幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法利用ANTHEPROT V4.3c 软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列。结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌粘附素基因保守区的克隆及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)4种粘附素(BabA2、AlpA、AlpB和HopZ)保守区蛋白质的候选菌株,并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增粘附素保守区(命名为CB)基因,将其定向插人pET—22b( )载体,在BL21(DE3)大肠杆菌中表达;表达产物经亲和层析纯化和免疫印迹鉴定,ELISA法测定Hp感染者血清中抗CB抗体。结果 构建了4种粘附素保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588bp,编码195个氨基酸。SDS—PAGE和凝胶扫描分析,CB基因表达的蛋白质相对分子质量约为22500,其重组蛋白质表达量占菌体总蛋白质的29％。经免疫印迹证实该重组蛋白质可以被Hp阳性患者血清所识别,ELISA法共检测了55份血清,以快速尿素酶实验(RUT)作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0．76。结论 CB有可能成为一种有效的疫苗,用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达

目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素（HpaA）。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）总DNA中钓取hpaA结构基因,克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达,表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp,编码261个氨基酸,SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000,可溶性表达占全菌的20%以上,经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性,可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)DNA疫苗。方法 扩增全长napA(编码HP-NAP)，将其与克隆载体pBT连接，经测序及同源性分析后，将相应片段亚克隆入真核表达载体pIRES，经双酶切及PCR鉴定。结果 PCR扩增-435bp产物，核苷酸序列测定及BLAST分析表明，所克隆序列与基因库中Hp悉尼株(SS1)napA核苷酸及蛋白质的同源性均为98％。ANTHEPROT软件预测其蛋白质具有良好的疏水性和抗原性。经PCR及双酶切鉴定，证实成功构建携带，napA的重组真核表达质粒plRES-napA。结论 成功构建并鉴定了HP-NAP重组DNA疫苗，为进一步研究其免疫原性及研制口服DNA疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的　利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果　用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论　成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A编码基因的克隆及序列分析

目的：获取含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A编码基因并构建其重组载体，进行核苷酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法：利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增热休克蛋白A编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经kpnI、BamHI双酶切、纯化、连接后。转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果：经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp热休克蛋白A编码基因，与GenBank的报道相比较，有1．4％的bp发生变异，1．6％的氨基酸残基改变。其同源性高达98％。结论：成功地克隆了Hp热休克蛋白A编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

人临床株幽门螺旋杆菌热休克蛋白A亚单位基因克隆及序列分析

目的获取人临床株幽门螺旋杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位基因。方法用聚合酶链反应(PCR)技术从Hp的染色体DNA扩增HspA基因,将其定向插入pMD18-T克隆载体中进行核苷酸序列分析。结果经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功。克隆载体pMD-HspA测序结果显示HspA DNA片段长度为357 bp。利用生物软件Om iga 2.0对临床分离的Hp和NCTC11637 HspA基因序列进行同源性比较,发现有14个核苷酸差异,基因序列同源性96.08%;对编码氨基酸进行比较,发现有1个氨基酸差异,氨基酸同源性99.15%。同时将Hp HspA序列与GenBank中公布的多株国外Hp HspA序列进行比较,结果显示基因序列同源性在95.20%~96.36%之间,氨基酸序列同源性在98.31%~100%之间。结论成功地获得人临床株Hp保守的HspA基因,为Hp HspA相关疫苗的研究奠定了实验基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的限制性片段长度多态性分型和生物信息学分析

目的：对不同来源野生型幽门螺杆菌（Hp）菌株的尿素酶B基因进行限制性片段长度多态性（RFLP）分型和生物信息学分析。方法：采用HaeⅢ单酶切法对国内临床分离的Hp菌株、动物模型适应株及国际标准Hp菌株尿素酶B（ureB）基因进行RFLP分型，同时进行基因测序和序列同源性对比及进化树分析等生物信息学研究。结果：HaeⅢ单酶切结果显示，14株Hp 1．7kb ureB基因均呈现出2～5种带型，可分为五组，其中两种国际标准株NCTC11637、NCTC11639和三种临床分离野生株拥有相同的RFLP带型，其他国内临床分离株和动物适应株分属于四种不同的RFLP带型组。ureB基因序列同源性比对表明，各种Hp菌株间核苷酸序列同源性均〉96．6％，氨基酸序列同源性均〉98％，其中CCS9801、CCS9806、M3及M10菌株之间的核苷酸和氨基酸序列同源性为100％。核苷酸序列进化树分析显示，2株国际标准株与国内临床分离株及动物适应株分处于不同进化分支，为平行进化关系；而在氨基酸序列进化树中转变为非平行关系。结论：不同Hp菌株尿素酶B在基因和蛋白质水平均高度保守和同源。     

