表达屋尘螨I类变应原Der p1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的：探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨I类变应原（Der p1)的影响。方法：应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p1表达量的影响。结果：（1）Der p 1基因在E.coliBL21（pBVDP8)菌密度A600nm0.6左右时，42℃最佳诱导时间为4h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600nm为0．5－0．7时，42℃诱导4hDerp 1表达量最高，结论：确定了最适诱导时间和诱导时机，初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术。     

表达屋尘螨Ⅰ类变应原Der p 1的基因工程菌的发酵条件探讨

目的 探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组屋尘螨Ⅰ类变应原(Der p 1)的影响.方法 应用摇瓶发酵试验观察不同诱导时间和不同诱导时机对Der p 1表达量的影响.结果 (1)Der p 1基因在E.coli BL21(pBVDP8)菌密度A600 nm0.6左右时,42℃最佳诱导时间为4 h.(2)工程菌E.coli BL21(pBVDP8)在30℃培养至A600 nm为0.5～0.7时,42℃诱导4 h Der p 1表达量最高.结论 确定了最适诱导时间和诱导时机,初步形成了一套高表达Der p 1的发酵技术.     

尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体的构建

目的:构建尘螨主要变应原Der f1融合基因真核表达载体,为进一步转染真核细胞表达融合蛋白奠定基础.方法:根据Genebank中Der f1基因的核酸序列(AB034946),设计引物,采用PCR法,从保存的JM109工程菌中扩增Der f1编码基因,将其连接到小鼠IL-12(mIL-12)基因3′端,组成融合基因mI...     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

靶向人端粒酶逆转录酶T细胞表位肽的治疗性癌症疫苗研究进展

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是人端粒酶的催化亚单位,正常成熟组织中基本无表达,而在多数恶性肿瘤中高表达,而使其成为恶性肿瘤特异性疫苗免疫治疗的首选抗原.T细胞表位肽疫苗是用抗原的T细胞表位制备的疫苗,在肿瘤免疫治疗中有其独特的优势.hTERT的T细胞表位肽疫苗可诱导机体产生特异性免疫应答,在小鼠体内显示了抗肿瘤效应,并已进入人体试验阶段,显示出较好的应用前景.文中就hTERT的T细胞表位肽疫苗在恶性肿瘤中的免疫治疗的研究进展作一综述.     

安脱达屋尘螨变应原疫苗与低温等离子治疗变应性鼻炎的疗效比较

目的:对比分析安脱达屋尘螨变应原疫苗与低温等离子分别治疗变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的疗效.方法:选取我院2018年1月至2019年12月收治的88例变应性鼻炎患者作为研究对象,按随机分组方法,分成研究组和常规组两组,每组患者各44例.其中常规组患者予以低温等离子治疗;研究组患者予以安脱达屋尘...     

CEA的多表位疫苗基因的设计及构建的表达载体在原核表达系统中的表达

目的 本研究设计肿瘤相关抗原CEA的多表位疫苗基因和构建的重组表达载体在原核表达系统中成功表达融合蛋白.方法 根据预测分析得到的表位氨基酸序列,选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK),并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,委托生物技术公司合成寡核苷酸,退火获得目的基因,并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内.将此重组载体转化E.coli BL21(DE3)表达融合蛋白,并经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表位融合蛋白ozlf-86/87.结果 嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87,进行酶切和测序鉴定,构建成功.SDS-PAGE分析表明,重组质粒在37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合;蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％.,并经Western blot鉴定为目的蛋白.用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白,即ozlf-86/87,纯度达到90％以上.结论 本研究获得的多表位融合蛋白对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和进一步的疫苗研究奠定了基础.     

