日本血吸虫重组Bb疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠不同时间诱导的免疫应答作用

目的: 探讨日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(rBb)疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠后不同时间诱导的免疫应答作用,阐明该疫苗的免疫应答机制。方法: 将88只BALB/c小鼠随机分为2组,每组44只,分别经皮下注射(皮下注射组,SC组)和鼻腔黏膜(鼻腔黏膜接种组,IN组)接种免疫小鼠,在免疫后0~20周每2周每组随机取4只小鼠,无菌取脾,制备悬浮脾细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测脾细胞增殖活性,流式细胞仪(FACsort)检测T细胞亚群和脾细胞凋亡率,双抗体夹心ELISA法检测脾细胞上清液中干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素17(IL-17)的动态变化。结果: 与免疫0周时比较,SC组小鼠脾细胞增殖活性于免疫后8周达到峰值(P<0.05),IN组小鼠于免疫后4周达到峰值(P<0.05)。与免疫0周时比较,SC组和IN组小鼠CD4⁺T细胞均于免疫后8周达到峰值(P<0.05);CD8⁺T细胞分别于8周和6周达到峰值,但差异无统计学意义(P>0.05)。与免疫0周时比较,2组小鼠脾细胞上清液中IFN-γ水平均于免疫后2周达到峰值(P<0.05),SC组和IN组IL-17水平分别于免疫后14和12周达到峰值(P<0.05)。与免疫0周时比较,SC组小鼠脾细胞凋亡率于免疫后2周达到峰值(P<0.05),IN组于4周达到峰值(P<0.05)。IN组与SC组小鼠各检测指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: 经皮下注射和鼻腔黏膜途径接种的日本血吸虫重组Bb疫苗早期即可诱导小鼠产生有效的免疫应答,以Th1型免疫应答为主,2种免疫途径所诱导的免疫应答无明显差异。     

日本血吸虫感染小鼠外周血CD4+T细胞亚群动态变化的研究

目的 了解日本血吸虫感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群水平的动态变化情况,探讨感染进程中CD4⁺T细胞亚群的免疫调控作用。方法 通过日本血吸虫尾蚴腹贴法建立日本血吸虫感染小鼠模型,将18只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成正常对照组和日本血吸虫感染组,每组9只。 通过流式细胞染色计数的方法检测感染3周、5周及8周后小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞变化情况。结果 随着日本血吸虫感染进程,与正常对照小鼠相比,感染小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群中Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例均显著增加。不同细胞亚群比例增加的趋势不尽相同,其中Th1细胞在感染第3周占比较高但其增长较为缓慢,而感染前3周Th2、Treg细胞占比较低但其增加幅度较大,在第8周达到峰值;Th17细胞比例在感染前3周基本无变化,随后显著增加。结论 日本血吸虫感染引起宿主CD4⁺T细胞亚群比例发生变化,本研究发现感染显著增加小鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞比例,感染后3周内小鼠外周血CD4⁺T细胞亚群以Th1细胞为主,5周后Th2、Th17、Treg细胞逐渐占主导地位。本结果为研究日本血吸虫病免疫病理机制和特征提供基础。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗诱导小鼠脾细胞IL-6变化的研究

目的：研究日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗对小鼠脾细胞IL-6的影响。方法：实验1采用该疫苗皮下免疫小鼠,免疫后8周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染,感染后6周剖杀小鼠,同时设有PBS对照组。实验2用该疫苗皮下和静脉注射分别免疫小鼠,于免疫后0、4、8、10、14和16周各剖杀4只,分离脾脏,用Sj26或PHA刺激脾细胞,用ELISA法检测脾细胞上清液中IL-6含量。结果：疫苗免疫,尾蚴攻击后,IL-6水平无明显变化;动态观察发现IL-6于疫苗免疫后8～10周达最高水平。结论：IL-6可能与日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗诱导的保护性免疫力无关。     

