一种从脑脊髓液中提取病毒RNA和DNA的新方法

一种从脑脊髓液中提取病毒ＲＮＡ和ＤＮＡ的新方法陈宗波董永绥方峰李苹从真核细胞中提取总ＲＮＡ和ＤＮＡ的方法很多［１］，均需从大量细胞和大量临床样本中分离、纯化核酸。从标本中提取靶ＤＮＡ或ＲＮＡ的多少是聚合酶链反应（ＰＣＲ）和逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）...     

一步反转录PCR法从组织及细胞中扩增HEK5

聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术诞生后不久即用于ＲＮＡ的扩增［１］。这种方法需要首先将ＲＮＡ逆转录（ＲＴ）为ｃＤＮＡ链后再进行常规ＰＣＲ扩增，程序较繁琐，且需逆转录酶及ＲＮＡ酶抑制剂等成本较高试剂。有研究表明Ｔａｑ聚合酶及ＴｔｈＤＮＡ聚合酶有逆转录功能，且...     

定量逆转录PCR测定健康人外周血细胞甲状腺球蛋白mRNA

新近研究发现定量逆转录ＰＣＲ(ＲＴ ＰＣＲ)测定甲状腺球蛋白 (Ｔｇ)ｍＲＮＡ有助于监测转移性甲状腺癌患者的疗效。而此种ＲＴ ＰＣＲ通常需要繁琐的、高度敏感的抽提技术 ,作者介绍了一种从全血中提取ＲＮＡ的简化方法 ,并检测了ＴｇｍＲＮＡ采用标准ＥＤＴＡ采血管收集健康人全血 17份 ,用ＰＵＲＥ手工药盒提取ＲＮＡ ,15份用ＴＲＩＺＯＬＬＳ提取ＲＮＡ。以随机六聚引物将 1μｇＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ。反应条件如下 :1×ＴａｑＭａｎ缓冲液 ,5 5ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ2 ,5 0 0 μｍｏｌ/ＬｄＮＴＰ ,2 .5 μｍｏｌ/Ｌ引物 ,40 0ｋＵ/…     

MRP基因定量RT-PCR内标准DNA模板和RNA模板的构建

目的：构建定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）的内标准ＤＮＡ模板和ＲＮＡ模板，定量检测多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）基因表达的ｍＲＮＡ。方法和结果：利用现有的ＭＲＰ全基因质粒和分子克隆技术经２次克隆将庚型肝炎病毒的一段２３８ｂｐ的核苷酸序列插入ＭＲＰ２９２ｂｐ的目的ｃＤＮＡ片段，构建了插入突变型ＭＲＰｃＤＮＡ重组体作为定量ＰＣＲ的ＤＮＡ竞争模板；再经第３次克隆构建了插入突变型ＭＲＰＲＮＡ重组体，最后经体外转录出５３０ｎｔ的正链ＲＮＡ作为逆转录的ＲＮＡ竞争模板。结论：所建立的ＲＴＰＣＲ技术简便、快速、灵敏，可检出１ｆｇ水平的ｍＲＮＡ量。用ＤＮＡ竞争模板定量检测比用ＲＮＡ竞争模板更简便、经济、可靠。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

聚合酶链反应直接测序法检测细胞色素b5还原酶基因突变

在ＤＮＡ突变检测方法中，ＤＮＡ测序能精确判断突变部位和性质，是最具决定性的一步。聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物经直接测序分析而不预先克隆到测序载体上，使序列分析的效率极大提高。我们从遗传性高铁血红蛋白血症患者外周血白细胞提取总ＲＮＡ，经逆转录（ＲＴ）合成...     

