重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究

目的探讨纯化的重组结核分枝杆菌多表位肽激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达多表位肽刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定重组多表位肽的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,多表位肽(10μmol)能刺激全部10例HLA-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖,SI为46.2±5.6;增殖反应明显高于单肽(平均SI为10.2±2.3)以及PPD(平均SI为15.6±3.6)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在多表位肽诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μmol)的T2细胞作为靶细胞,多表位肽诱导的CTL作为效应细胞,多表位肽能诱导全部的10例A2+PPD+健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(86.2±9.6%),显著高于单肽[平均为(25.4±3.6)%]和PPD[平均为(22.6±2.8)%](P<0.01)。结论重组优化多表位肽在细胞水平具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性。     

阿尔茨海默病多肽表位疫苗免疫原性研究

目的以淀粉样蛋白Aβ作为免疫靶标,优化阿尔茨海默病多肽B细胞表位疫苗。方法化学合成人Aβ1-42多肽、含B细胞表位的Aβ1-15多肽、含两个B细胞表位及一个辅助T细胞表位PADRE的多肽Aβ（1-15）2-PADRE及含13个氨基酸的PADRE。以上4种多肽免疫普通BALB/c小鼠,ELISA试验比较免疫后的小鼠血清抗体水平和亚型,点杂交分析其与不同状态Aβ的结合免疫特性。结果 Aβ（1-15）2-PADRE组免疫后诱导产生了良好的免疫效果,100μg组4次免疫后其抗体滴度可以达到1∶3500;抗体亚型分析后得知,其主要产生IgG1型抗体,免疫反应完全偏向于Th2型,其免疫血清可与不同状态Aβ的结合免疫特性不同。结论辅助T细胞表位PADRE增强了B细胞表位Aβ1-15的免疫效果,并且其免疫血清抗体与Aβ寡聚体结合效果更好。     

结核分枝杆菌Rv3873抗原表位预测及其蛋白片段抗原性研究

目的对结核分枝杆菌Rv3873进行生物信息学分析及抗原表位预测,原核表达Rv3873基因21～235位氨基酸蛋白片段,命名为Rv387321～235重组蛋白,初步分析其抗原性。方法 PCR扩增结核分枝杆菌Rv3873 21～235位氨基酸的基因片段,构建其原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得重组蛋白并纯化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）对Rv387321～235重组蛋白进行抗原性检测。结果具有优势抗原表位的Rv3873蛋白片段在大肠杆菌中高效表达;ELISA结果显示,Rv387321～235重组蛋白在结核病检测中的敏感性为28%,特异性94.6%。结论生物信息学预测Rv3873基因抗原表位,为寻找有价值的抗原靶点提供了参考;具有优势抗原表位的重组蛋白片段在结核病诊断中具有潜在应用价值,可作为联合诊断的备选抗原之一。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗的免疫原性和治疗作用

目的 研究结核分枝杆菌Ag85A DNA 疫苗的免疫原性和治疗作用.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组,分别用生理盐水、pVAX1载体、微卡菌苗、Ag85A DNA 疫苗免疫,每2周肌内注射1次,共3次.研究 Ag85A DNA 疫苗的免疫原性.用结核分枝杆菌H37Rv通过尾静脉注射40只BALB/c小鼠,分别用生理盐水、pVAX1载体、利福平、Ag 85A DNA 疫苗治疗.治疗结束后2周杀鼠,观察肺和脾病理改变,称取重量、做菌落计数,用ELISPOT方法检测小鼠分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞斑点数.结果 与其他组比较,Ag 85A DNA疫苗能诱导产生大量Ag85A特异的分泌IFN-γ 的T淋巴细胞(S=11.832,P=0.0080).肺组织病理显示:生理盐水组肺组织病变严重、广泛;载体组比生理盐水组病变略轻,但病变仍较重、广泛;Ag 85A DNA 疫苗组肺组织病变减轻、局限,3/5区域肺泡结构完整,清晰;利福平组肺组织无病变.与生理盐水组比较,Ag85A DNA 疫苗组和利福平组肺脏菌落数分别减少0.73 log和2.11 log;肝脏菌落数分别减少0.88 log和2.11 log(P<0.01).结论 Ag85A DNA 疫苗对小鼠结核病具有较好的治疗效果.     

