4E-BP1?p70S6K 在RAD001 抑制胃癌MKN-28?N-87细胞生长中作用的实验研究

目的:探讨真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)、核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶p70S6K在RAD001抑制胃癌MKN-28、N-87细胞生长中的作用.方法:体外培养人胃癌MKN-28、N-87细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术、Westem-blot检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布及p70S6k、4E-BP1蛋白表达及磷酸化情况.结果:细胞计数结果显示RAD001作用于胃癌细胞株MKN-28,N-87 24 h即开始出现对细胞生长的抑制作用,随着作用时间延长至48、72 h,抑制作用逐渐增强.流式细胞术结果显示RAD001作用24 h后MKN-28、N-87细胞株细胞周期发生改变,停滞在G0～G1期细胞比例增加,在实验中显示细胞系N87对于RAD001作用相对敏感.Western-blot结果显示RAD001作用24 h后MKN-28、N-87的4E-BP1和p70S6K表达下降,同时去磷酸化.结论:RAD001是通过抑制mTOR的活性,进而阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节着细胞周期以发挥抑制胃癌细胞生长的作用.     

RAD001对胃癌细胞株MKN 28、N 87生长的实验研究

目的探讨RAD001作用于胃癌细胞株MKN 28、N 87后细胞生长的影响及其作用机制。方法体外培养胃癌MKN 28、N 87细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术、Western blot电泳检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布及mTOR、p70S6K、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果细胞计数结果显示RAD001作用24?h即开始出现对细胞生长的抑制作用,作用具有时间依赖性。流式细胞术结果显示RAD001作用后两细胞株细胞周期均发生改变,停滞在G0 G1期细胞比例增加,作用亦具有时间依赖性,其中N 87相对敏感。Western blot结果显示RAD001作用24?h后两细胞株mTOR、p70S6K及 phosphate mTOR蛋白表达无改变,MKN 28 S6表达下降,phosphate p70S6K表达下调,phosphate S6表达缺失;N 87 S6无明显变化,phosphate p70S6K表达下调,phosphate S6表达明显下降。结论RAD001通过与mTOR的FRB相结合,从而抑制mTOR所调节的下游p70S6K S6蛋白通路,阻断了p70S6K及S6蛋白的磷酸化和蛋白质翻译进而调节着细胞周期以发挥抑制胃癌细胞生长的作用。     

雷帕霉素、RAD001抑制胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的实验研究

目的探讨雷帕霉素（rapamycin）、RAD001（everolimus）对胃癌细胞株MKN-28、MKN-45细胞生长的影响,并对其机制进行初步探讨。方法体外培养人胃癌MKN-28、MKN-45细胞,给予雷帕霉素、RAD001干预后通过细胞计数、流式细胞术检测肿瘤细胞生长、细胞周期分布情况。结果雷帕霉素、RAD001均可抑制MKN-28、MKN-45细胞生长,抑制作用具有时间依赖性,雷帕霉素作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为23.40%、36.26%;RAD001作用于MKN-28、MKN-45两种细胞株72 h抑制率分别为25.12%、40.11%。72 h时RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比,MKN-28、MKN-45细胞计数差异有显著性（P〈0.05）。RAD001作用24 h后MKN-28、MKN-45细胞周期发生改变,停滞在G0-G1期细胞比例增加。RAD001组与阴性对照组、DMSO对照组相比,MKN-45细胞周期差异有显著性（P〈0.05）,MKN-28细胞周期差异无显著性（P〉0.05）。结论两种药物相比较,RAD001相对敏感;两株细胞相比较,MK...     

