人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-Ⅰ类分子

 [目的]研究人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 nef调节细胞表面的人类白细胞抗原（HLA）-Ⅰ类分子及诱导细胞凋亡情况。[方法]将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。[结果]HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A,B,C-FITC染色后,平均荧光强度分别为205±22及269±15,两者相比有显著性差异（P〈0.01）;经Annexin V-APC/PI染色后,阳性细胞百分率分别为（60.82±8.32）%及（8.12±5.43）%,两者相比亦有显著性差异（P〈0.01）。[结论]HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。     

蛋白酶体抑制剂MG132对Raji细胞凋亡、细胞周期及UBE1基因表达的影响

 【目的】 探讨蛋白酶体抑制剂MG132对人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞凋亡、细胞周期及泛素活化酶(UBE1)基因表达的影响。【方法】 5 μmol/L的MG132处理Raji细胞24 h,形态学观察细胞生长情况;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡、PI单染法分析细胞周期;荧光定量RT-PCR检测UBE1 基因mRNA表达, Western blot 检测UBE1 蛋白表达。【结果】 MG132处理组细胞生长缓慢,死亡及凋亡多见,细胞凋亡率(26.06 ± 1.10)% 较对照组(0.30 ± 0.26)%上升(P < 0.05),G2/M期细胞比率(33.2 ± 1.2)%较对照组(12.5 ± 1.1)%升高(P < 0.05);MG132处理组UBE1 mRNA表达量(0.35 ± 0.05)较对照组(1.00 ± 0.08)下降(P < 0.05),抑制率为65%; UBE1蛋白表达量(0.93 ± 0.07)较对照组(1.62 ± 0.22)下调(P < 0.05),蛋白表达率为(58 ± 6)%。【结论】蛋白酶体抑制剂MG132可诱导Raji细胞发生凋亡和G2/M期阻滞,同时抑制UBE1的mRNA和蛋白表达,机制仍待深入研究。     

黏着斑激酶基因对白血病细胞生物学特性的影响

 【目的】本实验研究黏着斑激酶（FAK）基因对白血病细胞生物学特性的影响。【方法】构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至REH白血病细胞株,同时建立空白载体对照细胞株。通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况,予荧光染料Annexin V标记细胞观察细胞凋亡情况。体外应用Transwell培养体系,观察白血病细胞在细胞因子SDF-1作用下的迁移能力。将REH细胞予绿色荧光CFSE进行标记,经尾静脉注射到SCID小鼠,观察白血病细胞在动物体内归巢及白血病生成情况。【结果】FAK shRNA慢病毒载体在REH白血病细胞蛋白水平的抑制率为75%。凋亡实验中,空白对照组和FAK基因沉默组Annexin V⁺ 细胞百分比分别为（2.19 ± 0.36）％ 和（6.48 ± 0.58)）％。体外迁移实验发现空白对照组与FAK基因沉默组的细胞迁移百分比分别为（50.3±7.22）％和（7.6±3.15）％;动物体内归巢实验发现FAK基因沉默的细胞归巢于骨髓能力明显降低。白血病动物实验发现空白载体对照组小鼠生存时间是40～47 d,而FAK基因沉默组小鼠生存时间是72～80d。白血病细胞输注后第45天,空白载体对照组与FAK基因沉默组小鼠骨髓中白血病细胞所占百分比分别为（65.5 ± 8.20）％和（9.60 ± 3.65）％。【结论】FAK 基因沉默能诱导白血病细胞凋亡,并降低白血病细胞迁移及归巢能力,并抑制白血病生成,提示分子靶向FAK基因有望成为白血病治疗的新策略。     

