纳米金基因芯片技术快速鉴定常见浅部致病真菌北大核心CSCD

浅部真菌病是临床常见的感染性疾病,能简便快速鉴定出致病真菌对疾病的治疗至关重要。传统的鉴定方法主要依据真菌的形态、细胞生理和生化特征,这些方法阳性率低,操作复杂费时。一些免疫学和分子生物学技术如PCR,以及以PCR为基础的限制性片段长度多态性PCR（PCR—RFLP）、随机扩增多态性DNAPCR（PCR—RAPD）、单链构象多态性PCR（PCR—SSCP）等也应用于真菌病的诊断,但这些技术也存在操作复杂、实验设备要求高等缺陷。因此,我们尝试建立一种可目视化、快速简便、准确鉴定常见浅部致病真菌的方法。     

常见致病性念珠菌的PCR-RFLP鉴定研究

目的 研究常见致病性念珠菌的分子鉴定方法,为深部念珠菌病的分子诊断奠定基础。方法 对常见9种致病性念珠菌的11株标准株和39株临床株的核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行MspⅠ、HaeⅢ和DdeⅠ三种内切酶的酶切分析。结果 9种念珠菌聚合酶链反应扩增后产生5种不同分子量的条带,扩增产物经MspⅠ、DdeⅠ和HaeⅢ酶切后分别产生8种、5种和4种特异性带型。结论 聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法在鉴定常见的致病性念珠菌中稳定、可靠、特异,是传统方法的有益补充。     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

PCR-RFLP分析鉴定皮肤组织中的分枝杆菌

目的 探讨用PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法快速检测皮肤感染性肉芽肿组织中分枝杆菌。方法 皮肤感染性肉芽肿患者组织标本9份.提取组织DNA,进行PCR扩增,PCR产物分别用BstEⅡ和HaeⅢ2种限制性内切酶进行酶切,3%Nusieve 3:1琼脂糖凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性分析,并与培养结果进行比较。结果 从5份临床诊断为游泳池肉芽肿的组织标本中检测出海分枝杆菌,从另4份诊断为皮肤感染性肉芽肿的标本中检测出2份结核分枝杆菌和2份脓肿分枝杆菌,此9份结果与培养鉴定结果完全一致。结论 用PCR-RFLP方法可以快速鉴定皮肤感染性肉芽肿组织中的分枝杆菌。     

某些真菌的限制性片段长度多态性分析

传统的病原真菌的鉴定主要通过分离株的形态和生理特征进行鉴定。这些方法比较费时,常常需要数天到数周才获得分离培养结果,而且这种依据菌株表型特征获得的结果往往存在不稳定、重复性差和操作繁琐等缺点。本实验将聚合酶链反应(ＰＣＲ)技术应用于病原真菌的鉴定分析,现将结果报道如下。一、材料和方法(一)菌株:实验所用菌株均为标准菌株:白念珠菌ＡＴＣＣ76615、067,白念珠菌Ｂ型Ｃ1,克柔念珠菌Ｒ5,高里念珠菌Ｄ10,热带念珠菌Ｄ9,乳酒念珠菌Ｄ12,光滑念珠菌Ｃ2,新生隐球菌Ｄ48、ＲＶ45981、ＲＶ59939、ＲＶ52642、ＲＶ45977。罗伦特隐球菌…     

上海地区1366例浅部念珠菌病致病菌种分析

目的 分析上海地区1366例浅部念珠菌病的致病菌种构成及分布情况。方法 对1366例儿童与成人浅部念珠菌病的致病菌种进行菌种鉴定：采用科玛嘉平板、API20C AUX等鉴定手段常规鉴定;采用Pal平板、木糖同化试验、45 ℃生长试验鉴定都柏林念珠菌;采用分子鉴定方法鉴定近年发现的新种,包括Candida orthopsilosis、Candida metapsilosis、Candida fermentati、Candida nivariensis、Candida bracarensis。对致病菌种的构成及分布情况进行分析。 结果 1366例浅部念珠菌病的主要致病菌为白念珠菌（占79.0%）,排在2 ~ 4位的依次为近平滑念珠菌（9.5%）、热带念珠菌（2.9%）和季也蒙念珠菌（1.9%）,致病株中包括念珠菌新种Candida orthopsilosis（2株）和Candida metapsilosis（4株）;儿童患者与成人患者的致病菌种构成差异有统计学意义（?字２ = 196.46,P < 0.01）,其中非白念珠菌分离率分别为14.4%和45.8%。结论 白念珠菌仍为浅部念珠菌病的主要致病菌;新种Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis可引起浅部念珠菌病。与儿童病例相比,成人病例中非白念珠菌的分离比例明显上升。     