结核分枝杆菌抗原蛋白38×10~3抗原表位预测及其蛋白片段抗原性研究

目的筛选出一种结核分枝杆菌（MTB）特异性诊断标志物。方法对MTB重组蛋白抗原38×103的基因组序列进行生物信息学分析及抗原表位预测,原核表达38×103基因序列121～182和238～374位氨基酸蛋白片段,分别命名为T38和P38重组蛋白;采用蛋白芯片对T38和P38重组蛋白进行抗原性检测。结果经蛋白芯片检测94例阳性和128例阴性样本,结果显示,P38重组蛋白在结核病检测中的敏感性为81.9%,特异性为80.5%,但是T38重组蛋白特异性不佳。结论生物信息学预测38×103基因抗原表位,为寻找有价值的抗原靶点提供了参考;重组蛋白片段P38在结核病诊断中具有潜在应用价值,可作为联合诊断的备选抗原之一。     

结核分枝杆菌抗原Ag85A(Rv3840c)限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的预测及鉴定新的HLA-A*0201结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Ag85A中的CD8+CTL优势表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测可能存在的HLA-A*0201的限制性CD8+CTL表位,并经流式细胞术分析抗原肽与HLA-A*0201的亲和力、经时间荧光分辨法检测结核(TB)患者外周血单个核细胞(PBMCs)对抗原肽的增殖反应,再通过细胞毒实验研究抗原肽诱导的T细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。结果位于Ag85A氨基酸序列(48-56)的肽表位与HLA-A*0201分子具有较高的亲和力,并能刺激HLA-A*0201阳性结核患者PBMC增殖,诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽6(GLPVEYLQV,48-56aa)是Mtb抗原Ag85A的HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,这为今后进一步研究结核杆菌,作为设计结核疫苗的候选表位奠定了一些基础。     

QLFATINSTL(93-102aa)是隐球菌抗原MP98 CTL优势表位

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定MP98的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽3(93-102aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体PBMC增殖,并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽3 QLFATINSTL(93-102aa)是抗原MP98上HLA-A*0201限制性CD8+CTL的优势表位,可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

链霉素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒小鼠体内抗结核菌活性的研究

目的观察链霉素纳米粒的小鼠体内抗结核作用。方法以被结核分枝杆菌感染的小鼠为实验动物,以小鼠的体重变化、死亡率、心、肝、脾、肺等重要脏器的重量指数变化及病理改变为评判指标,对链霉素纳米粒的体内抗结核作用进行了观察,并与非纳米化的普通链霉素进行了对比。结果链霉素纳米粒在降低结核感染模型动物死亡率及减轻肺脏病变程度的作用方面均较普通链霉素有较大的增强。结论链霉素纳米化后抗结核作用增强。     

链霉素对结核分枝杆菌sRNA表达影响的研究

目的：研究链霉素对结核分枝杆菌非编码sRNA表达量的影响,探讨sRNA是否参与细菌与药物的相互作用。方法基于结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的高通量测序结果,选出表达量估计值较高的4个sRNA作为研究对象,根据链霉素的最小抑菌浓度（MIC）对标准菌株H37Rv进行不同浓度和不同时间的链霉素诱导,提取各组菌液的总RNA,通过实时定量逆转录聚合酶链反应（ qRT－PCR）检测4种sRNA在各组中的表达量,比较不同抑菌浓度和不同时间的链霉素作用下sRNA的表达量差异。结果当链霉素浓度在1／2MIC时对结核分枝杆菌的生长产生明显抑制作用;在4种sRNA中,MTS2823表达量最高,F6表达量相对较低;MTS1338在4MIC浓度的链霉素处理18 h即出现表达上调;在4MIC浓度链霉素作用6 d后,MTS1338和mcr11表达量分别出现（4．80±1．14）倍和（2．91±0．86）倍上调,而MTS2823表达下调。在各组药物处理组中F6表达量的变化均不明显。结论链霉素对结核分枝杆菌sRNA的表达可产生促进或抑制作用,提示sRNA可对某些基因进行转录后调控,促进或拮抗链霉素对结核分枝杆菌的作用。     

