高糖培养人肾小球系膜细胞对JAK2/STAT1信号蛋白活化的影响

目的:观察高糖对人肾小球系膜细胞(HMCs)Janus酪氨酸激酶2(JAK2)、信号转导和转录活化因子1(STAT1)以及转化生长因子-β1(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将HMCs于高糖(30mmol/L)环境下培养不同时间后,Western blotting检测磷酸化JAK2、STAT1(p-JAK2、p-STAT1)水平;RT-PCR检测TGF-β1和FN mRNA的表达;ELISA测定上清液中TGF-β1和FN的含量,同时以低糖组作为对照。结果:与低糖对照组比较,高糖培养HMCsp-JAK2、p-STAT1蛋白明显上调,TGF-β1和FN mRNA表达和蛋白水平显著增加(P<0.01)。结论:高糖能通过激活HMCs中JAK2/STAT1信号途径,促进TGF-β1和细胞外基质分泌。     

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。     

丹酚酸B对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响

目的:研究丹酚酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化及细胞外基质分泌的影响及其机制。方法:培养人肾小球系膜细胞(HGMCs),随机分为正常对照组、高糖组及高糖+丹酚酸B高、中、低剂量组,高糖组和丹酚酸B各组用含高浓度(33.3 mmol/L)葡萄糖的培养基培养72 h,丹酚酸B各组同时加人相应浓度丹酚酸B共同孵育。Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,ELISA法检测细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的分泌水平,Western blot法检测转化生长因子β1(TGF-β1)的表达及Smad2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化水平。结果:高糖孵育72 h后,肾小球系膜细胞α-SMA的蛋白表达水平明显升高,ColⅠ、ColⅢ、FN及LN蛋白的分泌水平显著增加(P 0.01),TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平也明显升高(P 0.01);与丹酚酸B共同孵育可明显降低α-SMA蛋白的表达水平,ColⅠ、ColⅢ、FN和LN的分泌明显减少,TGF-β1的表达及Smad2、p38 MAPK的磷酸化水平显著下降(P 0.01或P 0.05)。结论:丹酚酸B可明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞表型转化,减少ColⅠ和ColⅢ等细胞外基质分泌,其机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路及p38 MAPK活化有关。     

MG132抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞活化

目的探讨泛素-蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化的影响及机制。方法体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),随机分为对照组、TGF-β1组(10μg/L)和MG132(0.5μmol/L)处理组。Western blot法检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达;RT-PCR和Western blot法分别检测细胞Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βI型受体(TβRI)、Smad2和Smad3 mRNA及蛋白的表达。结果与对照组比较,TGF-β1促进了α-SMA和COL1A1蛋白表达(P0.05),MG132抑制了TGF-β1的上述作用(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN mRNA表达较对照组增加(P0.05)。TGF-β1组Smad7和SnoN蛋白表达较对照组减少(P0.05),而MG132组Smad7和SnoN蛋白水平较TGF-β1组增加(P0.05)。结论 MG132可能通过阻止Smad7和SnoN蛋白泛素化降解,抑制TGF-β1诱导人肺成纤维细胞活化。     

过表达THEM4抑制高糖诱导小鼠系膜细胞细胞外基质分泌

目的观察过表达硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)对高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白分泌的影响。方法体外培养小鼠系膜细胞,分别给予高糖(30 mmol/L)刺激0、6、12、24和48 h后收集细胞。提取RNA,RT-PCR技术检测THEM4 mRNA的表达;提取总蛋白,Western blot法检测THEM4、phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达;ELISA法检测细胞上清液Ⅳ型胶原(collagenⅣ,ColⅣ)、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)的分泌情况。为进一步检测过表达THEM4对高糖诱导的细胞外基质沉积的影响及可能机制,将常规培养的系膜细胞随机分为正常对照组(5.5mmol/L)、高糖组(30 mmol/L)、高糖+p Yr-ads-4-THEM4质粒转染组(高糖+THEM4组)、高糖+p Yr-adshuttle-4空质粒对照组(高糖+V组)。后3组经高糖刺激48 h后终止培养并进行上述检测。结果随着高糖刺激时间的延长,小鼠系膜细胞THEM4表达呈下降趋势,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达增强,伴随细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌增加;过表达THEM4能逆转高糖刺激所导致小鼠系膜细胞Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1的表达,抑制细胞外基质蛋白(包括ColⅣ、FN)的分泌。结论过表达THEM4能降低高糖诱导的小鼠系膜细胞细胞外基质蛋白的分泌,可能是通过抑制Akt蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1表达而实现。     