不同途径接种乙脑毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所致BALB/c鼠的细胞免疫

目的:研究经不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所诱导的细胞免疫。方法:将乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗(命名为pJME)分别以肌注、滴鼻两种免疫方式免疫BALB/c鼠,流式细胞仪检测脾脏CD4 /CD8 T淋巴细胞亚群,乳酸脱氢酶释放实验测定脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果:pJME肌注组与滴鼻组免疫鼠CD4 T淋巴细胞百分比(30.91 0.72)%、(27.89 0.42)%,均高于灭活疫苗与载体肌注组(23.73 0.17)%、(23.78 0.21)%(P<0.05),肌注组显著高于滴鼻组(P<0.05);而CD8 T淋巴细胞百分比(14.62 0.25)%、(13.73 0.50)%,也均高于灭活疫苗和载体肌注组(10.80 0.39)%、(11.97 0.06)%(P<0.05),肌注组与滴鼻组无显著差异(P>0.05);两组有明显CTL效应(pJME肌注组29.1%,pJME滴鼻组17.1%),明显高于载体肌注组6.0%,pJME肌注组明显优于滴鼻组。结论:pJME以两种途径免疫鼠时可诱导明显细胞免疫反应。     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和CAg的动态观察

目的检测日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠不同时间后的血清IgG及其亚类和CAg反应.方法 106CFU疫苗皮下和静脉注射免疫BALB/C鼠,分别于免疫后0、4、8、10、14、16周各剖杀4只,收集血清,常规ELISA法检测IgG及其亚类和CAg.结果皮下注射组IgG在免疫后14周,IgG1在免疫后14～16周,IgG2a在免疫后4周和IgG2b在免疫后16周达最高水平,未能测到CAg;静脉注射组IgG在免疫后10周,IgG1和IgG2a在免疫后8周以及IgG 2b在免疫后16周达最高水平,CAg在免疫后10周升高.结论日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗能诱导宿主产生高水平的IgG、IgG2a和IgG2b,静脉注射的免疫效果优于皮下注射.     

过继转移日本血吸虫感染鼠CD8α-CD11c+型DC亚群对OVA诱导的CCL-11和IL-13Rα2的影响

目的:通过过继转移日本血吸虫感染鼠树突状细胞(DC)亚群,探讨DC亚群对卵清蛋白(OVA)诱导的肺组织CCL-11和IL-13Rα2表达及嗜酸性粒细胞浸润的影响.方法:用CD8α和CD11c磁珠分离纯化日本血吸虫感染鼠DC亚群,分别获得CD8α-CD11 c+DC和CD8α+CD11c+DC.将24只BALB/c小鼠随机分为4组:正常对照组(Norma1组),单纯诱发哮喘组(OVA组),过继转移日本血吸虫感染鼠CD8α+CD11c+DC并诱发哮喘组(SJCD8α+DC/OVA组)和过继转移日本血吸虫感染鼠CD8α-CD11c+DC并诱发哮喘组(SJCD8α-DC/OVA组).SJCD8α+DC/OVA和SJCD8α-DC/OVA两组小鼠分别经尾静脉过继转移相应的DC亚群,1h后除正常组外均开始诱发哮喘.4周后处死小鼠,取小鼠肺组织制成切片,进行HE染色和免疫组化染色,观察炎性变化,检测CCL-11和IL-13Rα2在肺组织中的表达.结果:肺组织切片HE染色显示Normal组小鼠无炎症,SJCD8α-DC/OVA组小鼠炎症较轻,SJCD8α+DC/OVA和OVA组炎症明显且有大量炎性细胞浸润.免疫组化结果显示,Normal、OVA、SJCD8α+DC/OVA和SJCD8α-DC/OVA 4组小鼠肺组织CCL-11阳性区域平均光密度值分别为0.152 3±0.010 9、1.496 7±0.225 6、1.343 5±0.094 9和0.863 4±0.211 4,CCL-11阳性区域面积占血管、气管总面积的百分比分别为0.000 4±0.000 3、0.257 2± 0.085 9、0.210 3±0.023 1和0.039 2±0.005 4;IL-13Rα2阳性区域平均光密度值分别为0.152 7±0.015 3、0.334 5±0.003 7、0.283 2±0.035 0和0.175 5±0.020 1,IL-13Rα2阳性区域占血管、气管总面积的百分比分别为0.037 0±0.034 1、0.297 0±0.006 2、0.287 0±0.031 0和0.117 1±0.005 0.差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论:日本血吸虫感染鼠CD8α-CD11c+DC亚群可以抑制OVA诱导的CCL-11和IL-13Rα2表达,从而对哮喘起到抑制作用.     

