体外培养的人睾丸间质细胞对绒毛膜促性腺激素刺激的反应

目的：探讨体外培养的人睾九间质(Leydig)细胞对绒毛膜促性腺激素(hCG)刺激的反应。方法：随机选择人离体睾九20份进行Leydig细胞原代及传代培养，同一人份Leydig细胞分成4组，不同时间用hCG刺激，连续收集培养上清液，用磁性分离免疫酶联测定法测定睾酮含量。结果：原代细胞对首次hCG的刺激反应敏感，连续刺激则睾酮的分泌受抑制，间隔2天再次刺激时虽有反应，但明显减弱。传代后的Leydig细胞对hCG的刺激几乎无反应。结论：原代Leydig细胞对hCG刺激的反应受刺激时间、刺激次数的影响，临床使用hCG治疗时应注意。     

体外培养小鼠睾丸间质细胞的形态学特征

本研究初步观察了睾丸间质细胞体外培养的形态学特征,以期为深入研究其分泌睾酮的影响因素奠定基础.方法为无菌取成年雄性昆明小白鼠的双侧睾丸,置于盛有适量PBS的培养皿中;用尖镊撕去附睾及白膜,用吸管吹打至曲细精管与间质组织分散;加入10倍体积的胶原酶,37℃下消化10～15 min后移入10 mL离心管,待曲细精管及间质组织沉降后移出上层细胞悬液;取一滴细胞悬液,加入适量台盼蓝混匀后用红细胞记数板计算细胞数目,调整细胞密度至3×105个/mL;将细胞接种在直径35 mm的塑料培养皿中,常规条件下培养;当细胞开始贴壁时,小心吸去旧液,加入新鲜培养液(D-MEM+10%小牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺)培养,定时观察;当培养细胞80%汇合时,弃去培养液,用PBS缓冲4%多聚甲醛室温固定1 h,PBS洗2次;用异丙醇油红法略加改进后进行脂质染色,苏木精复染;另用95%乙醇和PBS缓冲4%多聚甲醛(9∶1)室温下固定细胞40 min,PBS洗2次,1.4%甲基蓝染色后进行观察.本实验每次所获细胞悬液量均为3 mL,细胞密度为1.76×106个/mL,平均每侧睾丸可获间质细胞5.28×106个,其中活细胞、死细胞的平均百分比分别为88.94%、12.06%.在体外,间质细胞贴壁性状良好,不需特殊粘附分子.接种后一般8～10 h后即发生极化,胞质铺展,伸出突起.培养约14～15 h后即开始贴壁.镜见贴壁细胞透明,基本无颗粒,轮廊不清,增殖的细胞相互连接成单层膜状.细胞化学:甲基蓝染色显示,间质细胞核呈圆形或卵圆形,嗜碱性,位于胞质中央;核仁1～2个,清晰可见,一般位于核的边缘部;其胞质轮廊为多角形,一般有3～4个突起,遥抟中可见有多量大小不一的空泡状结构.油红O脂质染色显示,这些空泡状结构为脂质小滴,呈红色或红褐色,大小不一,圆形悬浮状存在,聚集于胞质两极或散布于核的四周.本实验结果表明,间质细胞胞质中存在大量脂滴,推测这些脂质是为其雄激素分泌功能提供必备前体物质而存在的.     

雌马酚对体外培养小鼠睾丸3β-HSD、P450Scc和Vimentin表达的影响

目的 探讨睾丸体外培养模型下雌马酚（Equol）暴露对乳鼠睾丸组织结构、睾酮合成相关酶和波形蛋白（Vimentin）的mRNA及蛋白表达影响。 方法 用浸浴式通气旋转装置体外培养小鼠睾丸组织。实验随机分为DMSO溶剂对照组和4个Equol剂量组（终浓度为0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L）,培养72 h。HE染色观察睾丸组织病理形态学变化;实时荧光定量PCR检测睾酮合成相关基因及Vimentin表达水平;免疫组化法检测睾丸组织相关蛋白表达。 结果 HE染色结果显示经Equol处理的睾丸组织未观察到明显病理学变化。实时荧光定量PCR结果显示,与DMSO溶剂对照组相比,Equol各剂量组3β羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（P450Scc）、Vimentin mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫组化结果显示,与DMSO溶剂对照组相比,3β-HSD、P450Scc、Vimentin的表达在Equol 0.10 μmol/L剂量组上调,10.00 μmol/L剂量组下调。 结论 Equol可影响体外培养的小鼠睾丸3β-HSD、P450Scc、Vimentin表达,对睾丸生理功能可能存在潜在的不利影响。     

