小干扰RNA对大鼠OX40基因表达的沉默作用

目的:研究靶向大鼠OX40基因的二聚体小干扰RNA(siRNA-OX40) 对靶基因表达的沉默作用.方法:建立并筛选稳定表达OX40基因的293T转染细胞株,用脂质体转染法将体外合成的siRNA-OX40转染上述细胞株,采用实时荧光定量PCR检测靶基因OX40 mRNA表达情况.结果:用不同浓度的siRNA-OX40转染细胞48小时,10 nmol/L浓度对293T细胞靶基因表达的抑制作用最强 [抑制率(68.3±8.7)%],1 nmol/L浓度仍有一定的抑制作用[(37.2±4.8)%];25、10 nmol/L siRNA转染293T细胞后,均在24小时内起效[(21.4±3.2)%,(26.8±3.8)%],抑制作用至少能维持72小时[(61.7±8.4)%,(39.6±5.6)%].结论:siRNA-OX40对293T细胞外源性靶基因表达有较强的特异性沉默作用,siRNA在24小时内起效,48～72小时达高峰,抑制作用至少能维持72小时.本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据.     

壳聚糖纳米粒在基因治疗中的应用

壳聚糖是自然界存在的唯一的碱性多糖，具有良好的生物粘附性、生物可降解性及生物相容性。用壳聚糖制备的纳米粒具有助渗作用及生物粘附性，在基因递送载体的研究中具有广阔的发展前景。     

载基因壳聚糖纳米粒的研究

RNA干扰技术已被广泛应用于心血管领域,壳聚糖纳米粒以其良好的生物特性而作为基因递送载体成为现在研究的热点.就BNA干扰技术与纳米技术在心血管领域的应用及目前常采用的制备壳聚糖纳米粒的方法、影响质粒与壳聚糖纳米粒结合效率的因素、质粒壳聚糖复合物纳米粒转染的影响因素及体外释药行为作一简单的回顾.     

RNA 干扰研究的新进展

RNA干扰技术(RNA interference, RNAi) 诞生5年来,无论在技术本身的改进上还是应用上都有了很大的发展,尤其是siRNA的产生和引入方法有了一系列的改进,使siRNA的长期稳定表达成为可能.RNAi的生殖细胞传递现象的发现,进一步拓宽了RNAi的应用潜力.然而,除了对靶基因的沉默效应外,引入的siRNA还可以导致siRNA序列特异性、而非靶基因特异性的基因沉默现象(off-target效应).这就提示,在注释特定siRNA产生的沉默效应时要特别注意,尤其是将siRNA用于疾病治疗时.     

硫酸庆大霉素-壳聚糖纳米粒的制备及性能评价

背景：庆大霉素珠链是较早用于治疗慢性骨髓炎的局部释药系统,但是由于其不能在体内降解吸收,须二次取出,因而限制了其的应用。因此国内外学者一直致力于可吸收材料负载抗生素装置的研究。 目的：制备负载庆大霉素的壳聚糖纳米粒,评价其性能,观察其体外释药行为及体外抗金黄色葡萄球菌的作用。 方法：以壳聚糖为药用载体,硫酸庆大霉素为模型药物,三聚磷酸钠为离子交联剂,采用离子交联法制备庆大霉素-壳聚糖纳米粒,在MH平板上进行抑菌实验,观察及评价其抑制金黄色葡萄球菌的作用。 结果与结论：制备的纳米粒形态为类圆形,粒径为40~70 nm,包封率及载药量分别为31.3%和15.4%,体外释药可持续14 d左右,对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果可持续25 d,在第5天纳米粒的抑菌作用达到最大,随着时间的推移,抑菌圈逐渐缩小。     

RNA干扰应用新进展

RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)是近年发展起来的一种特异的靶基因失活技术 ,它可以象基因敲除一样非常有效地鉴定特定基因的功能。RNAi已被证明是破译各种生物中的基因功能的强大工具 ,并将为新型高效药物的开发和基因治疗的发展开辟新的领域。     

载基因 PGenesil-TGF-β1壳聚糖纳米粒的制备和性能研究

制备负载重组质粒 PGenesil-TGF-β1的壳聚糖纳米粒,并研究其结构特征和性能特点。采用复凝聚法制备壳聚糖-PGenesil-TGF-β1（报告基因）纳米微粒体,通过投射电镜测定其形态、粒径;采用全光谱分光光度计测定该复合物的包封率;凝胶电泳阻滞实验分析纳米粒载体与质粒的结合能力;DNase I 消化实验观察壳聚糖纳米粒保护质粒抵抗核酸酶的能力。制备的壳聚糖-PGenesil -TGF -β1纳米粒均呈球形,微粒直径在100～200 nm 之间,平均约（127．37±19．75）nm;其包封率为（94．38±0．45）％;凝胶电泳阻滞实验结果表明壳聚糖纳米粒能通过静电作用有效结合质粒,将其包裹在内;DNase I 消化实验显示壳聚糖纳米粒能有效地保护质粒免受核酸酶的降解。用复凝聚法成功制得壳聚糖-PGenesil -TGF -β1纳米粒,为后续研究基因药物奠定了实验基础。     