PCR-RFLP方法检测淋球菌及opa基因分型研究

目的研究聚合酶链反应-限制性长度多态性分析技术进行淋球菌opa基因分型及广西地区淋球菌opa基因分型情况。方法采用质粒PCR对80株淋球菌临床分离株进行检测,后用RFLP方法对其扩增产物进行opa基因分型。结果80株淋球菌经PCR测定后,有效进行分型的有70株淋球菌,这些菌株经opa基因分型后共产生63个独立opa基因型别,其中58个opa基因型各由单一株菌组成,另外5个opa基因型由2株或2株以上的菌株组成。结论聚合酶链反应-限制性长度多态性分析技术可对淋球菌进行检测和opa基因分型。opa基因分型方法是分子流行病学研究的重要工具。     

临床常见毛孢子菌的鉴定

为了探讨临床常见毛孢子菌（Trichosporon spp.)的鉴定方法，在形态学、营养生理学试验的基础上对临床常见的毛孢子菌－皮瘤毛孢子菌（Trichosporon inkin)、皮毛孢子菌（Trichosporon cutaneum)及阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii)进行核糖体核糖核酸（rRNA)基因（rDNA)的内转录间区（ITS）扩增，用限制性内切酶Cfr3I、NcoI对聚合酶链反应（PCR）产物进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析及序列测定，发现用Cfr13I做酶切，皮毛孢子菌的RFLP带型和阿萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不同；用NcoI做酶切，皮瘤毛孢子菌的带型与另两者不一致，序列分析的结果与形态学、营养生理学试验一致。结果提示，温度试验、API 20C、RFLP及序列测定可用于鉴定临床常见的毛孢子菌。     

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因限制性片段长度多态性分析,比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌(CA-1,CA-2,CA-4,CA-6,CA-7,CA-9,CA-11,CA-13~CA-17)菌丝相与酵母相基因组DNA,根据ERG11基因序列设计一对引物,对其进行PCR扩增(包括部分上游和下游非编码区),扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1 734bp大小的目的片段,CA-7,CA-14,CA-16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异,其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看,白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。     

HCR基因单核苷酸多态性与维吾尔族银屑病的相关性

目的 探讨HCR基因与银屑病发病的相关性.方法 测定118例新疆维吾尔族寻常性银屑病及127例正常人对照组的HCR基因第4外显子第307位点基因多态性.从抗凝血中抽提DNA,用PCR-RFLP法和PCR产物直接测序法鉴定基因型.对结果进行统计学分析处理.结果 HCR-307位点核苷酸存在C、T二态性,表现为CC纯合、TF纯合、CT杂合三种基因型,病例组TF基因型频率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01).结论 HCR-307位点的C→T多态性与新疆维吾尔族寻常性银屑病具有相关性.     

rDNA-RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种间鉴定初探

目的 探讨rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术构建毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析,尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定。方法 收集8种14株毛孢子菌,对其进行rDNA-ITS/IGS1扩增测序,并分别应用HaeⅢ、HhaⅠ、HaeⅢ和HhaⅠ双酶、HinfⅠ、MspⅠ和TaqⅠ对扩增片段进行RFLP酶切。结果 rDNA-ITS-RFLP多酶切可将8种毛孢子菌分为不同进化分支的4个亚类,而rDNA-IGS1-RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定,并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分。结论 rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术有望用于毛孢子菌属种水平的快速鉴定。     

中国南方部分城市泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型研究

目的 了解中国南方4个城市性病高危人群中沙眼衣原体(Ct)基因型的分布特征。方法 从衡阳、上海、广州、江门四个城市的性病门诊收集1180份泌尿生殖道标本,经质粒PCR筛选后,阳性者用巢式PCR扩增Ctomp1基因片段,酶切omp1扩增产物,分析Ct各临床株omp1基因的限制性片段长度多态性(RFLP),将临床株分型。结果 Ct质粒PCR阳性者301份,用于分型者286份。通过RFLP分型,共检出10个基因型,其中常见的是E(30.8%)、J(23.8%)、D(17.5%)、F(10.5%)、G(6.2%)型,并且不同城市间基因型的分布差异无统计学意义(χ²=0.981,P>0.05)。结论 4个城市存在Ct多种基因型,并且基因型的分布大致相同。     

菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究

目的 探讨菌落PCR在检测病原性丝状真菌方面的应用价值。方法 初步建立用于丝状真菌的菌落PCR检测技术,用19种丝状真菌标准株进行验证,所有菌落PCR扩增产物进行测序,并选取8种菌株的菌落PCR产物和酶切结果与常规PCR进行比较,检测其准确性和可靠性。结果 19株菌中有16株（84.2%）菌落PCR成功扩增内转录间隔（ITS）区,ITS区基因序列分析鉴定菌种正确,与NCBI数据库中相同菌种的相似度为96% ~ 100%;与常规PCR进行比较的8株菌中,除构巢曲霉菌落PCR扩增结果为阴性外,其他菌种菌落PCR产物及酶切条带与常规PCR基本一致。结论 与常规PCR相比,菌落PCR检测丝状真菌操作简单,省时省力,鉴定菌种具有较高的准确性和可靠性,可以用于丝状真菌的快速鉴定。     