SnoN和Smad2/3信号蛋白与糖尿病大鼠肾小管-间质纤维化的关系

目的 观察核转录共抑制因子SnoN和Smad2/3信号蛋白在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的动态表达,并初步探讨它们与糖尿病肾病（DN）肾小管-间质纤维化的关系。方法 尾静脉注射链尿佐菌素（STZ）复制DM大鼠模型,随机分为DM2、4、8、12、16和24周组,每组均设鼠龄匹配的正常对照组(n=6)。免疫组化及Western blotting法检测肾组织SnoN、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad2/3、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）的蛋白表达;RT-PCR检测SnoN的mRNA;生化方法测血糖、血肌酐及24h尿蛋白量。结果 DM4周起肾组织中SnoN蛋白表达明显减少(P < 0.01),DM各组SnoN的mRNA表达无变化;TGF-β1、Smad2/3及FN的蛋白表达随DM病程进展逐渐增多;DM12周始肾小管上皮细胞可见α-SMA阳性表达。结论 SnoN蛋白表达减少与TGF-β1/Smad信号通路共同参与了DN的发生发展过程。     

MIF通过调控ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路影响瘢痕成纤维细胞活力和凋亡

目的:探究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是否通过调控细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路及转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads通路影响瘢痕成纤维细胞的活力和凋亡。方法:收集郑州大学附属儿童医院烧伤整形科与河南省胸科医院胸外科手术切除的6例瘢痕疙瘩组织和对应正常皮肤组织,RT-qPCR和Western blot检测组织中MIF的mRNA和蛋白水平。瘢痕疙瘩组织利用组织块培养法提取成纤维细胞,实验分为对照组、空载体组、MIF过表达组、siRNA阴性对照(NC)组和MIF干扰组。除对照组外,其余各组用Lipofectamine~(TM)2000分别转染p-EGFP-N1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIF siRNA(均4μg),置于37℃、CO_2培养箱中转染6 h,更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。继续培养12、24、48、72和96 h,MTT法检测细胞活力;培养48 h,RT-qPCR和Western blot检测细胞中MIF的mRNA和蛋白水平,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白水平。结果:与正常皮肤组织相比,瘢痕疙瘩组织中MIF的mRNA和蛋白水平升高(P0.05)。转染12 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞活力升高(P0.05);处理24、48、72和96 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞活力升高(P0.05),MIF干扰组细胞活力降低(P0.05);随着处理时间的延长,MIF过表达组细胞活力逐渐升高(P0.05),MIF干扰组细胞活力逐渐降低(P0.05)。转染48 h,与对照组、空载体组和阴性对照组相比,MIF过表达组细胞中MIF的mRNA和蛋白水平及Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK蛋白水平升高(P0.05),细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3和Smad7蛋白水平降低(P0.05);MIF干扰组细胞中MIF的mRNA和蛋白水平及Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、pERK和p-p38 MAPK蛋白水平降低(P0.05),细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3和Smad7蛋白水平升高(P0.05)。结论:MIF在瘢痕疙瘩组织中高表达,沉默MIF可抑制病理性瘢痕ERK/MAPK及TGF-β1/Smad2/3通路中相关因子的表达,进而促进细胞凋亡,抑制成纤维细胞过度生长,而过表达后的作用相反。     

SnoN对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞纤维连接蛋白合成的影响

目的: 观察核转录共抑制因子SnoN (Ski-related novel protein N)对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)纤维连接蛋白(FN)合成的影响。方法: 原代培养大鼠RTECs,免疫荧光细胞化学和Western blotting检测培养细胞的上皮性钙黏蛋白、 角蛋白-18和α-平滑肌肌动蛋白表达,鉴定培养细胞;正常糖(5.5 mmol/L)、高糖(25 mmol/L)和相同渗透压的甘露醇分别培养RTECs 30 min、2 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h;SnoN siRNA转染RTECs,分为对照组、高糖组、control siRNA组和SnoN siRNA组;Western blotting和免疫细胞化学检测不同处理组RTECs中SnoN和FN蛋白的表达;RT-PCR检测FN mRNA。结果: 与正常糖培养组相比,高糖刺激能抑制 RTECs中SnoN蛋白表达,且呈时间依赖性;高糖刺激能使RTECs中FN蛋白和mRNA表达增加;与单纯高糖培养组相比,转染SnoN siRNA 能进一步促进高糖诱导的RTECs中FN蛋白表达(P<0.05)。结论: SnoN表达减少参与了高糖诱导的RTECs中FN合成过程。     

ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的： 探讨ERK通路是否参与TGF-β/Smad 通路诱导的血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法: 原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组：(1)对照组;(2)TGF-β1组;(3)ERK阻断剂(PD98059)组;(4)TGF-β1+ ERK阻断剂(PD98059)组。MTT法测细胞的增殖活性,Western blotting法检测VSMCs中细胞内核增殖抗原(PCNA)、Smad2/3、ERK1/2、Smad7蛋白表达及相关磷酸化蛋白含量,RT-PCR方法测VSMCs中Smad2、3、7mRNA的表达。结果: (1)各组PCNA蛋白表达和MTT法测得A值均低于对照组 (P＜0.05),TGF-β1+ ERK阻断剂组与TGF-β1组相比无显著差异。（2）与对照组相比,TGF-β1组p-Smad2/3、p-ERK1/2蛋白含量和Smad7蛋白表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组则明显降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组降低 (P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无显著差异。(3)与对照组相比,TGF-β1组Smad7 mRNA表达增高 (P<0.05),ERK阻断剂组和TGF-β1+ERK阻断剂组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+ERK阻断剂组表达降低(P<0.05)。各组内VSMCs 的Smad2、Smad3 mRNA表达无显著差异。结论: (1)TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但对TGF-β1的抑制平滑肌细胞增殖的作用无影响,可能有其它信号通路参与此过程。(2)ERK通路可通过蛋白和mRNA水平促进Smad7表达,反过来其又可促进ERK通路激活。(3)ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA水平无影响。     

缬沙坦抑制高糖刺激下系膜细胞血管紧张素Ⅱ-Notch通路

目的探讨血管紧张素Ⅱ-Notch通路对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(RMC)基质分泌的影响以及缬沙坦的保护作用。方法将传代培养的RMC同步化后分为正常糖对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(含30.0 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖联合24.5 mmol/L甘露醇)、正常糖联合1μmol/L N-N-(3,5-氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)组、正常糖联合(1、5、10)μmol/L缬沙坦组、高糖联合1μmol/L DAPT组、高糖联合(1、5、10)μmol/L缬沙坦组。培养12、24、48 h后,收集细胞及上清液,Western blot法检测Notch1蛋白表达情况,ELISA检测上清液转化生长因子β(TGF-β)、纤维连接蛋白(FN)的水平。结果与正常糖组相比,高糖刺激RMC 12 h,可检测到Notch1表达升高,峰值出现在24 h;与正常糖组相比,高糖状态下RMC上清液中TGF-β、FN含量随时间明显升高;高糖状态下缬沙坦或DAPT预处理组与未处理组相比,培养24 h左右,Notch1表达明显减少;与未处理组相比,随缬沙坦浓度增加,Notch1表达逐渐降低。高糖状态下,与未处理组相比,缬沙坦或DAPT预处理组TGF-β、FN水平均明显下降。结论高糖可活化培养的RMC中Notch通路,TGF-β以及FN分泌增加;缬沙坦可通过浓度依赖性的方式抑制血管紧张素Ⅱ-Notch通路,减少下游FN的分泌。     

小檗碱对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及TGF-β/Smad通路的影响

目的研究小檗碱(BBr)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化(EMT)及TGF-β/Smad通路的影响。方法常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:1正常对照组;2TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);3小檗碱作用组(30μM小檗碱作用24h后加10ng/ml TGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western Blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P-Smad2、3)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况。结果 TGF-β1处理可导致NRK-52E细胞的α-SMA蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达降低。而小檗碱处理能够减少肾小管上皮细胞α-SMA的高表达,提高E-cadherin蛋白的表达;同时,小檗碱可有效降低由TGF-β1引起的NRK-52E细胞中ROS的过多产生。此外,小檗碱可有效抑制Smad2/3的活化。结论小檗碱可逆转TGF-β1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用机制可能是通过抑制氧化应激及TGF-β/Smad信号通路而发挥作用。     

Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞在体外对肝星状细胞TGF-β1信号传导的影响

目的:探讨Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在体外抑制肝纤维化的机制。方法:分离、纯化大鼠BMSCs并经Smad7基因腺病毒质粒(Ad-Smad7-EGFP)转染建立Smad7-EGFP-BMSCs。实验将大鼠肝星状细胞HSC-T6分为A组、B组、C组和D组,分别与Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7质粒及PBS进行共同培养72 h,采用ELISA测定培养液中Smad7和TGF-β1的表达,采用Western印迹法和RT-PCR法测定细胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA的表达,采用流式细胞术测定细胞凋亡情况。结果:(1)ELISA结果显示,B组、C组和D组培养液TGF-β1蛋白水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1蛋白水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白水平较B组和C组显著升高(P0.01);(2)Western印迹法和PCR结果显示,B组、C组和D组TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA表达水平较A组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较A组显著升高(P0.01);D组TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著降低(P0.01),而Smad7蛋白和mRNA表达水平较B组和C组显著升高(P0.01);(3)流式细胞仪检测结果显示,B组、C组和D组HSC-T6细胞凋亡率较A组显著升高(P0.01),而D组细胞凋亡率较B组和C组显著升高(P0.01)。结论:Smad7基因质粒转染骨髓间充质干细胞可通过作用肝星状细胞TGF-β1信号转导通路以及促进星状细胞凋亡而具有抗肝纤维化的作用。     

Apelin抑制TGF-β诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换

目的探讨多肽Apelin对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肾小管上皮-间充质细胞转换(EMT)的抑制作用及其机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞,分别给予含TGF-β1(2μg/L)和/或不同浓度Apelin-13的培养基孵育细胞48 h,设立6个实验组(每组n=5):对照组、TGF-β组、TGF-β+Apelin(10-8,10-7和10-6mol/L)组和Apelin(10-6mol/L)组。刺激结束后,用免疫荧光染色观察细胞的上皮标志物E-钙黏素(E-cadherin)、间充质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和表达。Western blot检测细胞中E-cadherin、α-SMA及Smads信号通路的主要信号分子p-Smad2/3、Smad2/3和Smad-7的蛋白表达。RT-PCR法检测细胞外基质纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)及细胞自身Apelin和APJ受体的mRNA表达量。结果与对照组相比TGF-β组细胞为长梭形,E-cadherin的表达减少,α-SMA的表达增多,细胞外基质FN和Col-Ⅰ的mRNA表达量也显著升高;TGF-β+Apelin组上述效应被显著抑制,且呈浓度依赖性。与TGF-β组相比,TGF-β+Apelin组细胞活化型Smads的水平降低(P0.05),Smad7的表达增加(P0.05)。TGF-β组细胞自身APJ受体的表达量显著升高(P0.05),TGF-β+Apelin组上述效应受到抑制,且呈浓度依赖性。结论 Apelin干扰TGF-β/Smads信号通路从而抑制肾小管上皮细胞EMT;肾小管上皮细胞自身Apelin/APJ系统可能起到一定的代偿作用。     

茶多酚对高糖所致人肾小球系膜细胞活性氧和TGF-β1表达的影响

目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞活性氧(ROS)和转化生长因子β1，(TGF-β1)表达的影响及茶多酚的干预作用。方法 培养人肾小球系膜细胞，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组和茶多酚干预组，培养0、12、36h后，用分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，用半定量RT-PCR和免疫细胞化学法检测细胞内TGF-β1，mRNA和蛋白表达的变化。结果 高糖导致系膜细胞SOD活性下降和MDA含量升高，上调TGF-β1，mRNA和蛋白表达，随时间延长更为明显；茶多酚干预可拮抗高糖时系膜细胞的上述改变。结论 高糖能促进人肾小球系膜细胞ROS产生增加，上调TGF-β1 mRNA和蛋白表达，茶多酚能抑制高糖对系膜细胞的作用。     