米非司酮对体外培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响

目的 :研究米非司酮对大鼠睾丸间质细胞 (Leydigcells)睾酮的基础分泌及促性腺激素刺激的睾酮分泌的影响。方法 :将雄性大鼠处死 ,取睾丸间质细胞加药进行体外培养 ,用放射免疫分析方法测定睾酮含量。结果 :10 μmol·L-1米非司酮对睾酮基础分泌和促性腺激素刺激的睾酮分泌的抑制率分别为 65 18% (P <0 0 0 1)、 72 78% (P <0 0 5 )。结论 :本研究表明米非司酮能直接影响睾丸甾体激素的合成     

大鼠睾丸间质细胞体外培养方法及钒对间质细胞毒性的初步…

以大鼠睾丸间质细胞为受试对象，观察了五氧化二钒对该细胞汾泌睾酮的影响。结果表明：Ｖ２Ｏ５各浓度组与对照组细胞培养液的睾酮含量无显著性差异。结合有关的整体动物实验结果可以认为，睾丸间质细胞不是钒作用的靶细胞。     

小鼠睾丸支持细胞的体外分离、培养与鉴定

目的：用改良方法对小鼠睾丸支持细胞进行体外快速分离与培养,以期建立一种简单快捷纯度高的支持细胞原代培养方法。方法：用0．25％胰蛋白酶和0．1％胶原酶,对睾丸组织进行次第消化,用福尔根染色法和免疫细胞化学方法鉴定睾丸支持细胞。结果：细胞培养72h存活率超过90％,纯度在85％以上。福尔根染色和免疫细胞化学染色结果示,分离细胞有卫星核小体存在,且细胞中FasL阳性表达,表明分离培养的细胞确为睾丸支持细胞。结论：睾丸组织经曲细精管分离后进行胶原酶和胰蛋白酶次第消化,可快速高效分离睾丸支持细胞。     

大鼠睾丸间质细胞体外培养方法及钒对间质细胞毒性的初步研究

以大鼠睾丸间质细胞为受试对象，观察了五氧化二钒（Ｖ＿２Ｏ＿５）对该细胞分泌睾酮的影响。结果表明：Ｖ＿２Ｏ＿５各浓度组（０．１２５、０．２５、０５、２、３ｍｍｏｌ／Ｌ）与对照组细胞培养液的睾酮含量无显著性差异。结合有关的整体动物实验结果可以认为，睾丸间质细胞不是钒作用的靶细胞。     

镉对小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响

目的 探讨镉对小鼠睾丸间质细胞睾酮合成的影响.方法 镉处理组采用20 μmol/L CdCl2处理TM3细胞,分别在加入CdCl2 4 h和8 h后收集细胞上清液,对照组TM3细胞给予等容积磷酸盐缓冲液(DPBS).采用ELISA法测定细胞上清液中睾酮含量,采用RT-PCR和Western blot技术检测睾酮合成关键酶mRNA和蛋白表达水平.结果 镉处理组细胞上清液中睾酮含量明显降低(P＜0. 01).与对照组相比,镉显著下调TM3细胞类固醇激素合成急性调控蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)与 17β-羟类固醇脱氢酶(17β-HSD) mRNA表达(P＜0.01),镉处理组TM3细胞StAR、P450SCC、细胞色素P45017α-羟化酶(P45017α)、3β-HSD与17β-HSD的蛋白表达水平也明显降低,与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜ 0.05,P＜0.01).结论 镉抑制小鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌,其原因可能与镉抑制间质细胞部分睾酮合成关键酶mRNA和蛋白表达水平有关.     

