Let-7a microRNA沉默c-myc基因对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制作用

目的：研究let-7a对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞株的抑制作用,并利用分子生物学实验探索其可能的作用机制。方法：用LipofectamineTM2000介导的let-7a和阴性对照siRNA转染人乳腺癌细胞株MCF-7,半定量RT-PCR检测各组细胞c-myc mRNA表达;Western blot测定转染24h后蛋白的表达水平; CCK-8检测细胞增殖和凋亡。结果: 细胞转染后,let-7a转染组的c-myc mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和阴性siRNA转染组（0.586±0.032 vs 0.934±0.029,0.825±0.004,P<0.01);在MCF-7细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,let-7a在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组; let-7a对细胞增殖具有一定的抑制作用(P<0.05),且该抑制作用具有时间和浓度的依赖性;转染24h后,let-7a组的细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)。结论： LipofectamineTM2000介导的let-7a可以通过抑制c-myc的基因表达,对体外生长的人乳腺癌MCF-7细胞的增殖进行抑制。     

质粒介导靶向c-myc的siRNA对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响

目的观察靶向原癌基因c-myc的siRNA对MCF-7人乳腺癌细胞c-myc/c-Myc表达及细胞增殖的影响。方法以原癌基因c-myc mRNA 589-609位碱基为靶序列构建靶向c-myc的siRNA真核表达质粒p-Mat01-1及其错配质粒p-Mis09-1,空质粒pEGFP-C1为对照,用脂质体Lipo2000包裹转染MCF-7细胞。采用RT-PCR、Western blot检测c-myc mRNA及蛋白表达,MTT法检测MCF-7细胞增殖。结果与pEGFP-C1及p-Mis09-1比较,转染p-Mat01-1能够特异性抑制MCF-7细胞c-myc mRNA(24h:P<0.01)及蛋白(5d:P<0.01)表达,显著降低MCF-7细胞增殖能力(3d:P<0.05,5、7d:P<0.01)。结论采用siRNA表达质粒技术能够有效抑制MCF-7乳腺癌细胞c-myc/c-Myc表达,初步证实下调c-myc/c-Myc表达能够抑制MCF-7细胞增殖,为RNA干扰技术在乳腺癌生物治疗中的应用打下一定实验基础。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67 RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株Ki-67 mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默Ki-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向Ki-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染Ki-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果 Ki-67siRNA载体转染24h后可显著抑制乳腺癌MCF-7/ADR细胞株的Ki-67 mRNA、蛋白表达及增殖活性。Ki-67 siRNA组阿霉素IC₅₀值为（6.3±0.9）μg/ml。结论 Si-Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力。沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

RNAi沉默MACC1基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移

目的探讨RNAi沉默MACC1基因表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖及迁移的影响及相关的分子机制。方法化学合成针对MACC1基因的荧光标记的siRNA-FAM,利用siRNA转染试剂将MACC1特异性siRNA-FAM转染至乳腺癌MCF-7细胞;采用RT-PCR检测siRNA对MACC1 mRNA表达的影响,Western blot检测siRNA对MACC1蛋白合成的影响;MTT实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞增殖活性的影响;Transwell迁移实验检测沉默MACC1基因后对MCF-7细胞迁移能力的影响;Western blot检测干扰MACC1对S100A4及vimentin蛋白合成的影响。结果 MACC1基因在乳腺癌MCF-7细胞高表达;针对MACC1基因的siRNA转染MCF-7细胞48 h后,siRNA组与空白对照组比较,能够显著抑制MACC1基因表达和蛋白合成,抑制效率分别为81%和75%;MACC1特异性siRNA转染MCF-7细胞24、48、72 h后,MMT结果显示与空白对照组比较,siRNA组能够抑制细胞生长,并随着时间延长抑制明显(P<0.05);转染MCF-7细胞48 h后,Transwell迁移实验结果显示siRNA组与空白对照组比较,穿过小室细胞数明显降低,其能有效抑制MCF-7细胞迁移(P<0.05);siRNA组与空白对照组相比,S100A4和vimentin表达降低(P<0.05)。以上实验阴性对照组和空白对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论利用特异性siRNA干扰MACC1基因表达,可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移能力,且这一过程可能与S100A4和Vimentin的表达下调有关。     

