杂化改性后快速成型支架对骨缺损修复的实验研究

目的 观察以PLGA／β-TCP为原材料,快速成型方法制备的支架为骨架,采用胶原杂化及表面磷灰石沉积对其进行改性的新型骨组织工程材料对骨缺损的修复效果。方法 使用骨髓基质干细胞（BM-SCs）分别与改性前后支架复合,对兔桡骨缺损进行修复。通过X-ray、MicroCT形态学及组织切片病理学,观察改性前后材料降解、新骨生成情况。结果 改性后材料的降解及骨缺损修复能力较改性前有显著性提高,修复1年后改性组骨缺损完全修复。结论 采用胶原杂化及磷灰石表面沉积改性后的PLGA／β-TCP快速成型支架可作为3-D支架应用于骨组织工程。     

胎儿骨髓间充质干细胞复合PLGA支架的形态学观察

目的：探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cens,fBMSCs)与低热高压法制作的聚丙交酯-乙交酯(PLGA)支架材料复合培养,构建组织工程化骨的可行性。方法：预制PLGA支架材料,取5月胎儿肱骨和股骨骨髓,用单核细胞分离液分离fBMSCs,含双抗的低糖DMEM原代和传代培养,侄置显微镜下观察细胞生物学特性,用FITC标记的抗CD105、CD44和用PE标记的抗CD34、CD29对第4代细胞进行流式细胞鉴定,并与PLGA支架材料复合培养1周后行扫描电镜观察。结果：原代及传代培养的fBMSCs增殖较迅速,第4代CD105阳性细胞占84．08％,CD29阳性细胞占88．77％,CD44阳性细胞占89．53％。复合PLGA支架材料细胞生长状态良好。结论：骨髓间充质干细胞(fetal bone marrow mesenehymal stem cells,fBMSCs)是骨组织工程适宜的种子细胞,与低热高压制作的PLGA支架材料复合可体外构建组织工程骨。     

复合支架材料构建组织工程骨修复兔颅骨缺损

目的观察以胶原缓释重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）复合骨髓间充质干细胞（BMSCs）及珊瑚构建的组织工程骨修复颅骨缺损的能力，明确复合BMSCs的组织工程骨修复颅骨缺损后新骨的来源。方法构建三种复合支架材料：（1）rhBMP-2／珊瑚；（2）胶原/rhBMP-2／珊瑚；（3）BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚。将其分别植入兔颅骨缺损处，8周和16周后采用X线片、HE染色、Masson三色染色法、荧光显微镜等观察比较骨缺损修复的情况。通过BrdU标记BMSCs及免疫组化染色方法证实新骨的来源。结果BMSCs／胶原/rhBMP-2／珊瑚组材料修复颅骨缺损的能力最强，且与自体髂骨修复的情况相近；胶原／rhBMP-2／珊瑚组材料次之，rhBMP-2／珊瑚组材料成骨能力较弱。BMSCs参与了新骨组织的形成，新骨组织部分来源于经诱导的BMSCs。结论胶原是rhBMP-2适宜的缓释载体，胶原及BMSCs对促进复合支架材料修复骨缺损有重要意义。BMSCs／胶原／rhBMP-2／珊瑚构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料．     

活性人工骨填充修复兔涂层多孔钛周围骨缺损的生物固定效果

目的评估骨形态发生蛋白（BMP）复合仿生人工骨三维多孔框架材料[聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA）／磷酸三钙（TCP）]修复多孔钛周围骨缺损的可行性。方法将仿生人工骨与提取的BMP复合制备活性人工骨材料。建立修复兔股骨下端多孔钛周围骨缺损模型，应用扫描电镜、能谱分析及生物力学研究该材料的生物固定效果及其特点。结果术后6周，实验组样品孔隙内的能谱图上Ca、P元素的峰已经明显。12周时，实验组样品孔隙内部及其周围的Ca、P含量高于对照组（P〈0．05）。生物力学测定结果显示，所有样品的剪切应力都随时间延长而增大。其中在6周、12周，实验组多孔钛在所有时相点均表现出了比对照组高得多的剪切力（P〈0．05）。结论应用BMP复合PLGA／TCP材料修复假体周围骨缺损，早期能够更好地形成新骨，促进假体生物固定，说明BMP早期骨诱导作用在假体生物固定方面至关重要，具有一定的临床应用潜力。     

