荧光定量PCR法在结核杆菌检测中的价值

目的探讨荧光定量PCR法检测技术在结核病诊断中的价值。方法采用荧光定量PCR法和抗酸染色法同时检测231例结核患者体液标本(121例痰标本、67例胸腹水及43例尿液标本),对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR法的检测灵敏度为102Copy/ml,是抗酸染色法方法检测灵敏度100倍,且对除结核杆菌外的其他呼吸道病原体检测结果均为阴性。本研究痰标本、胸腹水标本及尿液标本的荧光定量PCR法阳性率均要高于抗酸染色法阳性率,比较差异均有显著性(﹤0.01)。结论荧光定量PCR方法检测结核杆菌具有特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点,明显优于抗酸染色法,可作为结核病诊断的常规方法。     

LightCycler FQ-PCR检测HBV-DNA时CT值基线调节

随着分子生物学技术的飞速发展，应用聚合酶链反应(PCR)技术对日益增多的传染性疾病评估极具价值，由当初的定性检测发展到现在的定量检测。Roche公司LightCycler全自动荧光定量PCR仪以其扩增循环速度快，独立封闭的毛细管反应体系大大减少了标本间和产物的污染，单一光路的三个检测点对样本同时进行三个波长的荧光检测，扩增与检测同时进行并提供实时分析和在线监控。其定量依据是采用内对照法和外标法对产物进行定量分析．下面就我们的体会介绍如下。     

实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

不同双歧杆菌标准品制备法的比较研究

目的 比较不同的双歧杆菌标准品制备法,筛选适用于实时荧光定量PCR检测的双歧杆菌标准品。方法 以双歧杆菌标准菌株作为实验菌株,分别采用菌株DNA法、PCR产物扩增纯化法、质粒DNA法制备梯度浓度标准品,运用紫外分光光度计和实时荧光定量PCR 技术进行检测,并对数据进行统计学处理。结果 实时荧光定量PCR检测发现,3种不同的双歧杆菌标准品制备法的标准曲线均 r 2 ＞0.990;不同制备法的双歧杆菌标准品DNA浓度和纯度检测比较,质粒DNA制备法所制的双歧杆菌标准品浓度和纯度较另外两种方法高,差异有统计学意义（ P<0.01）。结论 双歧杆菌质粒DNA制备法制备的标准品质量较高,适用于实时荧光定量PCR检测,可以为双歧杆菌分子生物学检测提供参考依据。     

荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用分析

目的探讨荧光定量PCR在结核菌快速检测中的应用效果。方法选取安阳市结核病防治所2014年6月至2014年12月就诊的100例呼吸系统疾病患者(临床阳性痰分离株100份),应用荧光定量PCR技术检测。结果荧光定量PCR检测准确率为97%,菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论结核菌快速培养法如荧光定量PCR技术经济、简单,结果可靠,特异度和敏感性均居较高水平,鉴别诊断能力较强,实验室可据自体条件对不同的检测方法进行选择。     

粪便基因组DNA提取方法比较及在沙门菌定量PCR检测中的应用

目的 建立并优化1种可用于临床微生物检测的粪便微生物基因组DNA提取方法并应用于沙门菌定量PCR快速检测.方法 分别利用土壤微生物基因组DNA提取试剂盒法、微生物基因组DNA提取试剂盒法和本实验室改进酚/氯仿抽提法提取腹泻患者粪便基因组DNA,根据沙门氏菌16srDNA、 dT等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,进行多基因定量PCR检测.结果 3种方法提取的基因组DNA均可进行有效的定量PCR扩增,采用所建立的多重PCR方法可特异鉴别粪便沙门氏菌.结论本研究改进的粪便基因组DNA提取方法及临床微生物的定量PCR检测可在较短的时间内实现对大量临床样品快速诊断,有一定应用前景.     

乙肝患者158例血清HBV DNA含量变化对比分析

目的：比较实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法定量检测血清HBV DNA的准确性。方法：本研究参比血清来自国家药品生物制品鉴定所与国家临检中心,临床血清标本共158例。比较了两种方法的线性范围、准确度、重复性、实验时间及成本。结果：实时PCR的批内差和批间差分别为0.3%～3.8%和1.4%～8.1%。实时荧光PCR法与COBAS Amplicor法具有良好的相关性（r=0.948）,实时荧光PCR法成本低且检测范围更宽。结论：实时PCR是监测慢性乙肝患者HBV DNA水平的有效方法。     

荧光定量PCR技术在淋病预后诊断中的作用

目的 探讨荧光定量PCR技术在性病预后诊断中的应用。方法 用荧光定量PCR法追踪检测25例性病门诊患者淋球菌(NG)。结果 荧光定量PCR法能够检测淋病的治疗效果。结论 荧光定量PCR技术具有高灵敏性、高特异性、高精确性、效率高和污染小等特点，是一种有效、快速和简便的检测方法，具有广泛应用价值。     