miR-145通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性

目的探究miR-145调控非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞生物学特性及对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的影响。方法将A549细胞分为miR-145组、对照组、miR-145抗体组和对照抗体组。采用LipofectamineTM 2000转染试剂盒进行质粒转染,行MTT、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭检测,Western blotting检测分析雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、真核细胞翻译起始因子(eIF4E)、磷酸化eIF4E(p-eIF4E)、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、S6核糖体蛋白(S6)、磷酸化S6(p-S6)、eIF4E结合蛋白1(4E-BP)、磷酸化4E-BP(p-4E-BP)水平。结果对照组和对照抗体组细胞miR-145表达和细胞凋亡水平差异无显著性(P＞0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最高,miR-145抗体组最低(P＜0.05)。对照组和对照抗体组细胞增殖、迁移、侵袭活性,以及p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表达水平差异无显著性(P＞0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最低,miR-145抗体组最高(P＜0.05)。结论miR-145可通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖活性、迁移能力及侵袭能力。     

三七总皂苷抑制K562细胞mTOR信号通路活性的实验研究

目的 探讨三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对体外培养K562细胞mTOR信号通路相关分子表达及活性的影响.方法 不同浓度的PNS(50～800 μ,g/mL)干预体外培养K562细胞24 ～ 72 h后,MTT比色法检测PNS对K562细胞增殖的抑制作用;AO/EB双荧光染色法观察细胞死亡及凋亡状况;RT-PCR检测mTOR、p70S6K、4E-BP1 mRNA表达变化;Western blot检测mTOR、p70S6K、4E-BP1及p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1蛋白表达量的变化.结果 与对照组相比,浓度为100～ 800 μg/mL的PNS能够抑制K562细胞增殖(P＜0.05),促进K562细胞凋亡及死亡(P＜0.05),PNS对K562细胞72 h的IC50为(229.07±2.36) μg/mL;100、200、400 μg/mL PNS作用于K562细胞72 h后mTOR蛋白表达量及mRNA表达量降低(P＜0.05),且磷酸化蛋白p-mTOR (Ser2448)、p-p70S6K (Thr229/389)及p-4E-BP1(Thr37/46)表达水平也随着药物浓度的增加而降低(P＜0.05).结论 PNS能够抑制K562细胞mTOR信号通路的活性,这可能是PNS抑制K562细胞增殖的机制之一.     

PI3K/AKT/mTOR途径在慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌萎缩中的作用

目的研究PI3K/AKT/mTOR信号通路在慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）大鼠骨骼肌萎缩中的作用。方法采用单纯熏香烟法复制慢阻肺大鼠动物模型。采用Western blot技术检测慢阻肺大鼠趾长伸肌中PI3K/AKT/mTOR信号通路中PI3K、总的及磷酸化的mTOR（t-mTOR,p-mTOR）、总的及磷酸化的GSK-3β（t-GSK-3β,p-GSK-3β）、总的及磷酸化的4E-BP1（t-4E-BP1,p-4E-BP1）、总的及磷酸化的p70S6K1（t-p70S6K1,p-p70S6K1）蛋白表达变化。结果 Western blot分析结果显示,大鼠趾长伸肌组织中PI3K的蛋白表达在两组间差异不显著（P〉0.05）;t-mTOR、p-mTOR、t-GSK-3β和p-GSK-3β的蛋白表达慢阻肺组显著高于对照组（P〈0.05,其中p-GSK-3β两组对照P〈0.01）;t-4E-BP1和t-p70S6K1的蛋白表达在两组间差异不显著（P〉0.05）,p-4E-BP1和p-p70S6K1的蛋白表达慢阻肺组显著高于对照组（P〈0.05）。结论慢阻肺大鼠趾长伸肌组织内PI3K/AKT/mTOR信号通路被激活,可能是骨骼肌萎缩的代偿机制之一。     