逆转录病毒载体介导的RNAi对MCF-7细胞E2F1 mRNA表达的影响

目的:采用逆转录病毒载体介导的RNAi技术靶向抑制乳癌细胞MCF-7E2F1mRNA的表达。方法:构建重组的表达E2F1siRNA的逆转录病毒载体。将重组载体和空载体转染入MCF-7细胞中,共分9组:空载体组、未转染组和7个转染组。筛选出稳定转染的单克隆细胞扩大培养。应用RT-PCR方法检测转染细胞和未转染细胞E2F1mRNA的表达情况。结果:筛选出7个转染逆转录病毒载体的单克隆,命名为SIR1~7,其E2F1mRNA表达量分别为0.857±0.015,0.850±0.037,0.907±0.029,0.878±0.021,0.900±0.021,0.912±0.031,0.913±0.023;转染空载体和未转染的细胞E2F1mRNA表达量分别为1.563±0.031和1.544±0.018;SIR1~7E2F1mR-NA表达量低于空载体及未转染组,差异有统计学意义(P<0.05),SIR1~7E2F1mRNA表达均受到抑制;SIR1~7之间以及空载体转染与未转染组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:逆转录病毒载体介导的RNAi技术特异、高效抑制靶基因的表达,为肿瘤基因治疗提供了新的思路和工具。     

Bcl-xl基因对硝普钠诱导SY5Y细胞凋亡的抑制作用

【目的】研究Bcl-xl基因对成人神经母细胞廇SH-SY5Y细胞毒性的影响.【方法】 将构建好的Bcl-xl基因重组真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl转染SH-SY5Y细胞,并分为正常组、pIRES2-EGFP空质粒转染组、pIRES2-EGFP/Bcl-xl质粒转染组,利用凋亡诱导剂硝普钠(50 μmol/L)诱导各组细胞凋亡,行Hoechst33258细胞染色对比观察各组细胞凋亡情况,通过MTT法分析各组细胞存活率?RT-PCR与Western blotting检测转染后Bcl-xl基因的表达情况.【结果】 转染SH-SY5Y细胞后,检测结果显示Bcl-xl基因能够高效转染并在此细胞中蛋白表达,相对于未转染细胞来说,转染细胞能部分对抗硝普钠诱导的凋亡,MTT显示有统计学意义(P < 0.05).【结论】 Bcl-xl基因能够通过升高基因的表达抑制NO诱导的类神经元细胞死亡,同时也能间接说明硝普钠产生的NO对细胞的毒性可能大部分是通过凋亡途径来产生的.     

高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901生长的影响

目的 观察高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901生长的影响。 方法 构建Klotho载体,胃癌GC-7901细胞分为Klotho组(GC-7901细胞转染p Zs Green1-C1-Klotho载体)、阴性对照组(GC-7901细胞转染空病毒载体)、空白对照组(GC-7901细胞未转染载体)。Western blot检测细胞中Klotho蛋白表达,CCK-8法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡和细胞周期。 结果 胃癌细胞株GC-7901细胞中Klotho蛋白表达量(0.19±0.01)低于正常胃细胞株GES-1细胞(0.62±0.04),P<0.05;Klotho组胃癌细胞中Klotho蛋白的表达量(0.81±0.12)明显高于阴性对照组(0.24±0.06)和空白对照组(0.22±0.04),P<0.05;Klotho组胃癌细胞增殖率[(62.26±13.24)%]明显低于阴性对照组[(99.14±21.53)%]和空白对照组[(100.00±1.03)%],P<0.05;Klotho组胃癌细胞凋亡率[(23.31±2.54)%]明显高于阴性对照组[(4.76±0.15)%]和空白对照组[(4.67±0.13)%],P<0.05;Klotho组胃癌细胞G0/G1期比例[(25.26±2.63)%]明显高于阴性对照组[(4.91±0.17)%]和空白对照组[(4.83±0.16)%],P<0.05。 结论 胃癌细胞中Klotho蛋白呈低表达,Klotho基因的高表达能够降低胃癌细胞增殖,促进胃癌细胞凋亡,抑制细胞周期。      

