生物样品中蓖麻毒素的双夹心酶联免疫定量检测方法及应用

目的建立定量检测生物样品中蓖麻毒素的双夹心ELISA方法并研究毒素在大鼠体内的分布。方法利用抗蓖麻毒素的单克隆抗体（MAb）3D74和辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠抗蓖麻毒素单克隆抗体4C13,建立了定量检测血清和组织样品中蓖麻毒素的双夹心ELISA方法,并对方法学进行了必要的验证。结果建立的双抗夹心ELlSA方法检测纽织中蓖麻毒素的浓度范围为1．25～320-g／ml,最低定量限为2．5ngy／ml,日内和日间精密度分另Ij小于3．5％和9％。将该方法应用于蓖麻毒素组织分布的定量测定,结果显示,大鼠静脉染毒后毒素可以在心、肝、脾、肺、肾、肠和脂肪等组织分布,以脾脏的分布为最高,其次为肝脏,染毒后0．5和2h脾与血清的比值分别为3．9和7．2。在脑和肌肉中未检出毒素。结论建立的双夹心ELISA方法简便、灵敏,可以用于定量检测血清和组织等生物样品中的毒素含量,为蓖麻毒素的毒物代谢动力学研究及毒素中毒的快速检测提供了技术支撑。     

膨化脱毒处理后蓖麻籽粕中蓖麻毒素的检测

目的检测膨化脱毒蓖麻籽粕中的残余毒素。方法蓖麻籽粕经过粉碎、匀浆及离心后得到匀浆上清,应用酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫印迹、金标免疫层析试纸检测蓖麻籽粕在PBST匀浆上清中的蓖麻毒素;应用细胞生长抑制实验测定蓖麻籽粕在生理盐水匀浆上清的细胞毒性。结果经双夹心ELISA检测蓖麻原粕匀浆含有较高浓度的蓖麻毒素,达到0.25 mg/g;对细胞生长有明显的抑制作用;应用蓖麻毒素检测试纸显示强阳性条带。应用试纸条检测经加热膨化处理后的样品只显示微弱条带。ELISA检测结果表明加热膨化处理后蓖麻籽粕中的毒素含量明显下降,脱毒率达到99%以上。加热膨化处理后样品的匀浆上清在高浓度时对细胞生长仍有一定抑制作用,但与原粕比较细胞毒性明显下降;应用免疫印迹检测蓖麻籽粕结果与ELISA和细胞实验结果一致。结论本研究将ELISA、免疫印迹和免疫层析试纸相结合,建立了有效检测蓖麻籽粕中残余蓖麻毒素的方法,为蓖麻籽粕脱毒处理样品的质量检测及其应用提供了实验依据。     

基于双抗体夹心ELISA建立人血浆肌钙蛋白Ⅰ的定量测定技术

目的 基于双抗体夹心ELISA技术建立人血浆肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)定量检测方法,便于基层医疗机构使用.方法 基于抗原、抗体筛选,包被抗体、酶标抗体用量优化,建立双抗体夹心ELISA检测cTnI的方法.测定cTnI标准抗原,利用Curve Expert软件建立定量公式,根据临床大型仪器实测结果校准定量公式,实现ELISA测定D值到血浆中cTnI浓度的直接定量.结果与结论 双抗体夹心ELISA测量cTnI的敏感性可达0.1 ng/ml,敏感性满足临床要求.小样本临床样品的评价实验显示,双抗体夹心ELISA定量结果与临床大型仪器测得的浓度差异无统计学意义(t=0.058,P＞0.05).所建立的双抗体夹心ELISA法可用于定量检测人血浆cTnI.     

人可溶性OX40L蛋白ELISA检测试剂盒的研制及其在自身免疫性疾病诊断中的应用

目的研制特异性检测人可溶性OX40L蛋白（sOX40L）的ELISA试剂盒,探讨其在自身免疫性疾病临床诊断中的应用。方法利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人OX40L单克隆抗体1G1和4C12分别作为包被抗体和检测抗体,采用双抗体酶联免疫夹心法研制特异性检测人sOX40L的ELISA方法,并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果①建立的检测人sOX40L酶联免疫试剂盒在抗原浓度为3.91～250ng/ml范围内有良好的线性关系,并具有良好的稳定性、较高的准确性和特异性。②利用该ELISA方法检测到sOX40L蛋白在肾病综合征和Graves’病患者血清中表达水平均显著高于健康对照组。结论成功建立了检测人sOX40L蛋白的ELISA试剂盒,应用该方法检测到sOX40L在多种自身免疫病患者血清中异常高表达。该试剂盒在OX40L分子基础研究以及自身免疫病的临床诊断方面具有潜在的应用价值。     

