人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

人源Fab抗体库的构建和抗hPRLR抗体的筛选鉴定

目的构建人源Fab噬菌体抗体库,筛选抗hPRLR抗体片段并进行初步鉴定。方法从乳腺癌患者外周血提取总RNA,通过RT-PCR扩增人抗体轻链和重链基因,构建抗hPRLR人源Fab抗体库。分别以His-hPRLR融合蛋白、BSA-hPRLR表位多肽融合蛋白和GST-hPRLR融合蛋白作为抗原包板,经过3轮循环的吸附-洗脱-扩增的筛选及1轮交叉筛选,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,将筛选到的阳性克隆FabG2转化至Top10’受体菌,诱导表达可溶性Fab抗体,通过Western blot和ELISA进行特异性的鉴定。结果构建的人源Fab库容为1.0×109,4轮的筛选,获得6株能与hPRLR结合的人源抗体克隆。选取的FabG2能够进行可溶性Fab抗体蛋白的表达,ELISA初步鉴定,能够与hPRLR进行特异性地结合。结论成功构建了人源Fab噬菌体抗体库,筛选并鉴定了1株抗hPRLR Fab抗体的克隆。hPRLR特异性Fab抗体的获得将为高表达hPRLR乳腺癌的生物免疫治疗奠定了基础。     

用CDR3导向抗体库法对鼠抗人膀胱癌单抗进行人源化

目的　构建含鼠单抗CDR3的人源噬菌体抗体库 ,对膀胱癌鼠单抗进行人源化。方法通过重叠PCR及DNA重组技术 ,将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的VH和Vκ组合 ,构建含BDICDR3的人源噬菌体抗体库 ;利用loxp cre定位重组系统 ,增加轻、重链的组合配对 ,获大容量抗体库 ;用膀胱癌细胞 (EJ)从中筛选人源化抗膀胱癌单抗Fab段 ,ELISA方法对所筛克隆进行特异性鉴定 ,同时运用竞争抑制实验对所筛特异性克隆进行抗原表位的核实。结果　首先构建了库容为 2× 10 7的含鼠CDR3区的人源噬菌体抗体库 ;经过在cre 细菌胞内的定位重组后 ,获得库容为 10 1 0 的大容量噬菌体抗体库 ;用EJ细胞筛选到可与其特异结合的人源性Fab段 ;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源单抗结合同一抗原表位。结论　在没有亲本鼠单抗基因 ,仅了解其CDR3序列的条件下 ,可通过CDR3导向 ,构建大容量抗体库 ,筛选到相应的人源化抗体基因。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体

目的： 制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ（β2GPI）抗体Fab片段。方法: 以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果: 通过4轮“亲和吸附-洗脱-扩增”筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论: 利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPI Fab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。     

人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的：构建人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa（GPIIb／IIIa）Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPIIb／IIIa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究。方法：取血小板膜糖蛋白抗体（抗GPIIb／IIIa）阳性的特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPIIb／IIIa Fab噬菌体抗体库,以表达GPIIb／IIIa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响。结果：筛选出2株能够与血小板膜GPIIb／IIIa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集。结论：成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白IIb／IIIa Fab抗体库筛选出特异性识别GPIIb／IIIa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体。     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

抗人巨细胞病毒中和性人源基因工程抗体的研究

目的 研究抗人巨细胞病毒(HCMV)人源基因工程抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术。首先从HCMV感染者外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，逆转录后用特异性引物扩增轻、重链基因。然后插入噬菌体载体pComb3，构建噬菌体抗体库。使用纯化的HCMV病毒裂解物对噬菌体抗体库进行4轮富集，然后通过ELISA筛选阳性克隆，并对获得的克隆进行功能鉴定。结果 克隆和表达了3株抗HCMV人源Fab抗体，经ELISA证明均具有抗原结合活性，间接免疫荧光试验证明具有较高的特异性，最后通过病毒中和试验证明其中2株具有中和活性。结论 获得2株抗HCMV人源Fab抗体，具有一定的中和活性，为下一步研究抗HCMV人源全抗体奠定了基础。     

人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选

目的　构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法　用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果　17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论　成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。     

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的:构建人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPIⅡb/Ⅲa)Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPⅡb/Ⅲa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究.方法:取血小板膜糖蛋白抗体(抗GPⅡIb/Ⅲa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库,以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响.结果:筛选出2株能够与血小板膜GPⅡb/Ⅲa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集.结论:成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体库筛选出特异性识别GPⅡb/Ⅲa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体.     

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

利用大型天然噬菌体抗体库筛选抗死亡受体5人源抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗人死亡受体5(DR5)单链抗体(sc Fv)并对其抗原结合活性进行鉴定。方法以前期真核表达纯化的DR5-Fc蛋白包被筛选管,从自主构建的大容量天然噬菌体抗体库中,通过4轮筛选过程获得噬菌体抗体,采用免疫细胞化学染色、ELISA鉴定其抗原结合活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。结果经过4轮筛选,获得26株与DR5特异性结合的阳性克隆,DNA指纹分析有4种不同的可变区片段;经过基因测序,分析可变区基因的亚群,并将其制备成可溶性的抗体,进一步用免疫细胞化学技术证实所获得的抗体可特异性结合SW480细胞的DR5蛋白。结论利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗DR5的人源性sc Fv。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。     

Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法以Raji细胞免疫BALB/c小鼠,RT-PCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选,获得抗Raji细胞的抗体,通过ELISA法进行抗原结合活性的测定,并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础。     

人源Fab抗体库的构建和抗HBsAg抗体的筛选和鉴定

目的 构建人源Fab抗体文库,筛选抗HBsAg 抗体片段并进行初步鉴定.方法 收集20份临床检验废弃的成人乙肝感染者淋巴细胞,抽提总RNA ,逆转录成cDNA,构建抗乙肝病毒人源免疫型Fab抗体文库.以HBsAg包板进行4轮循环的吸附-洗脱-扩增,挑单克隆用Phage-ELISA、DNA测序筛选阳性克隆,对阳性克隆进行可溶性表达,并用ELISA对其特异性进行鉴定.结果 构建的人源Fab型抗体文库的库容为2.0×108,并具有良好的多样性.经过4轮筛选,成功获得4株能与HBsAg结合的人源抗体克隆,分别命名为hFabHB1、hFabHB2、hFabHB3 和hFabHB4.对其中的hFabHB1进行可溶性表达,ELISA鉴定阳性.结论 成功构建了抗乙肝病毒人源免疫型Fa b抗体文库,从中筛选获得的4株人源Fab抗体片段有望在乙型肝炎的预防和治疗上发挥作用 .