白藜芦醇阻断信号通路对鼻咽癌细胞生长的影响

目的 通过体内和体外研究探讨白藜芦醇在人核孔复合物细胞（NPC）中的抗癌活性。方法 用 MTT 实验检测白藜芦醇对CNE-1 细胞和CNE-2Z 细胞（两种具有不同分化程度的NPC 细胞株）生长增殖 的影响。用流式细胞仪检测白藜芦醇诱导NPC 细胞凋亡情况和NPC 细胞周期分布变化。Western blot 检测 涉及细胞凋亡调控的数个重要基因和与细胞周期调控有关的数种Cyclins 的蛋白表达水平。在裸鼠体内进行 CNE-2Z 细胞移植瘤实验。结果 用白藜芦醇处理NPC 细胞后，白藜芦醇不仅以时间和剂量依赖的方式降低 NPC 细胞的增殖能力，还可以剂量依赖的方式诱导NPC 细胞的凋亡。流式细胞仪分析结果表明，白藜芦醇处 理可将NPC 细胞生长阻滞于S- 期和G2/M- 期。白藜芦醇处理可下调Bcl-2 和低氧诱导因子1（HIF-1）蛋白 的表达，上调Caspase-3 蛋白表达。此外，白藜芦醇处理不仅可以降低蛋白激酶B（Akt）、p70 核糖体S6 蛋白激 酶（p70S6K）和真核翻译起始因子4E- 结合蛋白1（4E-BP-1）的磷酸化水平，也可降低参与细胞周期调控的 数个细胞周期蛋白（Cyclins）的表达水平。白藜芦醇可抑制裸鼠体内NPC 移植瘤的生长，进一步确认白藜芦醇 对NPC 生长的治疗效果。结论 在人NPC 细胞株中，白藜芦醇可能是通过干扰Akt/p70S6K 信号通路而发挥有 效的抗增殖和促凋亡作用。     

AMPK／mTOR 通路参与脓毒症亮氨酸抵抗的研究进展

脓毒症可导致机体蛋白质合成显著抑制,产生亮氨酸抵抗。蛋白质合成由mTOR磷酸化核糖体蛋白p70S6激酶1（p70S6K1）和真核细胞翻译抑制因子4E结合蛋白1（eIF4E-BP1）进行调控,AMPK作为负向调节mTOR的重要信号分子,在脓毒症状态下存在活性异常。文中就AMPK／mTOR通路与脓毒症亮氨酸抵抗的相关研究进展进行综述。     

mTOR信号通路介导黄芩苷抑制人结肠癌细胞的增殖

目的 探讨黄芩苷抑制人结肠癌细胞(HCT116)增殖的分子机制.方法 采用MTT比色法检测不同浓度的黄芩苷(0.01～ 100 μg/ml)对体外培养的HCT116细胞增殖的抑制作用;采用Western blot分析检测被黄芩苷干预的HCT 116细胞的增殖相关蛋白的表达.结果 与对照组比较,浓度为1～ 100 μg/ml的黄芩苷处理组明显抑制HCT 116细胞的增殖(P＜0.05).用100μg/ml黄芩苷处理后,增殖相关的蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E表达明显下调(P＜0.05),4E-BP1表达明显上调.p-mTOR(Ser2448)、p-S6(Ser235/236)、p-4E-BP1(Thr37/46)的磷酸化水平下降(P＜0.05).结论 黄芩苷能通过抑制mTOR信号通路来抑制人结直肠癌HCT116细胞的增殖.     

泰素诱导MKN-45胃癌细胞凋亡及对cyclinE、cyclinD1表达的影响

目的探讨泰素（紫杉醇注射液）对人胃癌细胞系MKN45细胞的细胞毒作用及cyclinE、cyclinD1表达的影响。方法将MKN-45细胞与不同浓度的泰素共同孵育，应用形态学观察、流式细胞术（FACS）、Annexin—V标记等方法检测细胞凋亡的发生。在不同时间点应用MTT方法检测不同浓度泰素对MKN-45细胞生长抑制率的影响，同时应用流式细胞术（FACS）对泰素作用后的MKN-45细胞进行细胞周期分析及周期蛋白cyclinD1、cyclinE表达检测。结果不同浓度的泰素对人胃癌细胞系MKN-45细胞的生长有明显的抑制作用，均具有时间和剂量依赖性；泰素使MKN-45细胞分裂阻滞于G2／M期；泰素作用MKN-45细胞24h后cyclinE表达下调，cyclinD1表达基本不变；应用Annexin—V标记的方法检测发现泰素能诱导肿瘤细胞发生凋亡，并出现凋亡后坏死。结论泰素能使胃癌细胞MKN-45坏死，发生细胞周期阻滞，还可诱导MKN-45细胞发生凋亡及周期蛋白cyclinE表达下调。     