结核感染与发病状态下相关细胞因子、T细胞亚群的变化及临床应用研究

目的 :对结核菌感染免疫应答过程中相关细胞因子、T细胞亚群的变化情况进行观察研究 ,并使之应用于临床。方法 :分别采用ELISA、APAAP、单向琼脂免疫扩散等方法对相关免疫指标进行检测。结果 :结核菌感染者T细胞亚群CD3+T细胞、CD4 +细胞、sIL 2R水平、特异结核循环免疫复合物增高 ;肺结核患者CD4 +T细胞降低 ,IL 2活性下降 ,mIL 2R表达明显降低 ,TNF α水平降低 ,CD8+细胞升高 ,sIL 2R明显升高 ,IL 4、IL 10水平均增高 ,且进展期较好转期更为明显。结论 :IL 2、IL 4、IL 10、TNF α、sIL 2R和T细胞亚群在免疫应答过程中具有重要的作用 ,以上免疫指标可判断结核感染、发病和病情变化情况     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察

目的 动态观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化.方法 将5×108克隆形成单位(CFU)和5×105CFU疫苗分别采用口服灌胃和鼻腔内接种免疫BALB/c鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周各剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,用流式细胞术(FCM)检测免疫小鼠脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比,同时设双歧杆菌液体培养基(MRS)对照.结果 口服灌胃组的脾CD4+T细胞亚群在免疫后4～10周升高,免疫后6周达最高水平,CD8+T细胞亚群无明显变化;鼻腔内接种组脾CD4+T细胞亚群在免疫后4～8周升高,免疫后6周达最高水平,CD8+T细胞亚群无明显变化.结论 CD4+T细胞亚群在细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导的小鼠免疫应答中起关键作用.     

大叶性肺炎患儿诱导痰中T细胞亚群和细胞因子的变化及意义

目的：研究大叶性肺炎患儿诱导痰中T细胞亚群和细胞因子的变化及其临床意义。方法选择2014年9月至2015年9月在我院儿科接受诊治的大叶性肺炎患儿64例作为观察组,另选同期在我院进行健康体检的健康儿童60例作为对照组,比较两组受检者诱导痰内的T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+),炎性细胞因子水平(IL-6、IL-8及TNF-α),以及T细胞亚群有关细胞因子水平(IFN-γ、TGF-β及IL-17A)。结果观察组患儿的诱导痰内的CD3+(67.84±8.62)%、CD4+(46.08±6.93)%及CD4+/CD8+(2.07±0.21)均较对照组的(55.37±6.25)%、(30.82±5.07)%、(1.40±0.17)明显更高,差异均有统计学意义(P<0.05);两组受检者的CD8+(24.23±3.06)%及(24.63±3.62)%比较,差异无统计学意义(P>0.05);观察组患儿诱导痰内的IL-6(358.27±29.13) ng/L、IL-8(2.13±0.07) ng/L及TNF-α(3.08±0.92) ng/L水平均较对照组的(150.24±32.28) ng/L、(0.58±0.02) ng/L、(0.39±0.23) ng/L明显更高,差异均有统计学意义(P<0.05);观察组患儿诱导痰内IFN-γ(5.19±2.63)×10-4及TGF-β(3.31±1.09)×10-2显著低于对照组的(23.42±3.92)×10-4及(6.18±2.11)×10-2,而IL-17A (3.46±1.24)×10-5显著高于对照组的(2.94±1.30)×10-5,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大叶性肺炎患儿诱导痰中的T细胞亚群以及细胞因子均呈现出异常变化,对此类指标进行监测有助于临床的诊断与治疗。     