雌激素受体基因多态性与江西籍汉族女性SLE相关性研究

目的 探讨雌激素受体α（ERα）基因多态性与江西籍汉族女性SLE患者是否存在相关性。方法 95例江西籍汉族女性SLE患者（18例月经初潮前起病和77例月经初潮后起病）及100例江西籍健康女性,通过PCR－限制性片段长度多态性技术,对其全血ERα PvuⅡ和XbaⅠ位点进行分型,并分析SLE患者月经初潮前与初潮后起病组等位基因及基因型频率分布差异。结果 P等位基因频率SLE组（35.8%）高于对照组（27%）,两组差异有统计学意义（P < 0.05）;月经初潮前起病组（19.4%）低于初潮后（39.6%）起病组（P < 0.05）。月经初潮前起病组Xxpp基因频率（16.7%）明显高于正常对照组（1%）和初潮后起病组（1.3%）。结论 江西籍汉族女性SLE患者ERα基因的P基因频率表达增高,Xxpp基因型SLE女性患者更易出现初潮前起病的特征。     

银屑病患者甘露糖结合凝集素基因多态性及血清水平的研究

【摘要】 目的 探讨银屑病患者甘露糖结合凝集素（MBL）基因多态性及血清水平与疾病的关系。 方法 寻常性银屑病患者67例,健康对照组69例。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测MBL基因第54号密码子基因多态性,ELISA法测定血清MBL浓度。 结果 67例银屑病患者GGC/GAC基因型频率高于健康对照组,GGC/GGC基因型频率低于健康对照组,两组比较,差异有统计学意义（χ2 = 10.36,P ＜ 0.05）;银屑病组GAC等位基因频率增高,GGC等位基因频率降低,两组差异有统计学意义（χ2 = 8.31,P ＜ 0.05）。GAC型等位基因与银屑病显著相关（OR = 3.383,95％置信区间1.585 ~ 7.211,P ＜ 0.05）。银屑病组与健康对照组血清MBL浓度分别为（2.1937 ± 0.8163） mg/L和（3.2695 ± 1.2058） mg/L,银屑病组显著低于健康对照组（t = 6.11,P ＜ 0.05）。 结论 MBL与银屑病的发病可能存在一定关系。     

雄激素受体基因第一外显子CAG重复序列长度多态性与痤疮的相关性

目的 探讨人雄激素受体基因第一外显子CAG重复序列长度多态性与痤疮发生之间的关系。方法 研究对象为中国东北地区238例痤疮患者和207例健康对照，抽取外周血后分离纯化出基因组DNA，采用微卫星扫描（STRs）方法分析CAG重复序列的多态性。结果 男性病例组和对照组的CAG重复均数分别为22.70 ± 3.09和23.48 ± 2.83，两组之间差异有统计学意义（P = 0.046）；将对照组中CAG重复次数的中位数23作为分割点分组比较，长/短CAG片段在男性病例和对照中的分布差异有统计学意义，携带有CAG短片段的男性较携带CAG长片段的男性患痤疮的风险性明显增加（OR值2.07；95%可信限为1.21 ～ 3.54）。女性病例组和对照组的CAG重复均数分别为23.41 ± 2.87和23.85 ± 0.21，两组之间差异无统计学意义（P = 0.115）；按中位数分组比较长/短CAG片段在女性病例和对照中的分布差异有统计学意义，携带有CAG短片段的女性患痤疮的风险性明显增加（P = 0.013，OR值2.05；95%可信限为1.18 ～ 3.56）。结论 雄激素受体基因第一外显子CAG的重复次数与中国东北地区痤疮的发生有关，CAG重复次数少的男性个体患痤疮的风险性增加，雄激素受体基因第一外显子CAG的重复次数可作为痤疮的遗传易感标志之一。     

E选择素基因多态性与广西壮族系统性红斑狼疮的相关性研究

目的 探讨E选择素基因第2外显子G98T和第4外显子A561C多态性在广西壮族人群中的分布及其与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性。方法 用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测82例系统性红斑狼疮患者和95例正常对照者E选择素基因型。结果 E选择素第2外显子基因型GG、GT、TT频率在SLE组和对照组分别为86.6%、12.2%、1.2%和90.5%、8.4%、1.1%;E选择素第4外显子基因型AA、AC、CC频率在SLE组和对照组分别为81.7%、15.9%、2.4%和92.6%、7.4%、0.0%。E选择素第4外显子基因型频率和等位基因频率在SLE组和对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。基因型频率的相对风险分析发现,AC+CC基因型患SLE的风险是AA基因型2.81倍(OR=2.81,95%CI为1.087～7.290)。结论 E选择素A561C基因多态性与广西壮族人群SLE的发病有相关性,C等位基因可能是SLE的易感基因。