小鼠小肠类器官体外培养体系的建立与应用

目的 建立一种研究肠上皮细胞的体外模型—小肠类器官培养体系,探索其相关病理检测技术方法,为肠道相关疾病的体外研究提供便利平台。方法 将小鼠肠上皮隐窝分离并培养成小肠类器官,体外模拟肠上皮的生长发育过程。通过制作石蜡切片,探索应用免疫组化技术以及基于基质胶中类器官三维水平免疫荧光技术对相应的增殖与分化信号进行检测。结果 探索并建立了小肠类器官体外培养体系,应用石蜡切片免疫组化技术与三维水平免疫荧光技术能够准确检测小肠上皮结构的生长发育状态。结论 小肠类器官体外培养体系的建立与免疫检测技术的应用,将逐渐使其成为人们研究肠道相关疾病最为有利的技术手段。     

人牙胚体外器官培养模型的建立

目的 :建立人牙胚体外器官培养模型 .方法 :分泌前期人牙胚采用Trowell型支架培养法 ,RPMI 16 4 0培养基(含 2 0 0 g·L-1FBS ,2 0 0mg·L-1谷氨酰胺 ,2 0 0mg·L-1L 抗坏血酸 ,1× 10 -7mol·L-1维甲酸 ,10 0kU·L-1青霉素 ,10 0kU·L-1链霉素 ) ,在 37℃ ,5 0mL·L-1CO2 +95 0mL·L-1空气条件下进行培养 ,每 4 8h更换一次培养基 .体外培养 .2 ,4 ,6和 8d随机抽取牙胚进行组织学观察 .结果 :培养的牙胚组织结构关系与对照组一致 ,牙尖部形态进一步突出 ,细胞形态典型 .在 8d时 ,牙尖之间部分造釉器细胞和成牙本质细胞开始出现坏死 .结论 :为体外研究人类牙齿正常发育及各种因素对牙齿发育的影响提供了一个实用的模型     

大脑皮质星形胶质细胞体外条件化培养体系的建立

目的：建立大脑皮质星形胶质细胞体外条件化培养体系。 方法：用快速灵敏的MTT比色法测定细胞活力,对纯化细胞进行形态学观察、免疫组化鉴定。结果：经分离、纯化,获得了纯的单一细胞群,星形细胞MTT测定的A值为0.255±0.012。 结论：建立大脑皮质星形胶质细胞体外条件培养体系可以快速、高效得到纯度高的贴壁的星形细胞。     

钙网蛋白calreticulin在小鼠睾丸中的表达及意义

目的:研究钙网蛋白(calreticulin,CRT)在成年小鼠睾丸组织中的表达及分布,探讨CRT在小鼠睾丸发育及其精子发生过程的功能?方法:运用免疫印迹法和免疫组织化学术,检测CRT在小鼠睾丸组织中的表达和分布?结果:免疫印记法证实CRT在成年小鼠睾丸高表达,同时免疫组织化学显示阳性信号主要集中在小鼠睾丸精原细胞和间质细胞?结论:CRT在小鼠睾丸中的定位提示其可能与精原细胞更新和分化以及雄激素分泌密切相关?     

P物质对培养的大鼠睾丸细胞睾酮分泌的影响

目的　研究P物质 (SP)对睾丸细胞分泌睾酮 (T)的影响。方法　应用细胞培养技术和放谢免疫测定法研究不同浓度的P物质对睾丸细胞分泌睾酮是否有直接作用。结果　实验组 (加入SP)的培养液T的含量比对照组 (未加SP)明显减少。实验组分别与对照组进行两两比较 (t -test)并采用单因素方差分析 ,P均 <0 0 1差异有高度的显著性。结论　P物质对培养的大鼠睾丸细胞分泌T有直接抑制作用 ,且随着浓度增加 ,抑制作用增强     

永生化表皮细胞体外快速扩增的实验研究

目的探讨获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术.方法通过真核表达载体,把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入兔表皮细胞,筛选、挑选阳性克隆在微载体-RCCS内快速扩增永生化表皮细胞.观测RCCS中微载体培养永生化表皮细胞的生长情况和检测细胞代谢率,进行抗人角细胞广谱角蛋白(AE1/AE3)免疫组化染色,并与常规培养方法进行比较.结果永生化表皮细胞在微载体-RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短(P＜0.01).在培养第10天,细胞数量可达最初接种的64倍(P＜0.01).结论联合应用微载体和RCCS培养技术,能够在体外快速、大量扩增永生化表皮细胞.     