荧光定量PCR与免疫荧光法定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒

目的采用TaqMan荧光探针定量PCR技术与免疫荧光技术定量定性检测牛血清中呼肠孤病毒。方法以携带有Reovirus保守系列的重组质粒作为标准品,优化定量PCR体系,建立标准曲线,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性;用FITC标记的抗Reovirus病毒蛋白单克隆抗体对感染不同滴度Reovirus的Vero细胞培养物进行直接免疫荧光检测,用Vero细胞培养不同病毒评价方法的特异性。结果 Taq Man Real-time PCR方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/l,线性范围为109～103;免疫荧光法对Reovirus检测具有很高的特异性。结论以TaqMan荧光探针检测Reovirus荧光定量PCR方法,灵敏度高、特异性强,辅以免疫荧光定性检测方法,可以作为牛血清感染Reovirus的定量和定性检测。     

辣椒中常见产毒性真菌的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR检测方法

目的将多重实时荧光定量PCR技术与裸磁珠富集技术联用,建立辣椒样品中常见3类（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产毒
性真菌的快速定量检测方法。方法根据真菌核糖体RNA（rDNA）基因序列选择真菌广谱引物及属特异性探针,联用裸磁珠富
集技术,建立多重实时荧光定量PCR体系,并评价所建方法的灵敏度、特异性、重复性和一致性。结果裸磁珠-多重实时荧光定
量PCR方法灵敏度高,与本研究优化后的普通实时荧光定量PCR相比提高了10倍,是原报道的100倍,直接检测辣椒样品中3
类产毒性真菌的检出限均可达103 CFU/ml,即104 CFU/g,且特异性良好（与非目标菌无交叉反应）、重复性良好（CV<1.5%）,该
方法模拟检测辣椒样品中3 类产毒性真菌的计数结果与标准培养法的计数结果相比均无统计学差异（P>0.05）,实验过程仅
需7 h（标准培养鉴定法耗时7~14 d）。结论构建的裸磁珠-多重实时荧光定量PCR方法能大大缩短产毒性真菌的检测时间,并
成功应用于模拟辣椒样品中常见3类产毒性真菌的定量检测,值得进一步研究和推广。
     

手足口病常见病原体的核酸检测技术研究进展

手足口病（HFMD）是由肠道病毒引起的一种临床常见急性传染病,EV71和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）是引起该病的主要病原体,快速准确地检测这两种病原体对于手足口病治疗和控制有着至关重要的作用.笔者综述这两种病原体实验室检测技术的研究进展,主要是分子生物学方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR、内标多重荧光RT-PCR、基因芯片技术、环介导等温扩增、纳米金粒子免疫PCR等.     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

广东地区SARS标本检测方法的对比研究

目的比较和评价严重急性呼吸综合征的检测方法。方法采用巢式RT-PCR和实时荧光定量PCR检测病人咽痰标本，采用ELISA方法检测血清IgG抗体，同时采用细胞培养技术对咽痰标本进行病毒分离，并对检测结果进行统计学分析。结果两种RT-PCR检测结果完全一致；巢式RT-PCR与荧光定量PCR检测比较，两种检测方法之间的吻合度较强，检测结果基本一致；比较PCR方法和ELISA方法检测病毒基因和IgG抗体，结果发现PCR方法与ELISA方法之间的吻合度很弱，两种方法对于临床诊断具有互补性；采用细胞培养(Vero-E6细胞株)方法，分离了13株SARS-CoV毒株。结论采用巢式RT-PCR和实时荧光定量PCR、ELISA IgG抗体检测和细胞培养技术对于SARS临床诊断、研究、预防和控制具有重要意义，目前的诊断技术已稳定可靠；但确诊周期过长，同时须防止标本污染和实验室污染。     

传代培养对供核细胞胰岛素样生长因子Ⅱ基因表达的影响

目的通过建立一种简便可靠的胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF2）基因实时荧光定量PCR检测方法来探讨传代培养对供核细胞中IGF2基因表达的影响。方法通过实时荧光PCR，选择合适的“相对标准品”绘制相对标准曲线，检测来源于鼠耳的成纤维样细胞IGF2的表达。结果通过实时PCR的相对定量检测出在鼠耳成纤维样细胞的传代培养中，随着培养代数的增加，IGF2的表达减弱。结论双标准曲线的实时荧光PCR相对定量法用于检测IGF2的表达是可行的；培养代数影响IGF2基因的表达，为体细胞克隆研究中供核细胞的选择及后续的基因印迹研究奠定基础。     

增强型荧光实时PCR——高灵敏度SARS冠状病毒检测方法

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory sydrome,SARS)是由SARS冠状病毒(SARS-coronavirus,SARS-CoV)引起的传染性强、病死率高的疾病[1-4].其传播的主要途径是通过近距离呼吸道飞沫传播.     

实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立

目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的建立Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法。方法以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR）,并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定。结果构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性达10^-7水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批间变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%。结论建立的SYBR GreenⅠ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好。     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的 构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法 以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板,利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆入T载体;用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变;采用PCR和测序进行鉴定。结果 以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板,采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYQA、LYPA和LYPB重组质粒;以单倍型HYPA及LYQA重组质粒为模板,采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYQC标准质粒。结论 构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒,为采用SSP-PCR、Real-timePCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。