瞬时感受器电位M7通道对RBL-2H3细胞增殖 及凋亡的影响

 【目的】 观察瞬时感受器电位M7通道(TRPM7)在大鼠肥大细胞系RBL-2H3的表达,探讨其对RBL-2H3增殖和凋亡的影响&#65377;【方法】 Western blot及细胞免疫荧光分别检测TRPM7 在RBL-2H3的表达&#65377;通过离子通道阻断剂2-APB抑制TRPM7通道的表达,以WST-1法检测细胞增殖,流式细胞术及Hoechst 33342 荧光染色检测细胞凋亡&#65377;【结果】 Western blot及细胞免疫荧光法均检测到TRPM7在RBL-2H3的表达,细胞免疫荧光提示TRPM7主要表达于RBL-2H3细胞膜&#65377;100 μmol/L和 200 μmol/L的2-APB可明显抑制TRPM7的表达&#65377;100 μmol/L和 200 μmol/L的2-APB对RBL-2H3的增殖抑制率分别为(30.4 ± 4.2)%和(42.0 ± 0.8)%,早期凋亡率分别为(36.9 ± 6.7)%和(49.3 ± 1.8)%,总凋亡率分别为(40.2 ± 7.0)%和(76.8 ± 5.5)%&#65377;【结论】 TRPM7通道表达于RBL-2H3肥大细胞系并参与其增殖和凋亡&#65377;     

蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响

 【目的】探讨蛋白酶体筇亚单位（PSMB5）基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3．1-PSMB5并将其转染人人晶状体上皮细胞株SRAO1／04中，形成稳定表达，同时设pcDNA3．1空载体为对照组。RT—PCR法及Western blot法分别检测PSMB5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】转染后用G418筛选3周后，获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5 mRNA表达强度明显增高．而空载体转染细胞与未转染细胞无显著差异：转染PSMB5基因的细胞的PSMB5蛋白表达也显著高于空载体转染细胞。低浓度H2O2作用后，转染PSMB5基因的细胞增殖能力高于空载体转染细胞。【结论】低浓度氧化环境下蛋白酶体历亚单位PSMB5过表达能对人晶状体上皮细胞具有保护作用。     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡

目的 探讨自身免疫调节因子(AIRE)对THP-1单核细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 将THP-1细胞以佛波醇酯(PMA)诱导分化后,进行瞬时转染.免疫荧光和Western blot法检测转染效率.通过Annexin Ⅴ-FITC、PI双染色法和流式细胞仪检测过表达AIRE的THP-1细胞凋亡率.通过间接免疫荧光染色和Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达.结果 PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,形态多样,胞质内可见空泡、吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态.转染48 h后,THP-1细胞的AIRE蛋白呈现明显高表达.对比空载体转染和阴性对照,过表达AIRE使THP-1细胞的凋亡率上升;同时,Western blot显示LC3B-Ⅱ的蛋白水平也较空载体转染组增高,且间接免疫荧光染色提示单个细胞的阳性LC3B-Ⅱ斑点数目较空载体转染组明显增加(P＜0.05).结论 AIRE可能通过上调THP-1细胞的自噬促进其凋亡.     

内皮素—1对肝星形细胞增殖及胶原合成与分泌的调控作用

目的：探讨在体内外内皮素对肝星形细胞（HSC）的DNA摄取、合成以及胶原合成与分泌的影响。方法：本文在分离培养大鼠HSC的基础上，用^3H－胸嘧啶脱氧核酸和^3H-脯氨酸掺入法分析体外培养HSC的DNA提取、合成以及胶原合成与分泌功能，并观察了内皮素对其的影响。结果：内皮素－1对HSC具有显著的促进DNA提取和合成作用，并能够促进肝星形细胞胶原合成和分泌功能（P＜0．05或P＜0．01）。结论：内皮素的促肝纤维化作用与其影响与肝纤维化形成的HSC的调控有关。     

MTT法检测肝癌细胞化疗敏感性方法学探讨

目的：探讨MTT法检测肿瘤细胞化疗敏感性的影响因素。方法：选用肝癌细胞株SMMC7721和BEL7402，采用正交实验设计，分析MTT法检测肿瘤细胞化疗敏感性的条件因素对药敏检测结果的影响。结果：肝癌细胞数与生成的甲Zuan（formasan)的光密度（OD）值呈线性正相关。肝癌细胞数、药物浓度，药物作用时间是影响MTT法检测肿瘤抑制率的重要因素。正交设计应用于MTT法检测肿瘤细胞化疗敏感性，与平行设计的检测结果相关一致。结论；MTT法检测肿瘤细胞化疗敏感性，具有简易、快速、重复性较好等优点，但检测条件（肿瘤细胞数，药物浓度，药物作用时间）可能会严重影响肿瘤抑制率检测结果的和药敏判断。     

