超低温冷冻保存后同种异体神经移植的实验研究

目的　探索大鼠同种异体神经移植的可行性。方法　取Wistar大鼠坐骨神经 ,经超低温冷冻保存后移植于SD大鼠坐骨神经缺损处。分成超低温冷冻同种神经移植组 (A)、新鲜同种神经移植组(B)、及自体神经移植组 (C)。 3组均在术后 3、8、12、16周行大体观察 ,检测形态学、电生理变化及血清IL 2、TNF水平。结果　A、C组的腓肠肌萎缩 ;足无明显畸形 ,趾无缺损、无溃疡。B组的腓肠肌萎缩 ;足部溃疡伴趾部分缺损。A、C组在术后 8周刺激神经移植段近端有动作电位出现 ,B组在术后 12周出现。A组动作电位的波幅较B组高。血清IL 2 ,C组与B组差别有显著性 (P <0 .0 5 ) ,A组与C组比较差别无显著性 (P >0 .0 5 )。光镜下A组空泡变性、炎性细胞浸润少。电镜下见髓鞘厚薄基本相同 ,轴突密度高 ,雪旺细胞发育较完善 ,明显优于B组。结论　超低温冷冻保存能降低同种异体神经的抗原性 ,在不用免疫抑制剂情况下 ,动物用同种异体神经移植是可行的     

经雷公藤预处理大鼠异体神经移植后早期组织形态及免疫学观察

目的 观察经雷公藤预处理大鼠异体神经移植后髓鞘损伤程度及急性期免疫排斥反应,探讨雷公藤早期免疫抑制作用及合适用药浓度. 方法取60只3月龄雄性SD大鼠制备右侧坐骨神经干缺损模型,随机分为A、B、C、D、E组5组(n=12).取18只3月龄雄性Wistar大鼠,切取双侧坐骨神经干约15 mm,置入含200、400、800 mg/L雷公藤多甙细胞保存液(各浓度组浸泡12条神经),4℃下浸泡24 h,作为A、B、C组神经修复供体,修复神经缺损;另取6只3月龄Wistar大鼠,切取12条新鲜坐骨神经桥接于D组神经缺损处;E组将切下的自体坐骨神经立即行原位缝合.术后不同时间对移植神经行大体、光镜、电镜观察,检测髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)含量变化及免疫组织化学分析移植物CD4 、CD8 T细胞入侵情况. 结果 术后1周,A、B、C组神经纤维形态及结构较完整,炎性细胞浸润程度较D组轻;术后1、2、4周,A、B、C组组织形态学观察结果 相似,移植神经片段外形及结构清晰,与周围结缔组织粘连均较D组轻;术后48h及1、2、4周,各组均有不同程度髓鞘损伤,各时间点坐骨神经MBP含量B组最接近E组,两组差异无统计学意义(P＞0.05).术后1、4周,A、B、C组CD4 ,CD8 分子的IA值与D组比较,差异均有统计学意义(p＜0.05). 结论 雷公藤能有效降低异体神经移植术后早期急性排斥反应,对髓鞘发挥一定的保护作用.     