Notch1在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化中的表达和意义

目的:探讨Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化(KTECT)中的动态表达及意义.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)为研究对象,实验分为空白对照组及TGF-β1( 10 ng/mL)诱导组.加入TGF-β1作用后分别于12 h、24h、48 h及72 h在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化;用细胞免疫组化染色法检测α-平滑肌肌动蛋白( α-SMA)、E-钙黏连素(E-cadherin)和Notch1蛋白表达的变化;用RT-PCR法检测α-SMA mRNA、Ecadherin mRNA和Notch1 mRNA表达的变化.结果:与空白对照组相比较,在加入TGF-β1作用后12 h、24h、48 h及72h,TGF-β1诱导组α-SMA蛋白及其mRNA表达明显增加(P＜0 05);Notch1蛋白及其mRNA在TGF-β1作用后的24h、48h、72 h表达逐渐增加(P＜0.05);E-cadherin蛋白及其mRNA表达在24h、48 h、72 h明显减少(P＜0.05);Notch1蛋白及其mRNA的表达与E-cadherin蛋白及其mRNA的表达呈负相关(r蛋白=-0.937;rmRNA=-0.921;假设检验结果(P＜0.05),与α-SMA蛋白及其mRNA的表达呈正相关(r蛋白=0.958;rmRNA=0.944;假设检验结果(P＜0.05).结论:Notch1极有可能参与了TGF-β1诱导的KTECT.     

柴胡皂甙D通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制人胚肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生

目的研究柴胡皂甙D(SSD)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖、转分化以及TGF-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smads)信号通路的影响。方法体外培养HELF,设立正常对照组、 1 ng/mL TGF-β1处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合0.5μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合1μmol/L SSD处理组、 1 ng/mL TGF-β1联合2μmol/L SSD处理组。采用CCK-8法检测HELF的增殖情况,荧光定量PCR法检测Smad2、 Smad3、 Smad7的mRNA水平, Western blot法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 1型胶原蛋白(Col1)、 Smad2、 Smad3、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平。结果与正常对照组比较, TGF-β1处理组细胞增殖明显, Col1、α-SMA蛋白水平增加, Smad2和Smad3 mRNA和蛋白磷酸化水平显著增加, Smad7 mRNA和蛋白水平显著降低;与TGF-β1处理组比较,不同浓度SSD处理组细胞增殖降低,可逆转以上各指标的改变,呈一定的量效关系。结论 SSD通过调控TGF-β1/Smads信号通路,发挥抗肺纤维化的作用。     

高糖预处理影响单核细胞对热灭活金黄色葡萄球菌刺激的反应

目的 观察高糖状态下热灭活金黄色葡萄球菌(HKSA)诱导的人单核细胞株THP-1凋亡特点,以及表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素(IL)-1β mRNA和IL-1β蛋白分泌规律.方法 体外培养THP-1单核细胞,分别以5.5 mmol/L葡萄糖(LG)和25.0 mmol/L葡萄糖(HG)培养12h～8d.将HG和LG培养6d的单核细胞加入HKSA.分别于HKSA加入前和加入后2～48 h提取单核细胞,检测细胞凋亡、IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达.细胞凋亡采用Annexin V与PI双染法,流式细胞技术检测;IL-1β蛋白分泌采用ELISA法检测;提取细胞总RNA,反转录生成cDNA后采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)法,检测iNOS和IL-1β mRNA表达情况.结果 (1)高糖刺激THP-1单核细胞12 ～48 h后IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达较刺激前显著增加(P＜0.05),iNOS和IL-1β mRNA表达在24 h达最高值,IL-1β蛋白分泌48 h达高峰.细胞凋亡在高糖刺激48 h～4 d较刺激前显著增加(P＜0.05).(2)两组细胞加入HKSA后6～48 h表达iNOS和L-1β显著高于刺激前(P＜0.01),24h达高峰,48 h表达下降;IL-1β蛋白分泌在48 h达最高值.两组细胞凋亡率在加入HKSA后12h、24h、48 h逐渐增加(P＜0.01).单核细胞加入HKSA前和加入HKSA后12h,高糖组与低糖组比较,高糖组IL-1β蛋白、iNOS和IL-1β mRNA表达均低于低糖组,凋亡率高于低糖组(P＜0.05).结论 高糖和HKSA对单核细胞分泌IL-1β蛋白、表达iNOS和IL-1β mRNA的影响与刺激时间有关;单核细胞处于持续高糖状态时,高糖可以增加细胞凋亡率,降低IL-1β蛋白分泌、iNOS和IL-1β表达.     

