人HSV-1 UL40基因重组质粒的构建及其在siRNA筛选中的应用

目的： 快速筛选出高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA，为进一步应用RNA干扰的相关研究奠定基础。方法: 应用RT-PCR扩增人HSV-1 F株UL40基因，将其连接到pEGFP-N1构建pEGFP-N1-UL40融合蛋白表达质粒。将化学合成的针对UL40基因的siRNA与重组质粒共转染Vero细胞，通过观察绿色荧光蛋白报告基因的表达筛选高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。结果: 倒置荧光显微镜观察发现设计的4对siRNA中siRNA3和siRNA4能明显降低绿色荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测证明siRNA3和siRNA4对目的基因沉默效率分别达到76.99％和84.00％。结论: 成功构建了人HSV-1 UL40基因融合表达载体pEGFP-N1-UL40，并利用该载体筛选出2对高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。     

慢病毒和质粒作为shRNA载体沉默人卵巢癌RhoA基因效果的比较

目的 研究慢病毒和质粒作为RNA干扰载体在沉默卵巢癌RAS同源基因家族成员A(RhoA)基因表达方面的差异.方法 分别将慢病毒及质粒载体携带的针对RhoA基因的siRNA序列感染或转染卵巢癌HO8910细胞,经过嘌呤霉素筛选建立稳定沉默RhoA基因的细胞株.通过荧光显微镜观察、实时荧光定量PCR、Western blot法、血管形成实验、细胞划痕实验研究两种载体随着细胞培养代数的增加在抑制卵巢癌RhoA基因表达及侵袭和转移能力上的差异.结果 采用质粒载体及慢病毒载体分别建立人RhoA基因稳定沉默卵巢癌细胞株,通过荧光显微镜观察,质粒组细胞绿色荧光蛋白的表达率随培养代数的增加而下降;第15代、第25代时表达率分别为70％、45％,而慢病毒组细胞绿色荧光蛋白表达率维持在95％以上,实时荧光定量PCR及Western blot法发现质粒组和慢病毒组细胞在第3代时RhoA mRNA及蛋白的表达无明显差异;随培养代数的增加,慢病毒组RhoA mRNA及蛋白持续低表达,而质粒组RhoA mRNA及蛋白的表达逐渐增高;细胞划痕实验及血管形成实验表明慢病毒较质粒作为载体介导siRNA对RhoA基因沉默更能持续稳定地抑制卵巢癌细胞的侵袭、转移(P＜0.05).结论 慢病毒较质粒作为载体介导RNA干扰能更好沉默目标基因的表达.     

siRNA和shRNA在syt基因沉默中的一致性

目的通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)和短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对PC12细胞中Synaptotagmin(syt)基因表达沉默效果的比较,确认siRNA在基因沉默中与shRNA的等效性.方法用T7 RNA聚合酶体外合成的针对syt Ⅰ与Ⅸ的siRNA和在H1.1载体上构建的shRNA表达质粒转染PC12细胞,用标记荧光蛋白和免疫荧光检测shRNA和siRNA的转染率,用Western印迹方法检测沉默效果.结果siRNA和shRNA在PC12细胞中沉默syt Ⅰ和Ⅸ的表达时,有一致的沉默效率.结论siRNA可作为基因沉默中快速筛选的工具,可在RNA干扰的应用中与shRNA 配合使用.     

MSTN基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的 构建能沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,并鉴定它沉默肌母细胞MSTN基因的效率.方法 合成3对发夹小干扰RNA模板寡核苷酸链,退火后插入pSilencer载体,构建成可沉默MSTN基因的小干扰RNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的小干扰RNA表达载体.将小干扰RNA表达载体转染肌母细胞,用实时荧光定量RT-PCR和Western印迹检测转染的肌母细胞myostatin的表达水平.结果 酶切和测序证实3个小干扰RNA表达载体构建正确,实时荧光定量RT-PCR显示所构建的3个小干扰RNA表达载体对肌母细胞MSTN基因的干扰率分别为43.6 %、47.7 %和81.6 %,它们的干扰效果被Western印迹所证实.结论 干扰率为81.6 %的小干扰RNA表达载体为构建成功的小干扰RNA表达载体,它可用作MSTN基因的功能研究和肌病治疗的分子研究.     