不同成分配比聚酯-磷酸三钙复合仿生骨修复骨缺损的实验研究

目的　通过研究复合仿生骨中各组分的最佳配比 ,探索使植入材料降解与新骨形成相匹配的新途径。方法　采用快速成型工艺 (RapidPrototypingManufacturing ,RPM)制备不同成分及配比的聚酯和磷酸三钙 ,分别复合骨形态发生蛋白 (bBMP)后植入兔桡骨缺损 ;于 8、1 2、2 4周进行骨缺损部位X线摄片并取材 ,作大体和组织学观察 ,以Lane SandhuX线和组织学评分标准记分 ,计算机图像分析计算材料降解率。结果　不同时间点作上述检查 ,均见骨缺损部位有不同程度的材料降解及新骨形成 ;所得相关结果分别用SPSS1 0 .0作组间t检验分析 ,以P <0 .0 1为有显著性差异 ;聚去消旋乳酸 (PDLLA) /磷酸三钙 (TCP) (5 :5 )组分别与PDLLA/TCP((7:3)组和PDLLA/TCP(6 :4 )组比较有显著性差异 ,聚丙交酯 乙酯共聚物 (PLGA) /TCP(5 :5 )组分别与PLGA/TCP(7:3)组和PLGA/TCP(6 :4 )组比较有显著性差异 ,PDLLA/TCP(5 :5 )组与PLGA/TCP(5 :5 )组之间亦存在显著性差异。结论　复合材料PLGA/TCP(5 :5 )组和PDLLA/TCP(5 :5 )组骨缺损修复效果良好 ,其成分及配比的选择可作为筛选和构建复合仿生骨支架材料的重要参考指标     

支架材料聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙的细胞毒性检测

目的 检测新型支架材料——聚乳酸-羟基乙酸/磷酸三钙( PLGA/TCP)的细胞毒性.方法 采用扫描电子显微镜观察PLGA/TCP支架材料的表面及内部结构,并选用小鼠L929细胞株,用MTT法体外检测PLGA/TCP复合体的细胞毒性,与已被美国FDA批准应用于临床的PLGA支架材料进行比较.结果 扫描电镜下PLGA/ ...     

脱钙骨基质与左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较

目的探讨左旋聚乳酸／聚磷酸钙纤维（PLLA／CPPf）与同种异体的脱钙骨基质（DBM）对BMSCs黏附作用的差异，为构建组织工程骨提供理想的支架材料。方法用扫描电镜观察两种支架材料的孔径；通过测吸水率比较其亲水性。将普通培养瓶培养的第3代BMSCs分别成骨诱导培养1周后，在体外分别与PLLA／CPPf和同种异体的DBM复合构建组织工程骨，于构建后10h计算细胞黏附率，并用扫描电镜观察比较两种支架材料对BMSCs黏附作用的差异。构建后每天在相差显微镜下观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况，构建后第10天再行扫描电镜观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况。结果DBM的孔径明显较PLLA／CPPf的大，孔隙率高，体外构建后10hDBM组的细胞黏附率为（91．3±8．2）％，PLLA/CPPf组为（82．2±7．7）％，两者之间差异具有统计学意义（P〈0．05）。DBM组于术后第3天网孔间出现细胞外基质，且随着时间的推移，基质变得稠密，而PLLA／CPPf的细胞外基质鲜见；第10天的扫描电镜也证实DBM组的细胞在支架材料上数量多，且细胞外的基质分泌较多。结论DBM较PLLA／CPPf更适于BMSCs的黏附生长，是理想的组织工程支架材料。     

仿生活性人工骨诱导兔椎板间多节段脊柱融合的研究

目的探讨采用先进快速成形(rapidprototyping,RP)制造技术结合骨组织工程方法研制新型仿生活性人工骨,系统研究该人工骨在兔腰椎椎板间多节段脊柱融合的情况。方法首先应用RP技术制备粒度均匀的颗粒型聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙[Poly(DL-lactic-co-glycolicacid)/Tricalciumphosphate,PLGA/TCP]复合人工骨载体材料,进一步将该载体材料与天然提取牛骨形态发生蛋白(bovinebonemorphogeneticprotein,bBMP)高效复合制备仿生活性人工骨,扫描电镜观察RP制备的载体材料及人工骨超微结构。雄性新西兰兔42只,均于L2～4左侧椎板及椎小关节表面分别植入颗粒型PLGA/TCP人工载体材料(A组)、颗粒型仿生活性人工骨(B组)和自体髂骨颗粒(C组),每组14只,于术后4,8和12周定期拍摄脊柱X线片,并于以上时相点按时取材(每组各取材2,2和10只兔),大体观察、手法检测及组织学方法(HE染色、三色光镜观察及四环素-钙黄绿素荧光检测)系统评价脊柱融合情况。结果先进RP制备的PLGA/TCP复合人工骨载体具有规则的空间网状支架结构、相互贯通的孔隙及材料表面微孔特征,均有利于bBMP的高效均匀复合。术后所有实验动物均存活,A组单纯载体材料植入后逐渐降解,但无骨诱导活性及新骨形成能力。B组仿生活性人工骨植入具有强的诱骨活性及骨性融合能力,不仅成骨早、新骨形成量大,而且在新骨形成及改塑的同时载体材料逐渐降解完全,术后12周可形成较为典型的骨小梁及骨髓结构,成骨代谢活性亦接近正常,所形成融合块较大、强度高。C组自体髂骨移植能达到良好的骨性融合,但至术后12周其所形成的新骨结构与B组相比,尚需进一步塑形及完善,所形成的融合块较小。术后12周,三组多节段(L2,3、L3,4)脊柱融合率分别为0%(0/20)、90%(18/20)和55%(11/20),B组融合率显著高于C组(P<0.05),C组融合率显著高于A组(P<0.01)。结论先进RP技术制备的PLGA/TCP人工载体不仅具有良好的空间超微结构及孔隙特性,而且能高效复合bBMP以正确构建组织工程仿生活性人工骨。该仿生活性人工骨诱导兔椎板间多节段的脊柱融合获得成功,其融合率明显高于自体髂骨移植,从而有望成为脊柱外科所需的新型人工骨移植材料。中、远期疗效的深入研究有待进一步开展。     