快速提取肠道病毒RNA用于逆转录聚合酶链反应

分别以改进的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿抽提法和异硫氰酸胍－酚－氯仿一步抽提法提取肠道病毒ＲＮＡ用于逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），经８次反复试验，证明两种方法提取的肠道病毒ＲＮＡ均能用于ＲＴ－ＰＣＲ反应，但异硫氰酸胍－酚－氯仿法更稳定、可靠、简单快速，能满足流行病学研究中同时处理大量标本的需要。     

逆转录－套式PCR检测血清中丙肝病毒RNA

利用与丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组５＇非编码区保守序列同源的套式引物，建立了检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，由于在引物设计中选择了最保守的区域且避开了与黄病毒属的同源序列，保证了ＰＣＲ检测的灵敏度和特异性。经逆转录和两轮ＰＣＲ扩增，可检出１×１０－３ｕｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。研究了影响ＨＣＶＲＮＡＰＣＲ检测的各种因素，并对ＲＮＡ分离及ＲＴ－ＰＣＲ反应体系进行了优化，在此基础上研制了ＨＣＶ的ＰＣＲ检测试剂盒。     

快速提取肠道病毒RNA用于逆转录聚合酶链反应

分别以改进的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿抽提法和异硫氰酸胍－酚－氯仿－步抽提法提取肠道病毒ＲＮＡ用于逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），经８次反复试验，证明两种方法提取的肠道病毒ＲＮＡ均能用于ＲＴ－ＰＣＲ反应，但异硫氰酸胍－酚－氯仿法更稳定、可靠、简单快速，能满足流行病学研究中同时处理大量标本的需要。     

一步短片段RT—PCR方法检测HCV RNA

目的：为了简化传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤。方法：利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶具有一定的反转录酶活性的特点，对ＨＣＶ ＲＮＡ短序列进行反转当，并对合成的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。结果：本法简化了传统ＲＴ－ＰＣＲ操作步骤，提高了结果的稳定性。结论：本法可用于ＨＣＶ ＲＮＡ以及其它ＲＮＡ的临床诊断。     

一种新的NADH-细胞色素b5还原酶基因点突变

目的　为了查明中国人遗传性高铁血红蛋白血症（ＲＣＭ） 患者的ＮＡＤＨ细胞色素ｂ５ 还原酶（ｂ５Ｒ） 基因突变类型,探讨ＲＣＭ 发生的分子机制。方法　从已报道的１ 例ＲＣＭⅠ型患者的外周血白细胞中提取ＲＮＡ,应用逆转录聚合酶链反应法（ＲＴＰＣＲ） 扩增了ｂ５ＲｃＤＮＡ（９２１ ｂｐ）,测定其ｂ５ＲｃＤＮＡ的全部编码序列。结果　ｂ５ＲｃＤＮＡ基因的第２０３ 位密码子存在（ＴＧＣ→ＴＡＣ）Ｃｙｓ→Ｔｙｒ 的错义突变。经基因组ＰＣＲ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 分析证实该突变并非ＰＣＲ过程中的错配。结论　Ｃｙｓ２０３ →Ｔｙｒ 是ＲＣＭ 的一种新的基因突变类型     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测外周血Wilm‘s瘤基因的表达

Ｗｉｌｍ′ｓ瘤基因 (ＷＴ1)位于人类染色体 11Ｐ13,与Ｗｉｌｍ′ｓ瘤的发生密切相关。近年发现ＷＴ1在白血病细胞中高度表达[1] ,可作为检测微小残留病 (ＭＲＤ)的指标。为此我们采用荧光定量逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)技术 ,检测了不同类型白血病患者外周血ＷＴ1的表达水平 ,现报道如下。一、材料和方法1 标本 :6 9例白血病患者均符合ＦＡＢ诊断标准 ,年龄2 2～ 70岁。对照组为 18例非白血病患者和健康志愿者 14名 ,年龄 2 1～ 2 4岁。2 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成 :2ｍｌＥＤＴＡ抗凝血 ,提取外周血总ＲＮＡ ,2 6 0～ 2 80ｎ…     

RT-PCR一步法检测鼠莱姆关节炎组织标本中的伯氏疏螺旋体

伯氏疏螺旋体 (Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ,ＢＢ)的感染与莱姆关节炎的发生密切相关。目前螺旋体在急性莱姆关节炎中的致病作用已得到证实 ,但在慢性病程中缺乏相关证据。由于感染组织中仅存在少量ＢＢ ,这就要求一种灵敏度高的方法对其进行检测。作者建立了逆转录———巢式ＰＣＲ聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)一步法检测鼠莱姆关节炎滑膜及心脏组织标本中微量的ＢＢ ,并与常规ＲＴ ＰＣＲ两步法比较。作者首先取慢性莱姆关节炎Ｃ3 ｈ模型鼠的胫骨关节的滑膜及心脏组织标本 ,提取ＤＮＡ和ＲＮＡ ,进行ＰＣＲ及ＲＴ ＰＣＲ扩增…     