丹皮酚通过抑制miR-21表达减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

目的研究丹皮酚(PAE)通过抑制微小RNA-21(miR-21)减轻博莱霉素(BLM)诱导肺纤维化的相关机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、BLM组、阳性对照(PC)组、PAE组,比较各组大鼠的肺纤维化相关指标,miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平,及Smad7、TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平;将制备好的纤维细胞分为对照组,TGF-β1组,PAE-L组,PAE-M组,PAE-H组,miR-21抑制剂组,检测各组细胞中miR-21、Smad7的mRNA相对表达水平及Smad7、COLIA1、α-SMA蛋白水平,并验证miR-21与Smad7的靶向关系。结果与对照组相比,BLM组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度,miR-21mRNA表达水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白表达水平显著升高均显著升高(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P0.01),与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠的肺系数、羟脯氨酸、肺纤维化程度均显著降低(P0.01);与BLM组相比,PC组和PAE组大鼠肺组织中miR-21 mRNA水平,TGF-β1、COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低,Smad7的mRNA及蛋白水平显著升高(P0.01);与对照组相比,TGF-β1组成纤维细胞中miR-21的mRNA及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著升高(P0.01),Smad7的m RNA及蛋白水平显著降低(P0.01);与TGF-β1组相比,PAE-L组、PAE-M组、PAE-H组、miR-21 inhibitor组成纤维细胞中miR-21的mRNA水平及COLIA1、α-SMA蛋白水平显著降低(P0.01),Smad7的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P0.01);靶基因数据库预测及双荧光素酶报告实验表明,miR-21靶向抑制Smad7。结论 PAE可能通过抑制miR-21表达靶向促进Smad7表达,并抑制TGF-β1表达来减轻BLM诱导的肺纤维化。     

心肌细胞结缔组织生长因子的表达及TGF-β1对其表达的影响

目的： 研究纯化的心肌细胞中结缔组织生长因子（CTGF）基因及蛋白的表达，并探讨转化生长因子β1（TGF-β₁）对其表达的影响。方法: 分离培养乳鼠心肌细胞，48 h后用流式分选方法（FACS）分选纯化心肌细胞，纯化的心肌细胞继续培养48 h。分为对照组（空白纯化心肌细胞组）和TGF-β₁刺激组，用RT-PCR方法测定两组细胞中TGF-β₁、CTGF、纤维连接蛋白（FN） mRNA的含量， 用Western blotting法检测两组细胞胞浆蛋白中CTGF、FN含量。结果: 心肌细胞中有较低水平的CTGF表达，在予以 TGF-β₁刺激后细胞内CTGF mRNA与蛋白含量分别提高 2.49 倍(P<0.01) 和3.63 倍（P<0.01），FN mRNA与蛋白含量分别提高 1倍(P<0.01)和4.18倍（P<0.01），而TGF-β1mRNA水平减少34%（P<0.01）。结论: 纯化的心肌细胞有CTGF的基础表达，并且TGF-β1可以明显上调其表达，提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化过程。     

转染Smad 2基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Smad 2基因,观察转染的阳性细胞克隆纤连蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,以探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导通路引起细胞外基质积聚导致肾小球硬化发生的分子机制.方法经磷酸钙介导将含有Smad 2重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析法鉴定,又分别采用Western印迹分析法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染阳性细胞克隆FN及ColⅣ表达的改变.结果成功建立高表达Smad 2蛋白的阳性MsC克隆(T-12、T-31、T-35、T-40),并证实其FN及ColⅣ的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调.阳性MsC克隆FN蛋白为对照组2.4倍(P<0.05),mRNA为对照组的2.7倍(P<0.05);阳性MsC克隆ColⅣ蛋白为对照组2.9 倍(P<0.01);mRNA为对照组的3.3倍(P<0.01 ). 结论 TGF-β/Smad信号转导途径中的Smad 2可能是促进FN及ColⅣ在肾小球中积聚,是导致肾小球硬化发生的重要信号转导分子.