转基因修饰的组织工程骨在兔腰椎横突间融合中的应用

目的 探讨以携带有人骨形态发生蛋白（BMP）-2基因片段的复制缺陷重组腺病毒（Ad—BMP-2）转基因修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为种子细胞，以脱细胞脱钙骨基质材料为支架构建组织工程人工骨用于兔腰椎横突间融合的可行性。方法选择18只日本大耳白兔，在L5,6行单节段双侧横突间融合术，依植入融合材料分为3组：A组为转基因修饰的组织工程骨组；B组为自体髂骨组；C组为单纯支架组。每组12侧。术后12周取出融合节段脊柱，通过大体观察、组织学、影像学及生物力学等方法检测脊柱融合情况。结果三组横突间融合成功率分别为84％（10／12）、75％（9／12）和8％（1／12）；组织学、影像学及生物力学检测证实，A、B组成骨活跃，脊柱融合的硬度和强度显著高于C组。结论 转基因修饰的组织工程骨用于脊柱融合可以达到很好的治疗效果。     

以PLGA为支架的组织工程脂肪的实验研究

目的：研究以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料的可行性。方法：实验组：取兔的脂肪间充质干细胞，行体外扩增培养至第3代，达到一定数量后成脂诱导1周，接种于PLGA支架上，继续诱导1周，置于兔背部肩胛骨两侧皮下，分别于4、8周从大体和组织学方面观察脂肪形成情况；对照组：单纯以未接种细胞的支架移植于兔背部肩胛骨两侧皮下，于相同时间点进行检测。结果：实验组植入4周后，该复合物在支架中有脂肪形成，并可见细胞突入支架材料中；8周后支架材料继续降解，脂肪组织形成明显，伴有少量血管长入。对照组支架材料逐渐崩解，未见脂肪组织形成。结论：以PLGA为支架材料形成的组织工程脂肪作为软组织填充材料提供了一个好的思路。     

β1-磷酸三钙／α-半水硫酸钙复合人工骨的水热合成与性能检测

目的水热合成β-磷酸三钙／α-半水硫酸钙（β—TCP／α—CSH））复合人工骨,并检测其作为植骨材料的性能指标。方法用牛松质骨煅烧获得的多孔β-TCP与二水硫酸钙粉末按一定比例混合,置于水热釜中,同步水热合成β—TCP／α-CSH,比例分别为7：3、5：5、3：7的复合人工骨,并进行x线衍射、扫描电镜、孔隙率、自固化性能和生物力学检测。结果x线衍射检测结果显示制备的复合人工骨颗粒主要成分为β—TCP、α—CSH和少量的羟基磷灰石,扫描电镜结果显示复合人工骨具有孔隙结构,孔隙由大孔／微孔结构组成,孔隙率为49．85％～56．75％,保持天然松质骨双峰曲线的孔隙结构,β-TCP／α-CSH复合人工骨具有原位自固化性能,压缩强度3．23～9．24MPa。结论利用多孔β-TCP和二水硫酸钙能够同步水热合成β-TCP／α-CSH复合人工骨,该人工骨具有天然松质骨的孔隙机构,并具有自固化性能。     