人胃癌细胞高转移亚系的初步筛选及母亚两系生物学特性的比较

目的 筛选高转移胃癌细胞亚系并与其母系进行生物学特性的比较.方法 利用transwell小室筛选高转移力胃癌细胞亚系,通过HE染色比较母亚两系细胞形态改变;流式细胞仪检测母亚两系细胞周期;免疫细胞化学法检测两系细胞中MMP-9蛋白表达;transwell侵袭小室模型比较母亚两系的迁移能力.结果 利用transwell小室从母系MKN-28中成功筛选出高转移力胃癌细胞亚系MKN-28S, 母亚两系细胞形态上无明显差异,亚系增殖指数(PI)高于母系,且亚系中 MMP-9蛋白表达同母系相比显著增高,显微镜下细胞计数示亚系迁移至膜背面的数量较母系明显增多 (P＜0.05),细胞运动能力明显增强.结论 MKN-28S细胞较MKN-28细胞具有更强增殖能力和更高迁移力.     

依维莫司联合顺铂对胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白特异性抑制剂依维莫司（everolimus,RAD001）对胃癌细胞株SGC7901细胞周期的影响、作用机制及其联合顺铂对SGC7901细胞抑制是否具有协同作用。方法体外培养SGC7901细胞,依维莫司单独及联合顺铂作用后,通过HE染色检测各组SGC7901细胞的形态学改变;流式细胞术检...     

木黄酮靶向抑制MKN-45胃癌细胞Notch1蛋白表达及对增殖和凋亡的影响

目的:探讨木黄酮靶向抑制Notch1蛋白表达对人胃癌细胞MKN-45增殖和侵袭作用的影响及可能机制。方法:通过不同浓度木黄酮干预胃癌细胞MKN-45,以未干预细胞为正常对照组,Western blot法检测木黄酮抑制Notch1蛋白表达的效果,MTT法检测各组MKN-45细胞的增殖能力,荧光双标流式细胞术检测各组MKN-45细胞的凋亡状况,RT-PCR检测Bcl-2和BaxmRNA的表达水平。结果:木黄酮干预MKN-45胃癌细胞后能明显抑制Notch1蛋白表达,同时抑制MKN-45细胞增殖,促进MKN-45细胞凋亡。木黄酮干预明显上调细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA水平。结论:木黄酮干预可靶向抑制胃癌细胞MKN-45Notch1蛋白表达,抑制胃癌细胞MKN-45增殖并促进凋亡,可能与其上调细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA有关。     

重组人生长激素对裸鼠胃癌移植瘤生长及血清VEGF浓度的影响

目的:研究重组人生长激素(rhGH)对裸鼠人胃癌移植瘤生长及血清VEGF水平的影响。方法:取60只雄性裸鼠进行实验,通过免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞株SGC-7901及MKN-45生长激素受体(GHR)的表达状况,将GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC-7901及GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN-45分别接种于4只裸鼠皮下,制作裸鼠胃癌皮下移植瘤模型,3周后取出移植瘤制成组织匀浆,接种于剩余52只裸鼠。依据接种细胞种类不同分为移植瘤GHR阳性表达和GHR阴性表达裸鼠,不同GHR表达的裸鼠进一步分为对照组(C组:予0.9%NaCl,0.2 ml.d-1)、rhGH低剂量组(L组:予rhGH0.5 U.kg-1.d-1)、rhGH高剂量组(H组:予rhGH2.5 U.kg-1.d-1),连续给药14 d,观察并记录各组裸鼠体重和肿瘤体积变化,酶联免疫吸附法测定血清VEGF含量。结果:SGC-7901为GHR阳性表达的人胃癌细胞株,MKN-45为GHR阴性表达的人胃癌细胞株。对于接种GHR阳性表达的人胃癌细胞株的裸鼠,rhGH给药组皮下移植瘤体积较对照组增大(P<0.05),且H组促增长效应显著(P<0.05),3组...     

FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附的影响

目的探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。方法将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。结果FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.05),但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。结论FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成,对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。     

Growth-inhibiting and Apoptosis-inducing Effects of Tanshinone Ⅱ A on Human Gastric Carcinoma Cells

To explore the effects of Tanshinone ⅡA on the proliferation, apoptosis and gene ex- pression of p53 and bcl-2 in human gastric carcinoma MKN-45 cells. Cell count and MTT assay were used to study the proliferation-inhibiting effect of Tanshinone ⅡA on MKN-45 cells. The effect of Tanshinone ⅡA on the cell cycle and apoptosis of MKN-45 cells were examined by propidium io- dide (PI) staining and flow cytometry. Semi-quantitative RT-PCR was used to further verify the ex- pression of p53 and bcl-2 gene after exposure to Tanshinone ⅡA in MKN-45 cells. The results showed that Tanshinone ⅡA significantly inhibited the growth and proliferation of MKN-45 cells in a dose- and time-dependent manner (P<0.05). Tanshinone ⅡA arrested MKN-45 cells in G2/M phase which led to an obvious accumulation of G2/M phase cells while decreased number of G0/G1 phase cells. This resulted in apoptosis of MKN-45 cells and the apoptosis rate was as high as 43.91% after treatment with 2.0 μg/mL TanshinoneⅡA for 96 h. It was also found that Tanshinone ⅡA up-regulated expression of p53 gene and down-regulated expression of bcl-2 gene. The cytostatic and antiproliferative effect of Tanshinone ⅡA makes it a promising anticancer agent for the treatment of gastric carcinoma.     

Comparison between the gastric cancer cell line MKN-45 and the high-potential peritoneal dissemination gastric cancer cell line MKN-45P

Peritoneal metastasis is the most common form of recurrence in gastric cancer, and is associated with a poor prognosis. It is clear that many agents are involved at the various stages of this process, however, many aspects of the progression remain unclear. In the present study we compared the gastric cancer cell line MKN-45 with the high-potential peritoneal dissemination gastric cancer cell line MKN-45P, established from MKN-45. The supernatant of culture medium of MKN-45 cells or MKN-45P cells was collected, and the concentrations of interleukin-1β (IL-1β), IL-6, IL-8, hepatocyte growth factor (HGF), Transforming growth factor beta-β1 (TGF-β1), vascular endothelial growth factor (VEGF), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9, and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) proteins were measured using an enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) method. Invasion, wound healing and adhesion assays were performed in vitro to examine interstitial invasion, migration and adhesion in the gastric cancer cell lines. Moreover, Western blotting was performed to determine the expression of cyclooxygenase-1 (COX-1) and COX-2 proteins in the culture media of the cell lines. The concentrations of IL-6, IL-8, VEGF and MMP-2 protein in the culture supernatant of MKN-45P were significantly higher than those of MKN-45. Percent adhesion of MKN-45P was significantly higher than that of MKN-45 in the fibronectin-coated group. There was no significant difference in invasion or migration between MKN-45 and MKN-45P. COX-1 and COX-2 proteins were observed in both cell lines. These results suggested that secretion of IL-6, IL-8, VEGF and MMP-2 from cancer cells, and adhesion of cancer cells to fibronectin, were related to the establishment of peritoneal dissemination.