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的动态观察

目的:动态观察多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫小鼠后脾细胞亚群的变化.方法:将疫苗采用鼻腔内接种免疫BALB/C鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有PBS对照.结果:疫苗接种组的脾CD4 和CD8 T细胞亚群分别在免疫后2～12周和2～18周升高,分别在免疫后6和10周达最高水平.结论:CD4 T细胞亚群数目在多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em 14-3-3疫苗免疫早期(2～6周)显著增加.     

重组日本血吸虫SjGST-Sj32蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

应用基因工程技术分别表达出ＳｊＧＳＴＳｊ３２,Ｓｊ３２和ＳｊＧＳＴ,用于保护性免疫的动物实验及其体液免疫机制的初步探讨。结果：与对照组相比,重组ＳｊＧＳＴＳｊ３２组,Ｓｊ３２组,Ｓｊ３２＋ＳｊＧＳＴ组均有明显的减虫效果（Ｐ＜０．０５）。上述三组及ＳｊＧＳＴ组的肝脏虫卵计数均较对照组为少（Ｐ＜０．０１）。提示重组Ｓｊ３２ｋＤ蛋白可诱导小鼠产生明显的抗日本血吸虫攻击感染的保护性免疫及抗生殖免疫效果,而ＳｊＧＳＴ仅表现出一定的抗生殖免疫效果。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

Immune responses against Schistosoma japonicum after vaccinating mice with a multivalent DNA vaccine encoding integrated membrane protein Sj23 and cytokine interleukin-12

Background The vaccination of mice with DNA encoding single candidate antigens has failed to induce significant protection against Schistosoma japonicum ( S. japonicum) challenge infections. In this study, we evaluated the feasibility of using a multivalent DNA vaccine which co-expressed S.japonicum integral membrane protein Sj23 and murine cytokine IL-12 to induce protective immune responses.Methods The plasmid pVIVO2-IL12-Sj23, a eukaryotic expression vector expressing Sj23 and murine IL-12 simultaneously, was constructed, identified, and tested for expression in vitro. Its ability to protect against S. japonicum challenge infections was analyed according to worm reduction rate and egg reduction rate after vaccination of BALB/c mice. The serum levels of specific IgG antibody were determined by enzyme-linked-immuno sorbent assay (ELISA) and Western blot analysis. Using cultured spleen cells, IFN-γ and IL-4 post-stimulation were quantified by ELISA. The phenotypes of splenocyte populations were analyzed by flow cytometry (FCM).Results The plasmid DNA pVIVO2-IL12-Sj23 was proven to express well in vitro by transient transfection of HEK-293 cells. Immunization resulted in a worm reduction rate of 45. 53% and egg reduction rate of 58.35%. ELISA and Western blot analysis indicated that immunized mice generated specific IgG against Sj23. Spleen cells showed significant increases in IFN-γ but decreases in IL-4.No significant differences in CD4^ and CD8^ subgroup ratios were observed after the challenges.Conclusions The multivalent DNA vaccine pVIVO2-1L12-Sj23 is sufficient to elicit moderate but highly significant levels of protective immunity against challenge infections. Cytokine IL-12, as a gene adjuvant, was able to enhance the Thl responses and, hence, the protective immunity.     