Eg犬粪抗原与多克隆抗体结合的条件筛选与纯化

包虫病又称棘球蚴病,此病是由细粒棘球绦虫引起的一类严重的人兽共患寄生虫病,它严重危害人类与家畜的健康,并对畜牧业造成危害与阻碍。了解终末宿主犬科动物粪样中细粒棘球绦虫虫体蛋白组成,寻找特异性的靶抗原能对包虫病的预防和提高双抗夹心ELISA检测的敏感性与特异性提供重要依据。本文通过对缓冲溶液的筛选,多克隆血清与粪抗原结合条件的筛选,确定抗体与抗原结合最佳配比浓度,用亲和层析与凝胶层析对抗原抗体结合物纯化分离,并检测纯化后样品的敏感性和特异性。最终确定PBST和柠檬酸缓冲液都能用于溶解犬粪中细粒棘球绦虫可溶性抗原,且抗原抗体最佳结合浓度选用溶液体积不变情况下,多克隆血清占比20%与粪抗原结合。抗原抗体结合物通过凝胶层析柱在A峰(45.5～50.5 min附近)接收的样品中含有纯化的抗原抗体结合物。本研究的结果与方法可以为以后筛选鉴定靶抗原,提高粪抗原ELISA检测试剂盒的敏感性与特异性提供重要依据。     

乙型肝炎病毒大蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立及应用

目的 建立定量检测患者血清HBV-大蛋白（LP）的TRFIA.方法 以抗人HBV-LP单克隆抗体和抗HBs多克隆抗体分别作为固相抗体和铕标记抗体,应用TRFIA和ELISA对标准品、66份慢性乙型肝炎患者血清、30份健康体格检查者血清中HBV-LP进行检测.分析TRFIA和ELISA的有效检测范围等,统计学比较采用χ^2检验和直线相关分析.结果 标准品TRFIA检测结果示该法剂量-反应曲线呈良好线性相关（r=0.999）.ELISA法测得的正常（30份健康者血清）95％参考范围为0～1.36 mg/L.TRFIA灵敏度（最小测定值）为0.10 mg/L,30份健康血清HBV-LP的检测结果均正常,特异性100％.66份患者血清TRFIA与ELISA检测结果的r为0.800 9（P＜0.001）,两者检测的阳性率差异有统计学意义[89.4％ （59/66）与77.3％（51/66）,χ^2=6.13,P＜0.01].TRFIA有效可测范围（CV＜ 10％）为1.35～2 764.00 mg/L,ELISA为10.80～691.00 mg/L.TRFIA回收率范围为95.93％ ～ 107.62％.结论 TRFIA法检测患者血清中的HBV-LP灵敏度和特异性高,检测范围宽,对早期筛选HBV患者及监测抗病毒治疗的疗效具有潜在的价值.     

沙眼衣原体夹心ELISA检测方法的实验研究及临床应用

目的；建立沙眼衣原体（Ct Serotype）K－D抗原夹心ELISA实验室诊断方法，用于沙眼衣原体感染的诊断。方法：选择高特异性和敏感性的沙眼衣原体McAb5D9和1D6混合物为捕获抗体，以鸡胚卵黄囊吸收后的PcAD为标记抗体，进行沙眼衣原体夹心ELISA检测方法的实验研究。结果：应用该方法对192例疑为非淋菌性尿道炎的临床标本检测，其中40例阳性，阳性松出率为20.81%；并以PCR作平行检测，42例阳性，阳性为21.87%，两种方法检测结果经统计学处理无显著差异（P＞0.05）。结论：夹心ELISA法检测沙眼衣原体，具有特异、敏感、快速、简便，不需要特殖仪器设备等优点，对沙眼衣原体感染的临床诊断和治疗具有重要的临床意义。     