一种高效表达小干扰RNA载体的构建研究

目的：用mir30前体骨架来构建高效表达小干扰RNA载体。方法：通过基因合成的方法，将mir30前体骨架进行全长基因合成，并在合成的mir30前体骨架中引入合适的酶切位点用于外源发夹DNA的克隆，然后将之克隆到含U6启动子的表达载体中。将针对绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小干扰RNA克隆到以上表达载体中，通过转染及Western blot来检测新的小干扰RNA表达载体的基因沉默效率。结果：同目前常用的含polⅢ的小干扰RNA表达载体相比较，用mir30前体骨架表达针对GFP的小干扰RNA的表达载体可以明显抑制GFP的表达。结论：用mir30前体骨架构建的小干扰RNA表达载体可高效表达外源小干扰RNA。     

小干扰RNA靶向沉默CXCR2基因抑制肝癌细胞的增殖

目的 研究CXCR2-小干扰RNA（siRNA）基因体外抑制肝癌细胞增殖的作用.方法 将CXCR2-siRNA以脂质体转染法转染肝癌细胞hepG2,24h后荧光显微镜观察细胞荧光含量.采用RT-PCR及免疫印迹法分别检测正常肝Chang细胞、未转染肝癌hepG2细胞以及转染CXCR2-siRNA基因后hepG2细胞在转染24、48、72h后的CXCR2 mRNA和蛋白表达水平.以未转染的hepG2细胞为对照,CCK8法检测转染CXCR2-siRNA的hepG-2细胞在转染24、48、72 h后的增殖.以未转染的hepG2细胞为对照,检测转染CXCR2-siRNA 24 h后hepG2细胞与Transwell小室孵育24h时的侵袭能力.结果 CXCR2-siRNA转染hepG2 24 h后镜下可见大量绿色荧光,转染率为80％.hepG2细胞CXCR2mRNA和蛋白表达水平高于Chang细胞（mRNA：1.69±0.22比0.63±0.31,蛋白：1.93±0.25比0.84±0.29,均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后hepG2细胞CXCR2mRNA表达量低于未转染的hepG2细胞（0.75±0.24、0.83±0.21比1.78±0.25,均P＜0.05）,72 h后CXCR2-siRNA虽然仍能抑制hepG2细胞CXCR2mRNA的表达,但与未转染的hepG2细胞相比差异并无统计学意义（1.35±0.18比1.78±0.25,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA24和48 h后的hepG2细胞CXCR2蛋白表达低于未转染的hepG2细胞（0.91±0.25、1.16±0.23比1.98±0.31,均P＜0.05）,转染72 h后蛋白水平有所上升,与对照组相比差异无统计学意义（1.71±0.18比1.98±0.31,P＞0.05）.转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义.与未转染的hepG2细胞相比,转染CXCR2-siRNA 24、48、72 h后hepG2细胞增殖受到抑制（均P＜0.05）.转染CXCR2-siRNA的hepG2细胞对Transwell小室的侵袭能力明显低于未转染的hepG2细胞[（36±5）个腐倍视野（＆#215;200）比（526±9）个府倍视野（＆#215;200）,P＜0.05].结论 siRNA沉默CXCR2基因体外可有效抑制肝癌细胞的增殖.     

RNA干涉技术在哺乳类细胞和人类疾病基因功能研究中的应用

RNA干涉技术是一种很有潜力的研究基因功能的新技术 ,它具有快捷、方便、高效和特异性高等特点 ,但用此技术研究哺乳类动物细胞基因功能和人类疾病相关基因功能才刚刚起步 ,本文对该技术在哺乳类细胞和人类疾病基因功能中的研究进展进行了评述     

siRNA体内递送策略研究进展

RNAi是由小双链RNAs触发的序列特异性转录后基因沉默,RNAi具有锁定任何引起疾病或疾病相关蛋白表达的能力,有巨大的治疗应用前景。但以治疗为目的的siRNA特异、有效的递送仍是RNAi广泛治疗应用的主要障碍。本文就目前siRNA体内递送取得的研究进展进行综述,以有助于RNAi技术安全、有效的临床应用。     

脂质体介导RNAi的研究

本文选用阳离子脂质体Lipofectamine 2000为基因载体,使用沉默荧光素酶基因的小干扰RNA(siRNA)进行体外RNA干扰(RNAi),对阳离子脂质体转运siRNA的效率进行研究。首先以阳离子脂质体运载质粒DNA转染细胞,并以延滞实验对阳离子脂质体与siRNA的结合能力进行检测;然后通过基因载体将荧光素酶基因载入细胞,转运不同浓度的siRNA对其进行沉默,应用酶标仪对荧光素酶基因的表达进行分析,并用MTT法对转染后细胞存活率进行检测。结果表明:阳离子脂质体Lipofectamine 2000可以高效转运质粒DNA,并可与siRNA很好地结合。在较低的siRNA浓度下,对荧光素酶基因的沉默率达到较高的水平,转运siRNA转染细胞对细胞活性的影响很小,但细胞存活率随着siRNA浓度的增加而逐渐降低。通过优化实验条件,阳离子脂质体转运较低浓度的siRNA即可高效沉默目的基因。     