可口革囊星虫多肽在运动中抗自由基作用的实验研究

目的:探讨可口革囊星虫多肽在SD大鼠运动模型中的抗氧化功效。方法:用传统水煮方法提取星虫蛋白质,同时用蛋白酶将提取的蛋白质水解成小肽,并用阳离子交换层析柱对星虫肽进行纯化,最后采用冷冻干燥制备出星虫肽。50只雄性SD大鼠分为运动组和安静组两大组,每组又分为对应的4小组:分别将配制好的高、低剂量的星虫肽溶液灌胃补充给相对应组大鼠,同时设计了生理盐水、星虫蛋白组作为对照;运动组进行游泳训练;2周后各组大鼠取材测试,用血细胞分析仪测定血液RBC、Hb与HCT等指标,采用生化试剂盒测定血清SOD、GSH-PX、NOS活性,肝组织SOD、GSH-PX活性,肝组织LPO和腓肠肌糖原含量。结果:(1)星虫蛋白质的分子量主要由66kd以上、27kd、9.5kd和4.1～6.5kd四部分组成,水解度后星虫肽分子量主要分布在1.0～4.1kd之间。(2)低剂量星虫肽运动组大鼠RBC、Hb、HCT水平(6.80×1012/L、133.7g/L、35.3%)与生理盐水运动组和星虫蛋白运动组比较显著提高(P<0.05)。高、低剂量星虫肽运动组血清与肝组织的SOD、GSH-PX活性相对生理盐水运动组和星虫蛋白运动组均明显提高(P<0.05),且高剂量组比低剂量组提高更显著;高、低剂量运动组之间血清SOD、SH-PX活性有显著差异(P<0.05),高、低剂量运动组之间的肝组织GSH-PX活性有显著性差异(P<0.05);高、低剂量星虫肽运动组血清NOS和肝组织LPO含量显著低于生理盐水运动组和星虫蛋白运动组(P<0.05)。高、低剂量星虫肽运动组腓肠肌糖原含量低于生理盐水运动组和星虫蛋白运动组,而高、低剂量星虫肽安静组腓肠肌糖原含量高于生理盐水和星虫蛋白安静组,但无显著性差异(P>0.05)。结论:可口革囊星虫多肽可提高大鼠RBC、Hb、HCT水平,同时提高血清SOD、GSH-PX活性,降低血清NOS活性,降低肝组织LPO含量,因此星虫肽有抗组织缺血、抗氧化等功效,是一种有效的运动抗氧化剂。     

几类生物活性肽的研究进展

生物体中存在许多活性肽，它们具有不同的空间结构和生物功能，参与重要的生命活动。生物活动肽具有重要的基础研究及临床应用价值。因此，活性肽一直是生物化学和生物药物研究中的一个热点。本文综述了近期抗菌肽、多肽生长因子、免疫肽以及抗凝肽等几类活性肽研究的一些进展。     

灭活草分枝杆菌注射剂佐治耐药肺结核病的统计分析

目的评价灭活草分支杆菌注射剂佐治耐药肺结核的疗效与安全性。方法搜集公开发表的有关灭活草分枝杆菌注射剂对耐药肺结核治疗效果,设计严密的临床研究,按Meta分析的要求对检索到的原始研究进行质量评估,对符合条件的所有研究结果进行Meta分析。结果符合纳入标准的文献共6篇,总样本量424例。佐用灭活草分支杆菌注射剂组212例其中有空洞者155例,病灶吸收185例,痰菌转阴169例,空洞闭合110例;未佐用灭活草分支杆菌注射剂组212例其中有空洞者151例,病灶吸收117例,痰菌转阴104例,空洞闭合60例。3项疗效指标合并OR值分别为5.55、4.66、4.36,整体效应检验P值均〈0.00001,表明疗效有非常显著性差异。结论灭活草分支杆菌注射剂能增强耐药肺结核化疗的效果,适合作为免疫治疗药物佐治耐药肺结核。     