化学去细胞同种异体神经复合缓释神经生长因子修复周围神经缺损

目的 探讨化学去细胞异体神经复合缓释神经生长因子(nerve growth factor,NGF)修复周围神经缺损的效果. 方法采用药物微球技术制备NGF微球,与生物纤维蛋白胶混合形成NGF复合缓释制剂.取健康雄性SD大鼠20只,体重280～300 g,制备化学去细胞异体神经.取健康雄性Wismr大鼠52只,体重250～300 g,制备大鼠左侧世骨神经10 mm缺损模型.根据修复缺损材料不同,随机分成4组(n=13):自体神经移植组(A组)、化学去细胞异体神经移植加NGF复合缓释制剂组(B组)、化学去细胞异体神经移植组(C组)和化学去细胞同种异体神经移植和纤维蛋白胶组(D组).右侧不作处理作为空白埘照组.术后行大体观察;术后2周测鼍神经轴突生长距离;术后16周行电生理检测,计算术侧坐骨神经运动传导速度恢复率、术侧小腿三头肌收缩力恢复率及湿重恢复率,并行移植神经吻合中段HE和半薄切片甲苯胺蓝染色观察. 结果 所有动物均存活至实验完成,切口愈合良好.术后2周A组神经再生距离较其余3组长(P＜0.05),B组优于C、D组(P＜0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).术后16周,A、B、C、D组术侧坐骨神经运动传导速度恢复率分别为73.37%±7.82%、70.39%±8.45%、53.51%±6.31%、55.28%±5.37%;A、B组与C、D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).A、B、C、D组术侧小腿三头肌收缩力恢复率分别为85.33%±5.59%、69.79%±5.31%、64.46%±8.49%、63.35%±6.40%:A组与B、C、D组比较筹异有统计学意义(P＜0.05),B、C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).A、B、C、D组术侧小腿三头肌湿重恢复率分别为62.54%±8.25%、53.73%±4.56%、46.37%±5.68%、45.78%±7.14%;A组与B、C、D组比较筹异有统计学意义(P＜0.05),B组与C、D组比较差异有统计学意义(P＜0.05),C、D组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).组织学图像分析示B组有髓神经纤维数量、轴突直径及髓鞘厚度均优于C、D组(P＜0.05),B组轴突直径小于A组(P＜0.05). 结论 复合缓释NGF的化学去细胞同种异体神经能满意修复一定长度的周围神经缺损,是一种有效的周围神经组织工程修复材料.     

绿茶多酚保存同种异体神经移植体的实验研究

[目的]研究绿茶多酚溶液保存的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.[方法] 48只成年雄性Wista大鼠,随机分为4组,每组12只,将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm 处切除1.0 cm, 神经缺损分别用4种移植物桥接.A组:自体神经移植;B组:新鲜异体神经移植;C组:经冷冻处理的异体神经移植;D组:用绿茶多酚保存的异体神经移植.术后6、12周通过大体观察、电生理学检查、组织学观察、透射电镜观察、图像分析与定量学检测评价各组修复神经缺损的效果.[结果]A、D组间差异无统计学意义(P＞0.05),A组、D组的各项指标均优于B组、C组(P＜0.05或P＜0.01).[结论]绿茶多酚溶液保存的同种异体神经是良好的神经移植替代材料.     

输血对带血管异体关节移植后排斥反应影响的实验研究

目的观察术前输血对冷冻保存带血管异体关节移植后排斥反应的作用.方法40只SD大鼠随机分成4组Ⅰ组、冷冻保存异体移植;Ⅱ组,冷冻保存异体移植术前1周输血1 m1;Ⅲ组,冷冻保存异体移植术后应用环孢素A(CyA);Ⅳ组,冷冻异体移植术前1周输血1 ml,术后应用CyA.术后行血管造影,取血测定IL-2活性及T细胞亚群(CD4/CD8)的变化,并对关节行组织学检查.结果各组通畅率差异无显著性(P＞0.05).IL-2及CD4/CD8组织学评分Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅳ组差异无显著性(P＞0.05),而Ⅰ、Ⅱ组与Ⅲ、Ⅳ组间差异均有显著性(P＜0.01).结论术前少量输血对冷冻保存带血管异体关节移植后的排斥反应无抑制作用.术前少量输血术后应用CyA在抑制冷冻保存带血管的鼠异体关节移植后排斥反应方面无协同作用.     