以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立

目的:建立一个简便、廉价和稳定的小鼠淋巴管内皮细胞(LEC)培养体系. 方法:应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,消化法分离获得LEC,置于自制的鼠尾胶包被的培养瓶(板)中培养. 以免疫荧光化学法检测LEC特异性标记物VEGFR-3和LYVE-1的表达,以3H-TdR掺入率测定和细胞倍增时间检测LEC的增殖活力,以淋巴管形成试验判定LEC能否形成淋巴管样结构. 结果:不完全弗氏佐剂能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成,所获LEC活细胞数大于98%. 免疫荧光化学检测表明, LEC表达VEGFR-3和LYVE-1. 在鼠尾胶包被的培养瓶(板)中, LEC生长状况良好, 3H-TdR掺入率明显增加,倍增时间为(42.7±3.2) h;在鼠尾胶凝胶中,LEC能形成淋巴管样结构. 结论:鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率,确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法,建立兔结膜上皮细胞系,为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养,在不同时间观察细胞的形态,并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢,胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染,DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

小鼠棕色脂肪原代培养模型的建立

目的:探索小鼠棕色脂肪细胞原代培养的方法?方法:取C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织,采用胶原酶消化过滤法获得梭形细胞,对培养出来的细胞进行形态学观察,诱导分化后用油红O染色法染色定性,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因表达情况?结果:培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,诱导分化后分化率高,经油红O染色证实为脂肪细胞,荧光定量PCR检测棕色脂肪标志基因UCP-1表达量明显升高?结论:从C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织中可以分离出具有很强增殖?分化能力的前棕色脂肪细胞,这种棕色脂肪细胞原代培养模型的建立为在体外进一步研究棕色脂肪的功能提供了良好的基础?     

大鼠颌下腺细胞培养方法建立及生物学特性研究

目的:建立大鼠颌下腺细胞体外培养的方法,为涎腺细胞的体外扩增及基因治疗涎腺疾病奠定基础。方法:无菌条件下取1日龄Wistar大鼠颌下腺,经LB3、胰酶联合消化后原代细胞接种于含2%胎牛血清、表皮生长因子、胰岛素等的DMEM/F12培养液,相差显微镜观察原代及传代细胞的形态特征,免疫组织化学染色鉴定细胞来源,PAS染色观察体外培养第2代细胞合成、分泌多糖功能。结果:体外培养的大鼠颌下腺原代细胞为圆形、三角形、多边形。细胞传至第2代生长良好,形态未发生改变。体外培养的第2代细胞角蛋白、E-钙联蛋白免疫组织化学染色、PAS染色均为阳性,表明细胞为上皮来源且具有合成、分泌多糖类物质的功能。结论:酶联合消化法成功地分离、体外培养了大鼠颌下腺细胞,第2代细胞仍可保持腺细胞的生物学特征。     

建立大鼠前庭器官体外培养模型及观察佛波酯作用下的超微结构变化

目的:建立大鼠前庭器官的原代体外培养模型,并通过透射电镜观察前庭上皮细胞在佛波酯(PMA)作用前后的超微结构变化.方法:无菌条件下取出生2 d大鼠的椭圆囊上皮,体外培养1～7 d;从第2日开始用倒置显微镜观察、照相,试验组加入PMA 30 min,2 h和6 h,固定,透射电镜观察.结果:体外培养椭圆囊1 wk,12 h时可见成纤维细胞沿移植物边缘游出,2 d后内皮细胞聚集,呈铺路石样,透射电镜观察细胞无肿胀,胞膜、胞核完整,线粒体嵴无肿胀,纤毛无脱落;PMA各试验组细胞形态正常,核糖体密集,高尔基体较前发达,内质网轻度扩张.结论:大鼠前庭器官体外培养方法可行,为今后进一步研究提供了实验模型.