Novobiocin类化合物抑制胰腺癌细胞的2D-QSAR研究

目的 为Novobiocin类化合物建立一个有效的2D-QSAR模型来预测其抑制胰腺癌细胞(PL45)的活性,对抑制胰腺癌细胞(PL45)机理研究和发现高活性的Novobiocin类化合物提供参考和帮助.方法 采用密度泛函理论、分子力学和统计学相组合的方法,对23个具有抑制胰腺癌细胞(PL45)的Novobiocin类化合物进行了二维的定量构效关系(2D-QSAR)的研究.结果 所建立的2D-QSAR方程具有较好的回归性(R达到0.767).结论 Novobiocin类化合物分子的酰胺键的氧原子荷电量(QO1)对PL45的抑制活性起着关键的作用;同时,Novobiocin类化合物分子的R基团的大小,SR,也对PL45的抑制活性起着重要的作用.     

High-dose Chemotherapy Combined with Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation as Frontline Therapy for Intermediate/High-risk Diffuse Large B Cell Lymphoma

The role of autologous hematopoietic stem cell transplantation(auto-HSCT)following high-dose chemotherapy has been validated and accepted as a standard treatmen...     

两亲性聚乙烯亚胺修饰量子点构建功能性光学探针用于干细胞治疗的示踪研究

目的：制备新型分子影像探针标记间充质干细胞,以实现细胞荧光成像。方法应用1‐碘十二烷修饰聚乙烯亚胺,构建两亲性大分子。利用大分子自组装性能,包裹疏水性核壳结构CdSe/CdS量子点构建纳米探针。结果该探针在630 nm处呈现出较强的荧光信号,能够促使间充质干细胞高效内吞。体内成像结果显示,与空白对照细胞相比,被标记细胞呈现出显著的光学信号,空白组信号值为1.47 e8[p/s/cm2/sr]/[μW/cm2],实验组信号值为2.78 e8[p/s/cm2/sr]/[μW/cm2]。结论该纳米探针具有良好光学成像性能,可实现细胞标记。     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

【目的】探讨保持胚胎干细胞 (EScells)全能性的体外培养条件。【方法】将ES D3细胞株培养在SNL饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下 ,培养基中加入小鼠白血病抑制因子 (mLIF)或用BuffaloRatLiver(BRL)条件培养基进行培养 ,并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色体分析。【结果】ES D3在上述培养体系中能形成正常形态的克隆 ,并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性 ,而且核型保持稳定。【结论】说明上述各种培养体系均能保持ES D3的高度未分化状态及正常的二倍体核型。     

厄罗替尼单药治疗晚期非小细胞肺癌的疗效和安全性分析

目的 研究厄罗替尼单药治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效和安全性.方法 50例晚期NSCLC患者接受了厄罗替尼治疗,其中19例进行了表皮生长因子受体基因检测.中位生存期采用Kaplan-Meier方法计算.结果 最常见的不良反应为皮疹(96%)和腹泻(32%).中位生存期为21.8月,95%可信区间(CI)为17.1～26.4月.中位无疾病进展生存期为7.0月,95%CI为3.9～10.1月.19例接受表皮生长因子受体基因检测的患者中,突变型8例、野生型11例.突变型和野生型患者的客观有效率分别为62.5%和9.1%,差异具有显著性(X2=6.631,P=0.036);无疾病进展生存期分别为16.330(95%CI2.803～29.857)和5.570月(95%CI2.441～8.699),两者差异具有显著性(X2=8.799,P=0.003).结论 晚期NSCLC患者接受厄罗替尼治疗安全有效.