深低温冷存的吻合血管同种异体长骨移植的实验研究

目的：探讨深低温冷存的吻合血管异体长骨治疗大块骨缺损的效果。方法：32只兔随机分成3组：A组12只，用深低温冷存的吻合血管作异体骨移植；B组12只，深低温冷存的吻合血管异体移植术后4周用免疫抑制剂环孢素A（Cyclosporine A CsA);C组8只作新鲜的吻合血管异体骨移植。术后2、4、8、12周摄X线片，第3周取外周血栓测自发性淋巴母细胞生成率，第8周取外周血检测白细胞介素2（IL－2），并于12周通过灌注墨汁等检测吻合血管的通畅情况，并对移植骨进行组织学检测。结果：A、B2组术后12周两端可达骨性连接（愈合），而C组仅1例近端达骨连接且明显延迟。术后3周A、B2组自发性淋巴母细胞生成与未移植兔比值均＜2。术后8周外周血IL－2活性，C组最高，A组次之，B组最低，且任意2组之间均有显著性差异（P＜0．01）。术后12周，A、B2组血管通畅率无显著性差异（P＞0．05）。组织切片中可见移植骨与受区两端有骨小梁连接。结论：深低温冷存吻合血管异体长骨可修复大块骨缺损；深低温冷存和CsA可协同抑制吻合血管异体长骨移植的排斥反应。     

人参皂甙Rb1对玻璃化保存坐骨神经异体移植后神经再生的影响

[目的]探讨人参皂甙Rb1(Ginsenoside Rb1,G-Rb1)对大鼠坐骨神经玻璃化保存及异体移植后神经再生的影响.[方法] Wistar大鼠坐骨神经在0、50、100、200 μg·L-1 G-Rb1玻璃化液(A、B、C、D组)中,-20℃保存4周,透射电镜观察超微结构,TUNEL法检测细胞凋亡.用玻璃化保存后的坐骨神经修复对应组SD大鼠(A’、B’、C’、D’组)坐骨神经10 mm缺损.术后4、8、14周坐骨神经功能指数观察,术后16周电生理检测、再生神经组织学观察及靶肌肉运动终板观察.[结果]坐骨神经玻璃化保存4周后,A组神经脱髓鞘严重,施万细胞质膜和基底膜破坏,B、C、D组髓鞘轻微变性,施万细胞质膜和基底膜保持完整;细胞凋亡B、C、D组轻于A组,C、D组轻于B组(P＜0.05),C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).术后不同时间坐骨神经功能指数,16周运动神经传导速度、动作电位潜伏期及波幅,运动终板数量、面积、着色,B’、C’、D’组与A’组间,C’、D’组与B’组间,差异均有统计学意义(P＜0.05),而C’、D’组间差异无统计学意义(P＞0.05).透射电镜显示,A’、B’组再生有髓神经纤维较少、髓鞘较薄,结缔组织增生明显,C’、D’组再生有髓神经纤维较多、髓鞘厚,无明显结缔组织增生.[结论] G-Rb1对玻璃化保存大鼠坐骨神经具有保护作用,并能促进异体移植后神经再生.     

深低温冷冻技术对带血管同种异体骨移植抗原性作用的实验研究

[目的]探讨深低温冷冻技术对带血管同种异体骨移植物抗原性的影响,观察移植骨的吻合血管通畅率和骨连接情况,了解免疫抑制剂的用量。[方法]健康成年新西兰白兔48只,随机取16只作供体,32只作受体,分为5组。A组:8只,深低温冷存的带肱血管的异体桡骨段移植,手术后4周加用CsA(每天10 mg/kg);B组:8只,深低温冷存的带肱血管的异体桡骨段移植,手术后4周加用CsA(每天5 mg/kg);C组:8只,深低温冷存的带肱血管的异体桡骨段移植,手术后4周加用CsA(每天2 mg/kg);D组:8只,深低温冷存的带肱血管的异体桡骨段移植;E组:16只供体兔取移植骨段后继续喂养4周,作为免疫学检测,无移植对照组。术后观察吻合血管通畅率,术后7 d血清IFN-γ水平检测,术后2、4、8、12周各组动物X线检测,术后12周移植骨组织学检查。[结果]A、B组之间血清IFN-γ水平无显著差异,A、B组血清IFN-γ水平低于C组。[结论]深低温冷冻技术降低了带血管同种异体骨移植物的抗原性,移植后显著降低器官的移植排斥反应,保证吻合血管的通畅,移植骨的存活,加快骨连接,减少免疫抑制剂的用量。     