特异核酸捕获RT-PCR技术建立及在HCV RNA检测中的应用

目的 解决ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法的重复性较差问题,使其成为常规实验室检测方法。方法 采用亲合素生物素系统将ＨＣＶ特异的核酸片段包被在微孔板上,利用特异核酸捕获样本中的ＨＣＶＲＮＡ然后进行逆转录和ＰＣＲ扩增,从而建立了特异核酸捕获ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法,并与酶消化法和抽提法进行比较,评价其敏感性、特异性、重复怀及抗污染能力。结果 特异性核酸获ＲＴ－ＰＣＲ获得的电要带较为清晰,其特     

PCR室间质量控制研究状况

ＰＣＲ技术现已得到一定程度的普及，许多单位将其作为一种常规应用于多种病原微生物的临床检测和诊断。国外学者近年来相继报道对全球范围内许多研究室建立的乙肝病毒ＤＮＡ，丙肝病毒ＲＮＡ和结核杆菌ＤＮＡ的ＰＣＲ检测方法进行的室间质量控制研究，结果表明不同研究室所建立的ＰＣＲ的敏感性和特异性，差别较大，本文对此简要综述。     

TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５’端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％。凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录。套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率达９３．３％（１４／１５）。ＴｔｈＤＮＡ聚合酶用于ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ５’端非编码序列片段具有敏感性高、特异性强、稳定性好的优点。     

慢性粒细胞白血病断裂点簇集区－abl融合基因的检测

应用改良的一步法ＲＮＡ提取方法分离慢性粒细胞白血病（慢粒）患者外周血或骨髓标本总ＲＮＡ，以慢粒急性红白血病变细胞株为阳性对照，急件早幼粒细胞性白血病细胞株为阴性对照，建立逆转录／套式聚合酶链反应（ＲＴ，套式ＰＣＲ）检测断裂点簇集区一ａｂｌ融合基因。第一次ＰＣＲ的灵敏度为１：１０￣４水平，第二次ＰＣＲ后灵敏度提高至１：１０￣５水平。特异性扩增产物经用地高辛素标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交得到证实。     

荧光定量PCR与RT-PCR技术检测HCV-RNA的比较观察

目的 比较荧光定量ＰＣＲ与ＲＴ－ＰＣＲ（定性）检测不同检材中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值。方法 采用荧光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ（定性）技术同时检测了７１例血液透析患者的血清,血浆,淋巴细胞、尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果 血清、淋巴细胞,尿液标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４６．３８％,８０．００％）,分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－Ｐ     

慢性粒细胞白血病断裂点簇集区—abl融合基因的检测

应用改良的一步法ＲＮＡ提取方法分离慢性粒细胞白血病（慢粒）患者外周血或骨髓标本总ＲＮＡ，以慢粒急性红白血病变细胞株为阳性对照，急性早幼粒细胞性白血病细胞株为阴性对照，建立逆转录／套式聚酶链反应（ＲＴ／套式ＰＣＲ）检测断裂点簇集区－ａｂｌ融合基因，第一次ＰＣＲ的灵敏度为１：１０＾４水平，第二次ＰＣＲ后灵敏度提高至１：１０＾５，特异性扩增产物经用地高辛素记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交得到证实。     

不同血清学标志血清中HBV DNA和HCV RNA的分析研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测４８１例乙肝血清学五项指标至少一项阳性血清中ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ，结果显示ＨＢＶＤＮＡ的检出率为９１．５％，ＨＣＶＲＮＡ的检出率为１５．４％，并提示（１）当乙肝患者血清中抗ＨＢｅ阳性甚至抗ＨＢｓ阳性时，仍有相当部分的ＨＢＶ存在且仍在复制；（２）ＨＢＶ和ＨＣＶ感染可相互增加其易感性；ＨＢｓＡｇ阳性与否与抗ＨＣＶ可能有一定关系；（３）ＰＣＲ检测ＨＢＶＤＮＡ、ＨＣＶＲＮＡ具有较高的敏感性。