T细胞斑点实验与结核杆菌DNA检测对肠结核的诊断价值

目的 探讨结核杆菌T细胞斑点实验（T-spot-TB）与结核杆菌DNA检测在肠结核诊断中的应用价值.方法 对2009年6月～2013年4月我科行T-spot-TB与结核杆菌DNA检测的可疑肠结核患者128例进行回顾性分析,其中确诊肠结核72例,非肠结核56例.对比分析两种方法诊断肠结核的灵敏度及特异度.结果 T-spot-TB诊断肠结核灵敏度为90.3％,特异性为91.1％;结核杆菌DNA检测灵敏度为73.6％,特异性为100.0％.T-spot-TB诊断肠结核灵敏度高于DNA检测,但其特异性低于DNA检测;两种方法检测阳性率在不同病理表现的肠结核患者中无显著差异.两种方法同时检测的阳性预测值及阴性预测值均为100％.结论 T-spot-TB与结核杆菌DNA联合检测有助于提高肠结核诊断的灵敏度和特异度.     

结核分枝杆菌Rv0309抗原的重组表达、纯化和鉴定

目的重组表达结核分枝杆菌Rv0309蛋白,以进一步探讨其免疫效应。方法将结核分枝杆菌抗原Rv0309的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Rv0309重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,进一步经GST亲合层析柱纯化,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白。结果获得了pGEX4T-Rv0309重组子,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组Rv0309蛋白,其条带大小约23000,与预期结果相符。结论成功地进行了结核分枝杆菌抗原Rv0309的基因克隆与重组表达,为进一步研制新型结核病疫苗打下了基础。     

石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的 探讨石蜡包埋的10%硝酸脱钙骨组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证.方法 以20例石蜡包埋、10%硝酸脱钙的坏死性肉芽肿炎疑为骨结核的组织标本为研究对象,常规法直接采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit方法提取DNA,而改良法中加入QIAamp DNA Micro Kit试剂盒中的carrier RNA,以两种方法分别提取20例标本中结核杆菌DNA,通过荧光定量PCR,比较常规试剂盒提取法和改良提取法对结核杆菌检测结果的影响.结果 改良法提取的DNA[（35.32±3.48）ng/μl]比常规法[（6.68±3.72）ng/μl]提取的DNA显著增多（P＜0.05）,改良法提取的DNA经荧光定量PCR检测结核杆菌的阳性率（55%）明显高于常规法（15%,P＜0.01）.结论 改良法提取石蜡包埋脱钙骨组织中结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法,值得在puncture和极微小石蜡样本中推广.     

结核分枝杆菌Rv2389c基因的克隆和原核表达

目的:克隆并原核表达结核分枝杆菌Rv2389c基因。方法:培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出485bp的Rv2389c基因,克隆入pSP73载体,测序分析。将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),待大肠杆菌增菌至A600nm值为0.6时,用0.3 mmol/L IPTG在30℃诱导表达重组蛋白。结果:测序结果证实获得了Rv2389c基因,其序列与GenBank中报道完全一致。构建了重组表达质粒,表达的蛋白以12%SDS-PAGE分析,在Mr约42KD处出现一条新生蛋白带,经凝胶薄层扫描检测,表达量约占菌体蛋白的26.8%。结论:成功克隆了结核分枝杆菌Rv2389c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12表达质粒联合免疫的细胞免疫应答观察

目的 观察结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12(hIL-12)联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答.方法 15只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗 hIL-12质粒组(联合免疫组)、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗(BCG)组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次.ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平(分别为1 493.340±8.128pg/ml、747.489±48.676pg/ml)显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强.结论 hIL-12表达质粒能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答.