siRNA干扰对乳腺癌（MCF-7）ATX表达和侵袭力的影响

目的:研究针对自分泌运动因子(Autotaxin,ATX)的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌细胞ATX基因表达的影响,探讨RNA干扰技术治疗乳腺癌的前景.方法:参考人黑色素瘤ENPP2基因序列,设计合成ATX-siRNA及随机阴性对照.在阳离子脂质体的介导下转染人乳腺癌细胞MCF-7,转染后48 h收集细胞,用半定量RT-PCR和western blot检测转染后ATX mRNA和ATX蛋白的表达,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:体外合成的siRNA在转染乳腺癌细胞48 h后ATX mRNA和蛋白表达降低,转染48 h后测定乳腺癌MCF-7细胞的侵袭力明显降低(P＜0.01).结论:ATX-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞株ATX基因和蛋白的表达,降低人乳腺癌细胞的侵袭力.     

siRNA沉默FAK基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响

目的:研究RNAi干扰粘着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)的表达及对人类乳腺癌细胞生物学特性的影响.方法:构建表达FAK基因siRNA的重组质粒FAK-siRNA,在脂质体的介导下转染入人乳腺癌MCF-7细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,应用RT-PCR和Western blot检测FAK mRNA和蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期分布,体外实验测定肿瘤细胞穿透matrigel的能力.结果:成功转染FAK-siRNA后乳腺癌MCF-7细胞FAK基因的表达与阴性对照组、空白质粒转染组相比FAK mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),细胞增殖指数及侵袭力明显降低(P＜0.01).结论:FAK-siRNA能有效抑制人乳腺癌细胞FAK基因mRNA和蛋白的表达,降低细胞增殖能力及侵袭力.     

c-myc特异性小分子干扰RNA对体外培养HL-60细胞增殖、细胞周期及C-myc蛋白表达的作用

目的:研究针对c-myc基因的小分子干扰RNA(siRNA)对HL-60细胞增殖及内源性c-myc基因表达的影响,探讨应用siRNA进行白血病基凶治疗的可能性.方法:取倍增期HL-60细胞分空白对照组、阴性对照组、转染组3组,培养24～96 h后收获细胞进行检测.采用MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞仪进行细胞周期分析,逆转录PCR方法检测c-myc mRNA表达的变化,免疫细胞化学染色法检测C-myc蛋白表达的改变.结果:分组培养后,转染组细胞增殖较2个对照组受到抑制(P均<0.05),其抑制作用于转染后48、72 h最明显(P均<0.05).转染组S期细胞比值由空白对照组的(56.1±4.7)%降至(29.2±3.5)%,G./G1 期细胞由(36.8±3.3)%升高至(53.6±4.3)%,差异有统计学意义(P均<0.05).c-myc siRNA对目的基因mRNA表达的抑制作用于24 h最明显(P<0.05),96 h抑制作用基本消失(P>0.05).转染组细胞中C-myc蛋白表达与2个对照组相比降低(P均<0.05).结论:针对c-myc基因的siRNA对HL-60细胞增殖及内源性c-myc基因表达有抑制作用,有望为白血病提供新的治疗靶位点.     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

siRNA抑制人乳腺癌KLK6基因表达的实验研究

目的探讨siRNA沉默KLK6基因表达对乳腺癌细胞生长的抑制作用及其机制,为乳腺癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对KLK6 mRNA序列设计合成siRNA,构建2个重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6和PGCsilen-cerTMH1/GFP/Neo/Non;将重组质粒导入乳腺癌MCF-7细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株;实验分为脂质体对照、阴性质粒转染对照及KLK6 siRNA重组质粒转染组,实时荧光定量PCR法检测KLK6 mRNA的表达的变化,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测量细胞生长情况。结果测序证实表达载体构建成功,在稳定转染重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6的乳腺癌MCF-7细胞株中,KLK6 mRNA抑制率(76%)明显高于阴性质粒对照组(2.7%),MCF-7细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组。结论重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6可抑制乳腺癌细胞中KLK6基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的生长。