DNMT1 siRNA 稳定表达载体的构建及其沉默效率的评价

目的构建能在肝癌细胞系SMMC-7721中稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体。方法合成特异性干扰DNMT1的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，并与pSUPER—GFP载体连接。脂质体转染SMMC-7721细胞，并以G418筛选稳定表达细胞系。应用逆转录-聚合酶链反应和Western印迹方法对细胞系中DNMT1的RNA表达水平和蛋白表达水平进行了分析。应用甲基化聚合酶链反应方法分析该细胞系中甲基化的基因E-钙粘着蛋白的甲基化状态。结果转染DNMT1沉默载体的SMMC-7721细胞中DNMT1的mRNA表达量为对照载体pSUPER转染SMMC-7721细胞的43％，而前者中DNMT1蛋白表达水平小于后者的10％。DNMT1的siRNA沉默效率大于90％，所构建的DNMT1的siRNA有较高的沉默效率。DNMT1的表达抑制使E-钙粘着蛋白基因启动子区出现去甲基化。结论成功构建了能稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体，但目的基因沉默后其RNA表达水平与蛋白质表达水平表现不一致，评价siRNA干扰作用时应以目的基因相应蛋白质的表达水平为准。     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

Survivin特异小干扰RNA表达载体构建及对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的测定Survivin特异小干扰RNA(siRNA)表达载体对肺腺癌细胞A549 Survivin基因表达的抑制及对增殖和凋亡的影响。方法构建Survivin特异性小干扰RNA表达载体,转染A549细胞,筛选出稳定表达的细胞株。用荧光实时定量反转录聚合酶链反应法、Western blot和免疫组化法检测Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果经测序鉴定证实成功构建Survivin-siRNA表达载体。Survivin基因mRNA表达量下降76.4%,Western blot显示蛋白表达下降84.5%,免疫组化法也显示Survivin蛋白表达下降。MTT法测定细胞增殖较对照组减慢(P<0.01),细胞凋亡率较对照组增加8.95%(P<0.01)。结论Survivin特异siRNA表达载体下调Survivin基因表达,抑制A549细胞的增殖,促进凋亡。     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响.方法 设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QBI293A细胞中包装,获得RAGE-siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE-siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达.结果 成功制备RAGE-siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE-siRNA感染效率达到90 %以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达.结论 成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达.     

脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默星形胶质细胞AQP4基因

目的明确脂质体RNAiMAX(lipofectamine RNAiMAX)是否可以介导小干扰RNA(siRNA)转染入原代培养星形胶质细胞并实现水通道蛋白4(AQP4)基因沉默。方法利用原代培养的Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞,通过倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪,观察lipofectamine RNAiMAX是否能介导Cy3标记的siRNA转染入细胞内,以及RNAiMAX浓度和siRNA浓度对转染效率的影响;利用Real-time PCR方法检测AQP4 siRNA转染的基因沉默效果。结果倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪检测发现,随着siRNA和RNAiMAX浓度的增加,转染细胞荧光强度随之增加(n=6);Real-time PCR检测结果显示,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA以及6ml/L RNAiMAX和60nmol/L AQP4 siRNA转染星形胶质细胞24h、48h、72h时,AQP4 mRNA水平均降低80%以上(n=6)。结论 Lipofectamine RNAiMAX可以介导siRNA转染入原代培养星形胶质细胞中并实现AQP4基因的沉默,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA即可达到理想的沉默效果。     

RNA干扰技术沉默星形胶质细胞Cdk5模型的建立

目的建立星形胶质细胞细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)沉默模型。方法新生24 h内无特定病原(SPF)级SD雄性大鼠乳鼠240只。培养及鉴定SD雄性大鼠星形胶质细胞。设计合成针对星形胶质细胞Cdk5的小干扰RNA(siRNA)3种(Si-r-Cdk5-001、Si-r-Cdk5-002及Si-r-Cdk5-003),将3种siRNA分为SiT1组、SiT2组、SiT3组,在Lipofectamine 2000介导下转染星形胶质细胞;阴性对照组加入阴性对照si RNA。应用荧光染色观察转染效率,通过实时聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测沉默效率。结果成功将Cdk5 siRNA转染入星形胶质细胞,转染效率为85%。与阴性对照组相比,SiT1组、SiT2组及SiT3组Cdk5 mRNA及蛋白表达均降低(P0.01),其中SiT3组沉默效果最佳,分子水平沉默效率为68%,蛋白水平沉默效率为79%。结论成功通过RNA干扰技术建立星形胶质细胞Cdk5特异性沉默模型。     

siRNA体内递送策略研究进展

RNAi是由小双链RNAs触发的序列特异性转录后基因沉默,RNAi具有锁定任何引起疾病或疾病相关蛋白表达的能力,有巨大的治疗应用前景。但以治疗为目的的siRNA特异、有效的递送仍是RNAi广泛治疗应用的主要障碍。本文就目前siRNA体内递送取得的研究进展进行综述,以有助于RNAi技术安全、有效的临床应用。     