HPVl6L1蛋白血清学诊断宫颈癌临床效果观察

目的：探讨基因重组人乳头瘤病毒（HPV）16L1蛋白的血清学诊断宫颈癌的临床意义。方法：选择63例宫颈癌患者，采用PCR方法检测宫颈癌组织的HPV型别；并采用重组原核表达系统制备HPV16L1蛋白，检测其血清HPV16L1抗体。结果：宫颈癌HPV通用型DNA阳性率50．8％，HPV16DNA阳性率46％，HPV18DNA阳性率3．2％。宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性率44．4％，与健康对照组和尖锐湿疣组比较，差异非常显著（P〈0．01）。HPV16DNA检测法与HPV16L1ELISA血清抗体检测法两者间相关显著（P〈0．05）。结论：宫颈癌患者以HPV16感染为多见，HPV16L1血清ELISA抗体检测可用作HPV16感染的血清学诊断和宫颈癌的免疫学研究。     

亚甲蓝/光化学灭活病毒法对血浆中抗体活性的影响

目的：研究亚甲蓝／光化学灭活病毒技术对人血浆中抗体活性的影响。方法：将不同浓度的亚甲蓝分别加入含有特种抗体的血浆中，经JY—Ⅰ型血浆病毒灭活仪处理后取样，用ELISA等方法检测血浆中的抗体活性。结果：在光照度40000lx条件下，经1μmol／L亚甲蓝作用30min，人血浆中的抗体活性未见明显改变，但随着亚甲蓝浓度的升高和光照时间的延长，血浆中的抗体活性略有下降。结论：本研究的亚甲蓝／光化学灭活病毒技术对血浆中的抗体活性影响较小，可用该技术对康复期的SARS患者血浆进行病毒灭活处理，保证该血浆临床应用的安全性。     

抗—HIV单克隆抗体的的筛选与鉴定

我们用HIV抗体阳性者血浆包被聚苯乙烯条，加入纯化的HIV组织培养抗原，通过夹心ELISA法，筛选出3株能分泌抗HIV单克隆抗体杂交瘤细胞，传代稳定。培养上清经Westernblot染色鉴定含有抗-HIVgag蛋白，夹心ELISA法测得杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体滴达到1：6400，接种BALB/C小鼠获腹水抗体效价为1：2430000。实验表明，用此单克隆抗体检测HIV病人血清抗体敏感、特异、稳定、重复性好，是一种良好的试剂。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

脑脊液中S100B蛋白与昏迷患者预后的关系

目的比较患者昏迷与苏醒时脑脊液S100B蛋白水平,探讨脑脊液S100B蛋白指导治疗昏迷患者的临床意义及入院时GCS评分与脑脊液S100B蛋白变化之间的相关性。方法用双抗体夹心ELISA检测17例患者昏迷初期与苏醒时脑脊液S100B蛋白水平。结果 17例患者苏醒时脑脊液中S100B蛋白水平显著降低（t=3.735,P=0.002）,昏迷初期脑脊液S100B蛋白含量与GOS之间有显著的负相关关系（r=-0.64,P=0.006）,与入院时GCS之间有显著的负相关关系（P=0.002,r=-0.689）。57例患者入院时GCS与GOS存在显著的正相关关系（rp=0.416,P=0.001）。结论脑脊液S100B蛋白检测可早期有效评估脑损伤程度,指导昏迷患者的临床治疗及评估昏迷患者的预后。     

HPLC法测定生丹颗粒中补骨脂素及异补骨脂素的含量

目的建立生丹颗粒中补骨脂素、异补骨脂素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法,以AgilentZorbaxSB-C18（4.6mm×250mm,5μm）为色谱柱;流动相：甲醇-水（50∶50）;检测波长：246nm;流速：1.0ml/min;柱温：40℃;结果补骨酯素在1.135～45.400μg·ml^-1范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9998）;异补骨酯素在1.035～41.400μg·ml^-1范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9999）;样品补骨脂素的平均回收率98.0%,RSD为1.1%（n=6）;异补骨脂素的平均回收率97.8%,RSD为0.9%。结论此方法简便、快速,可作为生丹颗粒中补骨脂素、异补骨脂素的含量测定方法。     