Efficient prediction methods for selecting effective siRNA sequences

Although short interfering RNA (siRNA) has been widely used for studying gene functions in mammalian cells, its gene silencing efficacy varies markedly and there are only a few consistencies among the recently reported design rules/guidelines for selecting siRNA sequences effective for mammalian genes. Another shortcoming of the previously reported methods is that they cannot estimate the probability that a candidate sequence will silence the target gene. This paper first reviewed the recently reported siRNA design guidelines and clarified the problems concerning the guidelines. It then proposed two prediction methods—Radial Basis Function (RBF) network and decision tree learning—and their combined method for selecting effective siRNA target sequences from many possible candidate sequences. They are quite different from the previous score-based siRNA design techniques and can predict the probability that a candidate siRNA sequence will be effective. The methods imply high estimation accuracy for selecting candidate siRNA sequences.     

Induction of RNA interference in dendritic cells

Dendritic cells (DC) reside at the center of the immunological universe, possessing the ability both to stimulate and inhibit various types of responses. Tolerogenic/regulatory DC with therapeutic properties can be generated through various means of manipulations in vitro and in vivo. Here we describe several attractive strategies for manipulation of DC using the novel technique of RNA interference (RNAi). Additionally, we overview some of our data regarding yet undescribed characteristics of RNAi in DC such as specific transfection strategies, persistence of gene silencing, and multi-gene silencing. The advantages of using RNAi for DC genetic manipulation gives rise to the promise of generating tailor-made DC that can be used effectively to treat a variety of immunologically mediated diseases.     

小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD28基因表达的研究

目的 :为了探讨体外转录法合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA ,siRNA)对人淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因表达和功能的影响。方法 :设计并合成 3条siRNA(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3) ,在阳离子脂质体的介导下转染淋巴细胞。于转染后 2 4、4 8、72小时收集细胞 ,用半定量RT PCR方法检测CD2 8mRNA的变化 ;流式细胞仪检测CD2 8表达的变化。结果 :体外合成的 3条siRNA通过脂质体转染淋巴细胞后 ,均能不同程度地抑制共刺激分子CD2 8的表达。转染后 4 8小时的流式细胞仪检测显示siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3组的CD2 8表达抑制率分别为 2 2 10 %± 1 6 3%、73 5 0 %± 1 0 2 %和 4 2 90 %± 0 89% ,以siRNA 2的CD2 8抑制作用最强。半定量RT PCR检测显示siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3转染后淋巴细胞的CD2 8mRNA均受到不同程度的抑制 ,其中siRNA 2组的抑制作用最明显 (74 10 %± 1 6 5 % )。结论 :siRNA可特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因的转录和表达 ,从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受及防治GVHD方面的应用提供了理论和实验基础。     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.     

Silencing of African horse sickness virus VP7 protein expression in cultured cells by RNA interference

RNA interference (RNAi) is the process by which double-stranded RNA directs sequence-specific degradation of homologous mRNA. Short interfering RNAs (siRNAs) are the mediators of RNAi and represent powerful tools to silence gene expression in mammalian cells including genes of viral origin. In this study, we applied siRNAs targeting the VP7 gene of African horse sickness virus (AHSV) that encodes a structural protein required for stable capsid assembly. Using a VP7 expression reporter plasmid and an in vitro model of infection, we show that synthetic siRNA molecules corresponding to the AHSV VP7 gene silenced effectively VP7 protein and mRNA expression, and decreased production of infectious virus particles as evidenced by a reduction in the progeny virion titres when compared to control cells. This work establishes RNAi as a genetic tool for the study of AHSV and offers new possibilities for the analysis of viral genes important for AHSV physiology.     

壳聚糖载基因纳米粒子的研究

以壳聚糖为基质研究载基因纳米粒子的制备及其对血管平滑肌细胞的转染效率。制备载绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescen t prote in,EGFP)和组织因子途径抑制因子(T issue factor pathw ay inh ib itor,TFP I)质粒DNA的壳聚糖纳米粒子,透射电镜观察两种纳米粒子皆呈球形,光子相关色谱仪(PCS)测定显示纳米粒子的平均粒径为149 nm,粒径分布在80~250 nm之间;载基因纳米粒子的DNA包埋效率和DNA含量分别为96%±1.38%和37%±3.0%。载基因壳聚糖纳米粒子可以有效地保护DNA,防止核酸酶对其的降解作用。血管平滑肌细胞转染实验表明,纳米粒子对细胞基本无毒性,其转染效率与阳离子脂质体转染试剂L ipofectAM INETM相近。