右归丸对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和凋亡的影响

目的观察右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、骨髓细胞周期和凋亡的影响,探讨其可能造血调控作用机制。方法用全自动血细胞分析仪、白细胞计数法和流式细胞术（FCM）分别检测右归丸对骨髓抑制小鼠外周血、骨髓有核细胞数以及骨髓细胞周期和调亡的影响。结果右归丸中、高剂量均能明显升高外周血红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、骨髓有核细胞（BMC）数,右归丸高剂量对血小板（PLT）和白细胞（WBC）有明显升高作用。右归丸低、高剂量组均能促进骨髓GO／G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2／M期细胞的转化,从而导致G2／M期细胞比例明显升高,增殖指数（PI）也明显升高。中、低剂量组右归丸的骨髓细胞凋亡比例显著下降。结论右归丸可能通过促进骨髓细胞修复受损的DNA,加速通过GI／S和S期监测点,进行增殖和分化;抑制造血细胞的凋亡;调节造血细胞增殖与凋亡之间的平衡等机制,从而促进损伤骨髓造血功能恢复。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离方法,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法。方法取大鼠骨髓,全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增。倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞。用MTT法间接测定不同代数细胞活力。诱导分化,先用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导（BHA）和二甲基亚砜（DMSO）诱导。观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞。结果全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性,CD45阴性。MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞。细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白（β-Ⅲ-Tubulin）、巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）表达阳性。结论采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞。     

白藜芦醇促进γ射线照射小鼠造血系统损伤修复的作用

目的观察白藜芦醇对60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤修复的影响。方法 ICR小鼠随机分成5组,即正常对照组、照射对照组以及白藜芦醇50、100、200 mg.kg-1照射组,照射前3 d灌服给药,每天1次。除正常对照组外,所有小鼠60Co射线全身5.5 Gy辐照1次,照射后第7天小鼠取骨髓细胞和脾脏,对骨髓单个核细胞和脾集落形成单位进行计数,测定骨髓细胞DNA含量和细胞周期。结果与正常对照组比较,照射对照组小鼠骨髓单个核细胞数和骨髓细胞DNA含量显著降低（P〈0.05）,脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）;与照射对照组比较,白藜芦醇100、200 mg.kg-1照射组小鼠照射骨髓单个核细胞数、骨髓细胞DNA含量、脾集落形成单位数和S和G2/M期细胞百分率显著增多（P〈0.05）,白藜芦醇50 mg.kg-1照射组有增多趋势。结论白藜芦醇可以促进60Coγ射线照射小鼠造血系统损伤的恢复,防护效果与给药剂量相关。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

IMB联合SEM检测乳腺癌患者骨髓微转移的临床意义

目的：探讨免疫磁珠（immunomagnetic beads,IMB）联合扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）检测乳腺癌患者骨髓微转移（bone marrow micrometastasis,BMM）的临床意义。方法：采用IMB富集联合SEM鉴定的方法检测106例乳腺癌患者骨髓有核细胞中上皮来源细胞的阳性发生率,分析其与原发肿瘤大小、临床分期、腋淋巴结转移、病理组织学分级、雌孕激素受体蛋白（ER、PR）表达及术后1年远端转移发生情况等常用病理学观测指标的关系。结果：106例乳腺癌骨髓标本中,37例检测到肿瘤细胞,骨髓微转移阳性率为34．9％;乳腺癌BMM阳性率与原发肿瘤大小正相关（P〈0．05）;临床分期越晚,出现BMM的概率也越高（P〈0．01）;BMM不仅与腋淋巴结是否转移有关（P〈0．05）,且随淋巴结转移数目增加,BMM阳性率亦增高（P〈0．05）;此外,乳腺癌BMM阳性率还与病理组织学分级正相关（P〈0．05）;与ER、PR蛋白在肿瘤组织中的表达负相关（P〈0．05）;与术后1年内患者是否发生远端转移正相关（P〈0．05）。结论：IMB联合SEM检测骨髓微转移是具有潜在应用价值的乳腺癌早期诊断方法和预后指标。     

shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中的长期高效表达

目的构建在小鼠造血干细胞中高效表达的shRNA重组慢病毒载体并研究其在小鼠造血系统中的长期稳定表达。方法将p-CMV和重组并鉴定正确的p-SFFV慢病毒载体与辅助病毒载体PAX2和PMD2G混合后,采用磷酸钙方法共转染293T包装细胞,获得具有感染能力的成熟慢病毒感染经流式细胞仪分选并体外培养的小鼠骨髓造血干细胞,分析其表达效率后,选取感染效率较高的p-SFFV慢病毒载体感染小鼠骨髓造血干细胞,并通过骨髓移植技术输入放射线照射后的小鼠体内。在移植后4周和9周分别获取小鼠外周血样本,移植后16周获取小鼠骨髓样本,分析供体细胞在小鼠体内的表达。结果成功重组了p-SFFV慢病毒载体并在小鼠骨髓造血干细胞中高效表达（感染效率72.4%）;骨髓移植实验表明,携带外源性shRNA的慢病毒载体可在小鼠造血系统内长期稳定表达（感染效率92%）。结论shRNA重组慢病毒载体在小鼠造血系统中可长期稳定表达。