超低温冷冻保存后同种异体动脉移植的实验研究

目的　采用经超低温 (-196°)冷冻保存的同种异体动脉对大鼠行动脉移植 ,探索其形态学及免疫学方面的变化。方法　取Wistar大鼠股动脉 ,经超低温冷冻保存后行血管细胞培养及动脉移植 ;分超低温冷冻动脉移植组和自体动脉移植组。于移植后 1、2、4、8、12周 5个时间点观察动脉通畅率 ,并取材作动脉细胞存活率及组织学检测。结果　经超低温冷冻保存的动脉细胞存活率为 92 % ,比正常下降3 %。血管通畅率两组无明显差异。超低温冷冻保存的动脉复苏后 ,其外膜层正常 ,平滑肌细胞保存完整 ,细胞器正常。结论　超低温冷冻保存能降低同种异体动脉的抗原性 ,大鼠在不用免疫抑制剂的情况下作同种异体动脉移植是可行的     

辐照和绿茶多酚处理同种异体神经移植体的实验研究

[目的]比较经绿茶多酚溶液及辐照预处理的同种异体神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.[方法] 48只成年雄性Wista大鼠,将坐骨神经在梨状肌孔下5 mm处切除1.0 cm,随机分为4组,每组12只,神经缺损分别用4种移植物桥接.A组:自体神经移植;B组:新鲜异体神经移植;C组:经辐照处理的异体神经移植;D组:绿茶多酚溶液保存的异体神经移植.术后6、12周通过大体、电生理学、组织学、透射电镜观察评价各组修复神经缺损的效果.[结果]A、D组间差异无统计学意义,A、D组的各项指标均优于B、C组.[结论]大鼠坐骨神经缺损模型中,绿茶多酚溶液保存的同种异体神经是良好的神经移植替代材料,移植后神经再生情况优于辐照预处理的异体神经.     

吻合血管同种异体骨移植后存活状况研究

目的报道吻合血管同种异体骨移植术后不同时段存活状况。方法建立吻合血管同种异体股骨干移植动物模型，在术后不同时段进行活体解剖，观察血管的通畅度．并切取移植骨进行组织学、电镜及SDH染色检测。结果术后4周对照组血管基本完全闭塞，而实验组术后血管保持通畅。组织学检查显示对照组术后移植骨骨陷窝内骨细胞缺失，哈弗斯管内血管亦消失；而实验组术后骨陷窝内始终有骨细胞充填。电镜表现为对照组术后移植骨出现骨细胞核浓缩．核碎裂，直至骨陷窝内骨细胞丢失；实验组术后骨细胞超微结构正常、对照组术后2周．骨组织SDH染色已无蓝染的骨细胞，而实验组术后可见同心圆排列蓝染的骨细胞。结论在免疫调控下，吻合血管的同种异体骨移植术后供体始终保持活力状态。     

直径2mm以下同种异体血管移植的实验研究

目的：探讨直径2mm以下同种异体血管移植的可行性。方法：随机选30只新西兰兔分成甲乙2组，每组15只。甲组移植低温贮存的同种异体股动脉15条，乙组采用移植自体动脉15条。结果：甲乙2组即刻通畅率分别为100％，术后5周～10个月内甲组通畅率86．1％，乙组为80％。2组组织学变化类似，无明显排异反应。结论：低温贮存的同种异体血管可做血管移植的代用品，而且取材方便，有一定的实用性。     

Neo-Angiogenesis,Transplant Viability,and Molecular Analyses of Vascularized Bone Allotransplantation Surgery in a Large Animal Model

