗心血管病是当前ACE2研究的趋势,而构建含ACE2基因的载体则能为该研究方法提供工具.目的:构建含小鼠血管紧张素转化酶2基因的真核表达载体,并验证其蛋白的表达.方法:采用RT-PCR的方法从C57小鼠肾脏扩增出ACE2基因全长cDNA序列,并通过酶切连接和转化等分子生物学方法将其定向克隆至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,构建小鼠ACE2基因的真核表达载体pm-ACE2,并通过酶切及测序鉴定.通过脂质体转染法将所构建的pm-ACE2转染COS7细胞,并利用Western blot检测COS7细胞中ACE2蛋白的表达.结果与结论:通过测序并与GeneBank上的小鼠血管紧张素转化酶2序列(NM_27286.3)比对,证实实验成功克隆小鼠ACE2基因全长cDNA至载体pcDNA3.1/Hygro(+)上,测序结果提示存在3处同义突变;所构建的pm-ACE2在真核细胞中具有ACE2蛋白的表达.结果提示实验成功构建了小鼠ACE2基因真核表达载体,此载体具有表达ACE2蛋白的功能.     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤组织中的表达

目的：构建单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）基因重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达。方法：实验于2003～07／12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室进行。在原核表达质粒pUChHyTk基础上，利用分子克隆技术，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1／HSV—tk。取20只Wistar大鼠，全麻后背部浸入95℃水浴锅中，烫伤12s，造成30％Ⅲ度烫伤，烫伤后随机分为两组（n=10）：①pcDNA3．1／tk组：烫伤后当天及第1，2，3，4周后于大鼠左后背部创面边缘（距创面边缘0．5cm）皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL[3．6μg pcDNA3．1／tk（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水】。②pcDNA3．1组：注射时间和方法同前，脂质体和质粒混合物为3．0μg pcDNA3．1（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠，取注射点附近皮肤，用反转录-聚合酶链反应法检测HSV—tk基因的表达。结果：20只大鼠全部进入结果分析。大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致，DNA测序结果表明tk基因已正确插入到pcDNA3．1质粒，说明了重组真核表达载体pcDNA3.1／HSV—tk已成功构建。反转录-聚合酶链反应结果显示脂质体介导的HSV—tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达。结论：应用分子克隆技术成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并在烫伤大鼠皮肤中得到了阳性表达。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤组织中的表达

目的:构建单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk,并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达。方法:实验于2003-07/12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室进行。在原核表达质粒pUChHyTk基础上,利用分子克隆技术,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/HSV-tk。取20只Wistar大鼠,全麻后背部浸入95℃水浴锅中,烫伤12s,造成30%Ⅲ度烫伤,烫伤后随机分为两组(n=10):①pcDNA3.1/tk组:烫伤后当天及第1,2,3,4周后于大鼠左后背部创面边缘(距创面边缘0.5cm)皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL眼3.6μgpcDNA3.1/tk(2μL) 10μL脂质体 180μL生理盐水演。②pcDNA3.1组:注射时间和方法同前,脂质体和质粒混合物为3.0μgpcDNA3.1(2μL) 10μL脂质体 180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠,取注射点附近皮肤,用反转录-聚合酶链反应法检测HSV-tk基因的表达。结果:20只大鼠全部进入结果分析。大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致,DNA测序结果表明tk基因已正确插入到pcDNA3.1质粒,说明了重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk已成功构建。反转录-聚合酶链反应结果显示脂质体介导的HSV-tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达。结论:应用分子克隆技术成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3.1/HSV-tk,并在烫伤大鼠皮肤中得到了阳性表达。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16.1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达.方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4 DNA Ligase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP.重组质粒经酶切及测序鉴定.将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果.结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达.结论:成功构建真核表达质粒DENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制.     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。