Anti-fecundity immunity in mice immunized with anti-idiotypic monoclonal antibody NP30 of Schistosoma japonicum

Ｉｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｂｌｏｃｋｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓｂｙｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ,ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｍａｎｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｖａｃｃｉｎｅｏｆｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ Ｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｖａｃｃｉｎｅｏｆｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓｗａｓｍｏｓｔｌｙｆｏｃｕｓｅｄｏｎａｎｔｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｍｍｕｎｉｔｙ ,ｂｕｔｔｈｅｍｏｓｔｈｏｐｅｆｕｌｃａｎｄｉｄａｔｅｍｏｌｅ…     

重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫保护作用的研究

目的研究重组日本血吸虫32kDa蛋白和铁蛋白联合免疫对感染小鼠的免疫保护作用。方法大量制备重组日本血吸虫32kDa蛋白(rSjGST-Sj32)和铁蛋白(GMCSF-SjFer)。48只昆明小鼠随机分为A,B,C,D4组,每组12只。B组和C组分别为rSjGST-Sj32和GMCSF-SjFer免疫组,每鼠注射50μg重组蛋白加弗氏完全佐剂(FCA);D组为联合免疫组,每鼠注射50μg重组32kDa蛋白和50μg铁蛋白的混合物加FCA;A组为FCA对照组。分别于0、2、6w共免疫3次。第3次免疫后2w,每鼠经腹部皮肤攻击感染40±1条尾蚴,感染后第45天剖杀所有小鼠,比较各组间减虫率和鼠肝卵减少率。结果联合免疫组与FCA对照组相比,获得了36.53%的减虫率和68.44%的每条雌虫肝组织产卵减少率,而单独rSjGST-Sj32免疫组的减虫率及每条雌虫肝组织产卵减少率分别为22.80%和43.12%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001);单独GMCSF-SjFer免疫组分别为21.05%和41.91%,均显著低于联合免疫组(P<0.05及P<0.001)。结论rSjGST-Sj32蛋白和GMCSF-SjFer蛋白联合免疫可显著地提高这两种蛋白单独应用时的免疫保护作用。     

Th17细胞因子及炎症趋化因子在日本血吸虫感染小鼠肝脏中的表达

目的 观察日本血吸虫感染C57BL/6小鼠肝脏Th17细胞因子及其相关炎症趋化因子动态变化和肝脏虫卵肉芽肿病变,探讨其在日本血吸虫虫卵肉芽肿病变形成中的作用.方法 建立日本血吸虫感染C57BL/6小鼠模型,感染后2、4、6、8、10和12周剖杀小鼠,用实时荧光定量PCR法检测小鼠肝脏白介素17(IL-17)、IL-6、...     

Calpain重组分子免疫小鼠IFN-γ和IL-4表达的变化

目的探讨日本血吸虫疫苗侯选分子-钙离子激活的中性蛋白激酶（Calpain）的保护性免疫和免疫保护机制. 方法用重组纯化的Calpain抗原免疫BALB/c小鼠,RT-PCR分析小鼠-氧化氮激酶（iNos.enos.nNos）mRNA的表达;ELISA分析免疫小鼠体外培养脾细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-4的动态变化.结果重组Calpain抗原免疫小鼠1周后,小鼠iNos mRNA的表达显著增强;培养24h免疫鼠脾细胞上清中IFN-γ浓度显著高于对照组,而IL-4的产生在免役组与对照组之间无显著性差异. 结论Calpain抗原能诱导IFN-γ的产生,提示Calpain诱导Th1的免疫应答反应来抗日本血吸虫的感染.     

C_（57）BL／6鼠日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿模型特性初步研究

本实验对所建虫卵可溶性抗原（ＳＥＡ）致敏和未致敏Ｃ５７ＢＬ／６鼠日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿模型特性进行初步探讨，并与Ｃ５７ＢＬ／６鼠自然感染模型进行比较。结果显示：１．经脾注射活卵诱发小鼠肝虫卵肉芽肿方法可行，２．ＳＥＡ致敏组肝虫卵肉芽肿形成过程及细胞组成基本与自然感染组相似，但发展速度较快；３．ＳＥＡ致敏组和自然感染组各期虫卵肉芽肿内ＩｇＧ抗体均呈阳性。从而证明，所建ＳＥＡ致敏Ｃ５７ＢＬ／６鼠日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿模型对于肝虫卵肉芽肿防治研究确有价值。