Vascularized composite allotransplantation of bone is a possible alternative treatment for large osseous defects but requires life-long immunosuppression. Surgical induction of autogenous neo-angiogenic circulation maintains transplant viability without this requirement, providing encouraging results in small animal models [1–3]. A preliminary feasibility study in a swine tibia model demonstrated similar findings [4, 5]. This study in swine tibial allotransplantation tests its applicability in a pre-clinical large animal model. Previously, we have demonstrated bone vascularized composite allotransplantation (VCA) survival was not the result of induction of tolerance nor an incompetent immune system [1]. Fourteen tibia vascularized bone allotransplants were microsurgically transplanted orthotopically to reconstruct size-matched tibial defects in Yucatan miniature swine. Two weeks of immunosuppression was used to maintain allotransplant pedicle patency during angiogenesis from a simultaneously implanted autogenous arteriovenous bundle. The implanted arteriovenous bundle was patent in group 1 and ligated in group 2 (a neo-angiogenesis control). At twenty weeks, we quantified the neo-angiogenesis and correlated it with transplant viability, bone remodeling, and gene expression. All patent arteriovenous bundles maintained patency throughout the survival period. Micro-angiographic, osteocyte cell count and bone remodeling parameters were significantly higher than controls due to the formation of a neo-angiogenic autogenous circulation. Analysis of gene expression found maintained osteoblastic and osteoclastic activity as well as a significant increase in expression of endothelial growth factor-like 6 (EGFL-6) in the patent arteriovenous bundle group. Vascularized composite allotransplants of swine tibia maintained viability and actively remodeled over 20 weeks when short-term immunosuppression is combined with simultaneous autogenous neo-angiogenesis. © 2019 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 38:288-296, 2020     

组织工程肌腱低温贮存的初步研究

目的　研究深低温冻存组织工程肌腱适宜的抗冻剂。方法　选用近交系裸小鼠 6 4只 ,4只为空白对照组 ,6 0只左侧为实验组 ,右侧为对照组。将第 5 4代转化人胚肌腱细胞与碳纤维和聚羟基乙酸编织带体外复合培养构建组织工程肌腱。组织工程肌腱制备完成后在 1、2、3和 4号抗冻剂保护下液氮冻存 2个月。快速复温后植入实验组修复跟腱缺损 ,缺损长度为 5 mm,占裸鼠跟腱总长 6 5 .7% ;对照组组织工程肌腱不经冻存处理。术后 2、4、6、8和 12周后各组取出 ,观察形态学、组织学和免疫组织化学变化 ,并行短串联重复位点检测。结果　实验组体内植入的肌腱细胞形态随时间增加而逐渐恢复正常 ,合成胶原能力逐渐增强 ,12周后仍有肌腱细胞存活并具有分泌 I型胶原功能 ,与对照组差异逐渐减小。经 1号抗冻剂保存的肌腱细胞线粒体空泡减少 ,肌腱细胞排列整齐 ,胶原纤维增粗并连接。结论　 1号抗冻剂可以在深低温下保护组织工程肌腱     

周围神经端侧动脉套接后神经再生的研究

目的研究周围神经端侧动脉套接后神经再生的可能性及其特点. 方法取SD大鼠75只,在股骨中下段切断腓神经,将近断端逆转90度包埋于肌肉中.随机分为5组.A组:将截取的左颈总动脉套接于右侧正常胫神经侧方与腓总神经远端2 mm距离之间,缝合部胫神经外膜不予切除;B组:在胫神经套接部外膜开窗1.0 mm;C组:腓总神经切断14天后再予动脉套接,余同B组;D组:同B组,且于动脉套接部注入神经生长因子(neural growth factor, NGF)1 ml;E组:将腓总神经远端以端侧缝合形式直接缝合于胫神经的一侧,外膜开窗1.0 mm.术后4、8和12周分别行组织学、电镜和神经纤维计数等检查. 结果 4周时C、D及E组周边区域有神经纤维轴突和髓鞘再生,A组则无神经纤维生长; 8周时C、D及E组再生神经纤维较B组多,E组神经纤维较C、D组多,差异有统计学意义(P<0.05); 12周时C、D及E组神经纤维多于B组,差异有统计学意义(P<0.05);C组及D组有较丰富的神经再生,与神经端侧直接吻合的E组差异无统计学意义(P>0.05). 结论神经端侧2 mm距离动脉套接可作为修复周围神经损伤的一种可行方法.     