一株输血传播病毒新变种的克隆和序列分析

目的：从1例不明原因转氨酶升高的病人血清中克隆输血传播病毒（TTV）DNA，并进行序列分析。方法：用巢式PCR扩增TTVDNA长片段，连接至pGEM-T载体上，挑选一个克隆（56－B）进行测序，将56－B与GenBank中五株TTV进行氨基酸和核苷酸序列的同源性分析，并用最大似然法进行分子进化分析。结果：56－B株与TA278等五株TTV序列的核苷酸同源性分别为42．4％，48．2％，47．9％，61．7％，氨基酸序列的同源性更低，但其5'，和3'两端非编码区的序列仍然很保守。结论：56－B株与其他TTV株之间的同源性很低，有很高的基因异质性，是TT的一个新变种，代表TTV的一个新的基因型。     

HSV-2的生物信息学分析及其探针设计的探讨

目的 利用生物信息学分析单纯疱疹病毒2型(HSV-2)基因序列的特点,设计HSV-2诊断芯片的Oligo探针. 方法 利用Matlab7.0和ANTHEPROTV5对HSV-2序列进行分析,并通过BLAST软件对HSV-2的DNA序列进行序列比对,得到有意义的特异序列;用生物学软件Oligo6.0设计特异性高、Tm值相近、长度均一的Oligo探针. 结果 利用Madab7.0和ANTHEPROT V5分析HSV-2二级结构的分布以及其理化性质,同时生物学软件Olig06.0获得13条60-merOligo探针.结论通过生物信息学设计HSV-2诊断芯片的探针,可为后期打印成DNA芯片,用于HSV-2的检测打下基础.     

幽门螺杆菌临床菌株hpaA基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因，构建hpaA基因表达载体，鉴定其表达的融合蛋白免疫性。方法：采用高保真PCR从幽门螺杆菌临床分离菌株Y06中扩增hpaA基因，T-A克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a的hpaA表达载体，在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达，采用Hp全菌抗体的Western blot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。结果：所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为94.25％-97.32％，氨基酸序列同源性高达95.38％-98.46％。pET32a-hpaA-BL21DE3系统的HpaA融合蛋白表达量高达细菌总蛋白的40％左右。HpaA融合蛋白能与Hp全菌抗体发生结合反应，免疫家兔能获得高效价抗体。结论：本研究成功地构建了Hp hpaA高效表达系统，所表达的HpaA融合蛋白有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp疫苗的抗原。     

分泌型单链双功能抗体分子间接头的设计及软件分析

目的:利用生物信息学软件分析分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体融合蛋白的二级结构及其理化性质.方法:构建融合蛋白时,先进行连接肽的设计,选用通用酶切位点序列,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:在编码ScFv与TNF的碱基之间引入连接肽,通过酶切位点获得的DNA序列,运用DNAssist核酸序列软件获得了融合蛋白的二级结构,并运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)预测了融合蛋白的理化性质.结论:应该充分利用生物信息学软件分析生物学信息,并不断对软件本身进行改进,生物信息学软件可提高药物开发进程,可利用生物信息学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的表达及免疫原性

目的克隆幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因并制备其原核表达系统,研究其表达蛋白的免疫原性,为Hp疫苗研制提供理论依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增Hp-NAP基因,测序并作同源性分析后,亚克隆入原核表达载体pET-22b,转化表达菌BL21-CodonPlus(r)(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果PCR扩增一408 bp产物,与基因库中相关序列具有高度同源性(>98%)。重组质粒pET-22b-nap转化BL21-CodonPlus(r)(DE3)后表达一相对分子质量约19 000的融合蛋白,能与Hp全菌抗体产生结合反应,Western blot显示特异的单一条带。结论成功构建Hp-NAP原核表达系统,所表达NAP融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

Cloning of the Gene Encoding Urease Subunit.A in Helicobacter Pylori

Themostefficient ,economicalapproachwithlowriskofadversereactiontothepreventionandcon trolofHelicobacterpylori (H .pylori)infectionistousevaccine .UreaseanditssubunitAisproventobethemainvaccineagainsttheinfectionofH .pylori.Inordertoexpresstheureasesubuni…     

幽门螺杆菌cagA基因全长克隆及序列分析

目的探索扩增cagA基因全长的PCR方法,克隆中国2株胃癌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)分离株和1株十二指肠溃疡分离株及国际标准株SS1的cagA基因,初步探讨cagA序列和磷酸化位点变异及其临床意义.方法针对已知cagA基因两侧及cag致病岛右侧反转重复序列设计PCR引物,扩增cagA基因并克隆测序,分析已知cagA序列同源性及其酪氨酸磷酸化位点.结果3株中国Hp分离株cagA氨基酸序列的同源性约为94%(93.9%、94%、94.5%),并都有pY117/118/122和EPIYA-A、B、D 4个酪氨酸磷酸化位点.SS1株cagA与西方菌株同源性大于85%,而与中国菌株的同源性小于80%,具有pY117/118/122和EPIYA-A、B、C 4个酪氨酸磷酸化位点.结论建立的PCR方法可扩增cagA基因全长.CagA序列变异和磷酸化位点具有地区聚类特征,但与Hp感染临床结局无特殊关联.