抗大鼠HSP70蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

目的制备大鼠HSP70蛋白单克隆抗体并对其性质进行研究。方法利用PCR技术扩增大鼠全长hsp70,插入表达质粒pET-28a,pMAL-c2x,诱导表达,采用亲和层析纯化融合蛋白;用HIS-HSP70融合蛋白免疫BALB/c小鼠,杂交瘤技术制备大鼠HSP70单克隆抗体;采用Western印迹和免疫组化方法对抗体性质进行鉴定,ELISA方法确定抗体的表型。结果亲和层析纯化HIS-HSP70蛋白纯度在97.6%,获得6株可稳定分泌抗HSP70mAb的杂交瘤细胞系;抗体的亚类均是IgG1类κ链的。Western印迹结果显示6株单抗均能识别天然的大鼠HSP70蛋白;免疫组化结果显示3株抗体可以识别组织的HSP70蛋白。结论成功获得6株有活性HSP70单克隆抗体,可以识别HSP70蛋白不同表位,为进一步研究HSP70单克隆抗体在疾病中的作用奠定基础。     

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清瘦素水平的变化

目的观察阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）患者血清瘦素（leptin）水平的变化。方法对20例OSAHS患者和20例健康成人进行多导睡眠监测（Polysomnography,PSG）,用ELISA双抗体夹心法测定患者血清leptin水平。结果 OSAHS患者组与健康对照组血清leptin比较明显升高,差异有统计学意义（P〈0.01）,并且leptin水平与OSAHS患者睡眠暂停低通气指数（AHI）呈正相关。结论患者血清leptin水平与OS-AHS患者病情严重程度呈正相关。     

结核分枝杆菌Rv3873抗原表位预测及其蛋白片段抗原性研究

目的对结核分枝杆菌Rv3873进行生物信息学分析及抗原表位预测,原核表达Rv3873基因21～235位氨基酸蛋白片段,命名为Rv387321～235重组蛋白,初步分析其抗原性。方法 PCR扩增结核分枝杆菌Rv3873 21～235位氨基酸的基因片段,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得重组蛋白并纯化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对Rv387321～235重组蛋白进行抗原性检测。结果具有优势抗原表位的Rv3873蛋白片段在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,Rv387321～235重组蛋白在结核病检测中的敏感性为28%,特异性94.6%。结论生物信息学预测Rv3873基因抗原表位,为寻找有价值的抗原靶点提供了参考;具有优势抗原表位的重组蛋白片段在结核病诊断中具有潜在应用价值,可作为联合诊断的备选抗原之一。     

蝶酸对天然蓖麻毒素及重组蓖麻毒素A链蛋白的拮抗作用研究

目的研究蝶酸（pterinacid,PTA）对天然蓖麻毒素（ricin）及重组蓖麻毒素A链蛋白（rRTA）的拮抗作用。方法用无细胞体系中荧光素酶合成抑制实验和体外细胞毒性实验评价PTA对全分子ricin和rRTA的拮抗效果。结果PTA在两种体系中均显示出了对ricin和rRTA的拮抗作用,且呈剂量依赖性。结论利用PTA作为小分子探针,建立了针对ricin/RTA小分子抑制剂的体外生物学评价系统,为以后用于拮抗ricin/RTA的全新小分子化合物筛选奠定了基础。     

Detection of proteinous toxins using the Bio-Threat Alert system, part 3: effects of heat pretreatment and interfering substances

We previously reported that the Guardian Bio-Threat Alert (BTA) system could detect (detection limit: about 0.1 μg/ml) staphylococcal enterotoxin B (SEB), botulinum toxins (BTX) A and B, and ricin, with no interference by white-powdered materials or colored matrices. In this study, the capability of the BTA system was further assessed. With 10 min of preheating at 60°C, all toxins could be detected, but with preheating at 80°C, BTX A and B and ricin became undetectable. About 20% SEB could be detected after heating at 80°C, but this detection ability was completely removed after heating at 100°C. The effects of chemicals usually used for decontamination, such as sodium hypochlorite, hydrogen peroxide, formaldehyde, and sodium nitrite, on the detectability of SEB, BTX A, or ricin in the BTA system were also tested. The concentrations giving 50% line intensity for SEB, BTX A, and ricin were 3.1, 11, and 15 μM for sodium hypochlorite and 88, 210, and 60 mM for formaldehyde, respectively. The addition of hydrogen peroxide or sodium nitrite did not decrease the detectability even when used at high concentrations.