转化生长因子β1质粒联合反复冻融移植物减轻大鼠神经移植后的排斥反应

目的 探讨局部注射含转化生长因子β1(TGF-β1)基因的质粒联合预先反复冻融处理移植神经对大鼠异体神经移植后排斥反应的影响.方法 SD大鼠分为4组进行实验,每组20只.TGF-β1组大鼠移植Wistar大鼠的冷冻坐骨神经,局部注射含TGF-β1基因的质粒;空质粒组大鼠移植Wistar大鼠的冷冻坐骨神经,注射空质粒;新鲜异体神经移植组大鼠接受Wistar大鼠的新鲜坐骨神经移植,不注射质粒;自体移植组SD大鼠移植自体的冷冻坐骨神经,不注射质粒.移植后用Western印迹法检查移植神经中TGF-β1的表达,并进行混合淋巴细胞反应(MLC),测量运动神经的传导速度.各组移植神经样本分别在光镜和投射电镜下进行观察.结果 TGF-β1组中TGF-β1的表达明显较高.移植后12周时,自体移植组、TGF-β1组、空质粒组和新鲜异体神经移植组的MLC结果(吸光度值)分别为0.312±0.009、0.213±0.006、0.521±0.018和0.928±0.032.TGF-β1组各个时间点的运动神经传导速度均高于空质粒组和新鲜异体神经移植组,TGF-β1组与自体神经移植组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).光镜下可见,TGF-β1组的神经纤维结构破坏不明显.结论 局部注射含TGF-β1基因的质粒联合反复冻融处理异体移植神经可以减轻神经移植后的排斥反应.     

低温保存的组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的探讨低温保存的组织工程骨修复骨缺损的能力及低温保存的可行性。方法将人源性生物衍生骨材料复合成骨细胞构建的组织工程骨,在4℃和-196℃的温度环境中保存3个月和6个月,同时以未行低温保存的组织工程骨和生物衍生骨材料作为对照,分别修复实验兔桡骨的长段骨缺损。80只成年日本大耳白兔,随机分为4个实验组(左前肢植入材料):A3组:组织工程骨在4℃保存3个月;A6组:组织工程骨在4℃保存6个月;B3组:组织工程骨在-196℃保存3个月;B6组:组织工程骨在-196℃保存6个月。2个对照组(右前肢植入材料):C组:组织工程骨未行低温保存;D组:单纯生物衍生骨材料。于术后2、4、6和12周行大体和组织学观察,并于6周和12周行X线片检查和生物力学检测。结果术后大体观察,A3、A6、B3、B6和C组间无显著差异,D组骨痂少且断端更为明显。各时间点组织学观察,A3、A6、B3、B6和C组植入材料周围胶原及骨痂均较D组明显,术后12周组织学评分,D组与其它各组比较P值<0.05。X线片示D组植入材料皮质骨无明显变化,骨痂较少;余各组12周植入材料与自体骨融合,髓腔开通,骨折线消失,塑形好。生物力学检测D组与其它各组比较P值<0.05。结论以4℃和-196℃保存方法能有效保存组织工程骨,对修复骨缺损有明显效果,这一方法适宜推广应用。     

异体动脉移植的实验研究与临床应用

目的通过实验及临床应用结果，证实经深低温冷冻处理的动脉是一种修复动脉缺损的新材料。方法将５０只北京大耳白兔随机分为４组：Ａ组：提供修复的异体股动脉组；Ｂ组：深低温冷冻异体动脉移植组；Ｃ组：未经处理的异体动脉移植组；Ｄ组：自体动脉移植组。术后进行组织免疫学、组织形态学、血管通畅率等观察。结果经深低温冷冻处理动脉组，其血管组织抗原性明显下降，组织生物活性依然存在，血管内皮细胞修复能力较强，移植通畅率与自体动脉移植组相同。临床应用其修复上肢尺、桡动脉缺损９例，移植血管平均长度１２ｃｍ。术后随访４～２６个月，平均１８个月。９例移植血管均无排斥反应，伤口Ⅰ期愈合。经远红外线及超声波检测，血管通畅率为１００％。结论异体动脉经深低温冷冻处理后，可用于临床作为修复肢体血管缺损的生物性材料。