细胞程序性死亡配体1表位肽疫苗的设计及抗肿瘤活性

目前已有多款细胞程序性死亡受体1(PD-1)和其配体（PD-L1）免疫检查点阻断抗体用于临床治疗,但只有部分患者表现出临床反应,因此需要一种替代的肿瘤免疫治疗策略。以PD-L1为靶点的治疗性肿瘤疫苗是一种有意义的尝试。本研究设计了以PD-L1为靶点的表位肽疫苗,然后基于人源化免疫系统（HIS）小鼠模型筛选,具有免疫原性的PD-L1表位肽,进一步研究其抗肿瘤活性。结果显示,设计并筛选得到的PD-L1-B1表位肽疫苗不仅成功诱导了PD-L1特异性的体液免疫和细胞免疫,还表现出抗肿瘤活性。此外,免疫治疗还增加了肿瘤的T淋巴细胞浸润,重塑了肿瘤免疫抑制微环境。综上所述,PD-L1-B1表位肽疫苗表现出强效的抗肿瘤活性,对PD-1/PD-L1阻断不敏感的患者可能是一种有效的替代免疫治疗策略。     

恶性疟细胞毒性T淋巴细胞单表位疫苗抗原递呈细胞模型的建立

目的 构建恶性疟细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）单表位疫苗及建立抗原递呈细胞模型。方法 采用中国人群常见的HLAⅠ类分子A11限制的恶性疟（CTL）抗原表位(VTCGNGIQVR),合成其DNA序列并克隆于真核表达载体,构建CTL单表位DNA疫苗。将上述克隆在HLA－A11表型细胞株中进行表达,流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子表达水平。结果 上述CTL单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达明显促进HLA－A11分子在细胞表面的表达,用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平（P＜0.05）。结论 成功构建CTL单表位短肽表达载体,模拟体内环境建立了抗原递呈细胞模型,提示CTL表位在该细胞模型内被内源性加工和递呈,以该表位为基础的疫苗可以为HLA－A11遗传背景的人群提供免疫防护。     

T辅助细胞在疫苗研制中的作用

发展感染性疾病疫苗之关键挑战在于利用确定的抗原以刺激产生能引起保护作用的合适的免疫反应。肽类疫苗的运用得到了极大的关注，其意义在于，已知不同的多表位构成单一结构以诱导出所希望的免疫反应所表现出的灵活性。这一般比利用减毒的活疫苗要安全并且相对而言比制造亚单位疫苗要容易。然而，多肽疫苗的发展面临巨大挑战。这一方法在诱导遗传背景复杂的人群免疫反应方面受到限制，这与主要组织相溶性复合物(MHC)多态性有关。因同样的理由，肽类免疫应答常因缺乏适当的辅助T淋巴细胞(HIL)而引导出不充分的细胞毒素T淋巴细胞(CTL)和抗体反应。另一个运用线性肽链结构的可能缺点是：为了引导出合适抗体反应，表面免疫球蛋白受体簇对于激活静息的B细胞就成为必须因素。由WHC多肽性引起的问题可由运用不加区别的T细胞表位来解决。从麻疹病毒F蛋白(氨基酸288到302)中得到的不加区别的T细胞表位和鼠的确定结合在多种MHC分子上的辅助T细胞表位(v1EB，aa191-209)已被定性并且被用于能极大激发免疫应答的结构中，以克服单一限制型免疫应答的缺陷。合成的，非自然Pan DR表位(PADRE)具有退化的结合几种通常HLA—DR的能力，能以绝对效价和抗体反应质量两种形式来增强激发短肽链的免疫应答。另外，一些所谓的从流感病毒血凝素(HA)来的“不加区别的”T细胞表位，恶性疟疟原虫红细胞前期抗原和分枝杆菌蛋白被报道能激发广泛的免疫应答。为了不加区别地结合于几种同型和同种异型的MHCⅡ类分子，这些肽类应显示出部重叠MHC结合形式或应利用保存于配体中的固定位点和应缺失等位基因特异性固定残基，以防止结合于其它Ⅱ类分子。了解MHCⅡ类分子对肽链的不加区别及特异性识别的生物物理学基础将为在疫苗设计中突破遗传限制的策略提供分子水平的依据。