The ability of small interfering RNA oligonucleotides to decrease the infective activity of hepatitis C virus in the cell cultures

The use of the RNA interference technique yielded data on the antiviral activity of small interfering RNA (siRNA) oligonucleotides against hepatitis C virus (HCV) infection in the pig embryo kidney (SPEV) cell cultures. The RNA interference technique is based on the specific recognition of the mRNA target by using the specially designed siRNA (19-22 bp) oligonucleotides. In particular, it was shown that siRNA added to the monolayer of HCV-infected SPEV cells resulted in the protection of the infected cells against the cytopathogenic activity of the virus. The results were confirmed in the experiments that demonstrated the ability of RNA oligonucleotides to reduce the production of infectious (cytopathogenic) HCV by infected SPEV cells in early-stage infection.     

小干扰RNA的设计及原理

RNA干扰技术在人类基因功能研究、药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。但只有设计合理的小干扰RNA (siRNA)才能高效、特异地抑制靶基因表达。本文总结了siRNA序列的一般特点以及设计siRNA的方法和相应原理,并介绍了如何利用实验手段,验证RNA干扰的有效性及特异性。从而促进RNA干扰技术的广泛开展。     

PTTG基因siRNA载体的构建与鉴定

目的构建针对垂体腺瘤细胞系AtT20的高效率沉默PTTG基因的shRNA表达载体。方法合成特异性干扰PTTG基因的小发卡RNA(shRNA)片段,并与pGenesil2载体连接,构建PTTG干扰载体(pGenesil2-PTTG shRNA)。利用脂质体将其转染AtT20细胞,分为正常细胞对照组、阴性对照组和3个shRNA干扰组(pGenesil2-PTTG siRNA1、2及3),应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法分析转染后AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平。结果酶切证实PTTG-shRNA表达载体构建成功;转染效率可达75%左右。转染pGenesil2-PTTG shRNA后,3个干扰组的AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低(P<0.01)。结论成功构建了能高效沉默PTTG的RNAi表达载体;且pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了垂体腺瘤细胞AtT20细胞中PTTG綦因的表达。     

RNAi在丙型肝炎基因治疗中的研究进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术是通过小干扰RNA(siRNA)降解具有序列同源性的mRNA分子而实现的基因表达沉默。目前将RNAi应用于丙型肝炎基因治疗的研究备受关注。siRNA能够有效抑制病毒复制和蛋白表达。但要将该技术应用于丙型肝炎临床治疗仍然存在很多问题。     

靶向UL5小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒的抑制

背景：解旋酶-引发酶复合体是Ⅱ型单纯疱疹病毒进行复制的必需基因,UL5基因为Ⅱ型单纯疱疹病毒解旋酶-引发酶复合体的组成单位之一。 目的：应用RNA干扰技术分析特异性小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因的干扰作用。 方法：以Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因为靶目标,设计、合成5对特异性小干扰RNA。通过LipofeCtamine 2000脂质体将特异性小干扰RNA转染HEK293细胞。48 h后行荧光定量RT-PCR检测UL5基因转录水平,终点滴定法测定干扰后病毒滴度,观察其干扰效果。 结果与结论：小干扰RNA成功转染入细胞内。荧光定量RT-PCR结果显示,siRNA 722、siRNA 2 394、siRNA 2 513和siRNA 2 627均可不同程度降低靶mRNA表达,病毒滴度检测结果显示siRNA 722、siRNA 2 394、siRNA 2 513和siRNA 2 627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度,阴性对照组和siRNA 374对病毒感染滴度无影响。针对UL5基因的有效小干扰RNA可以特异性降低Ⅱ型单纯疱疹病毒的复制水平。     

小干扰RNA敲低Dicer对人脑胶质瘤细胞生物学特征的影响

目的 研究敲低Dicer酶的表达全面抑制徽小RNA(microRNA,miRNA)成熟对TJ905人脑胶质瘤细胞的生物学特征的影响.方法 采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低Dicer酶的表达,逆转录PCR、Western印迹及免疫荧光检测TJ905细胞转染小干扰RNA(small interferen,siRNA)后Dicer酶表达情况;应用流式细胞术检测、噻唑兰比色分析法试验及Tranwell试验评价细胞生长、增殖和侵袭等生物学特征变化.结果 转染siRNA靶向Dicer酶后,Dicer酶被敲低,S期细胞增多,细胞增殖加速,细胞侵袭生长能力增强.结论 敲低Dicer酶全面抑制miRNAs成熟后,肿瘤细胞表型具有更为恶性变的倾向,由此初步推测全面抑制细胞miRNAs表达有可能促进肿瘤生成.