多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌

目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。     

免疫磁珠富集-实时荧光PCR技术在食源性致病菌监测中的应用研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌3种致病菌的免疫磁珠富集-实时荧PCR(IMSqPCR)技术的检测方法,应用于食品微生物及其致病因子的监测工作中。方法将菌株及样品稀释后,使用IMSqPCR技术进行检测,用菌株对该方法的特异性进行验证;对586份各类食品用IMS-qPCR和传统培养法进行比较分析。结果 IMS-qPCR方法对13株标准菌株符合率为100.00%;与分离到的3种致病菌的符合率均为100.00%;586份监测食品的检测结果显示,IMS-qPCR方法对食品中3种食源性致病菌的符合率为93.22%,而IMS-qPCR法可在2~3 h内获得检测结果。结论 IMS-qPCR方法可以推广应用于食品微生物及其致病因子的监测,该方法具有特异性强、敏感度高、速度快的特点,也可以应用于突发公共卫生事件应急检测,为事件的处置提供有效技术支撑。     

实时荧光定量PCR在肝炎检测中的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎(乙肝)检测中的应用。方法:对450例急、慢性乙肝患者,采用经酶联免疫吸附试验检测血清,并按血清学标志分为三组,并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果:不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%,三组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测,不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

多重实时荧光定量PCR检测急性肝炎患者HBV和HCV方法的建立与意义分析

目的建立一种新的可以快速筛查急性肝炎患者HBV和HCV感染的多重实时荧光定量PCR方法。方法收集596例急性肝炎患者血清或血浆样本,应用自主构建的多重实时荧光定量PCR方法同时检测HBV和HCV,同时应用HBV和HCV单管检测试剂进行检测分析。结果新建立的多重实时荧光定量PCR体系,可以有效地检测HBV和HCV的阳性质控品及阳性样本。多重实时荧光定量PCR体系特异性较好,检测HBV和HCV时,两者之间无交叉反应,且以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性;多重实时荧光定量PCR体系检测HBV、HCV的灵敏度分别为20 IU/ml、50 IU/ml;多重实时荧光定量PCR体系精密度好,检测HBV、HCV的CV值分别为0.11%、0.096%。在检测临床样本时,多重复合体系检测血清或血浆中HBV和HCV的检出率与单独检测HBV和HCV具有很好的一致性,且HBV和HCV的一致率分别达到97.7%(k=0.952)、98.8%(k=0.976);同时有6例样本出现HBV和HCV共感染。结论新型多重实时荧光定量PCR方法对快速检测及筛查HBV和HCV较快捷,而且特异性好、灵敏度高、精密度好。因此多重实时荧光定量PCR方法对2种肝炎病毒的检测具有重要意义。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

EMA-qPCR检测活沙门菌方法研究

目的 为解决荧光定量PCR（qPCR）方法不能区分死菌和活菌的问题,探索一种快速定量检测“活的”沙门菌的技术路线。方法 将不同浓度叠氮溴化乙锭（EMA）作用于不同浓度的死/活沙门菌后,用qPCR检测沙门菌Ct值,确定EMA的最优使用浓度。在混合菌量为10⁶、10⁵、10⁴、10³ CFU/mL,活菌比例为0%、10%、30%、50%、70%、100%条件下,确定EMA处理过的活菌+死菌,未加EMA的活菌+死菌,未加EMA的活菌+生理盐水三组菌的Ct值,研究EMA-qPCR法对死/活沙门菌的区分能力。结果 EMA浓度低于50 μg/mL,EMA处理活菌组与EMA未处理活菌组的Ct值差异无统计学意义。综合考虑,EMA最优使用浓度为10 μg/mL。采用10 μg/mL EMA进行预处理,混合菌量为10⁶、10⁵、10⁴、10³ CFU/mL时得出的结果一致：活菌比例为0%,≤50%,>50%时,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+死菌两组Ct值差异（ΔCt）分别为≥5,≥1,<1。同时,除活菌比例0%外,其他活菌浓度下,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+生理盐水两组Ct值无明显差异。结论 菌量为10³~10⁶ CFU/mL时,通过10 μg/mLEMA作用,EMA处理过样品与未加EMA处理样品的ΔCt值≥1,可考虑样品中沙门菌活菌比例≤50%。     

多重降落PCR检测痰标本肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌

目的:建立可同时检测痰标本中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)与b型流感嗜血杆菌(Hae-mophilus influenzae type b,Hib)的多重降落PCR。方法:以Sp cpsA基因、Hib capⅡ区为靶标设计引物,并用Primer-BLAST在线软件检测其特异性,多重降落PCR检测492份痰标本,并以标准菌株作为对照,结果与细菌培养法进行比较。结果:所建立的多重降落PCR对Sp、Hib的检测下限分别达6.3 pg、0.2 pg;与细菌培养法相比,灵敏度及总灵敏度均达100%,检测Sp、Hib特异性分别为94%、98%,总特异性达92%。结论:所建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可作为Sp、Hib感染的快速诊断与流行病学研究的备选手段。     

应用量子点及磁微粒技术快速检测阴道毛滴虫抗原

目的 以阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis,Tv)检测为切入点,构建以量子点和磁微粒技术为基础的夹心法快速检测抗原技术,为同步多项抗原检测作准备.方法 针对Tv特异性黏附蛋白AP33制备其抗体,以碳二亚胺交联法,分别连接抗体.量子点及抗体-磁微粒加入待测抗原AP33结合后,在荧光显微镜下观测结果.结果 确立了本检测系统的最优条件,对AP33的检测与儿种阴道常见病原菌无交叉反应,检测限为0.05υg/ml.结论 成功构建了量子点磁微粒检测技术,对Tv抗原检测,特异度为90%,准确率为88%.     

双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌方法的建立

目的建立双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。方法在Gen Bank数据库查找序列并比对后设计tdh和vvh A基因引物和探针。对PCR反应退火温度、引物、探针、Mg2+、Taq DNA聚合酶及d NTPs浓度进行优化,确定反应体系和反应条件,并对新建方法的特异性、灵敏度等方面进行分析,对模拟样品进行检测。结果建立了双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法。该方法的特异性较好,检测限为103 CFU/ml。结论建立的双重荧光PCR方法可快速、灵敏、特异地检测副溶血性弧菌和创伤弧菌。     

实时定量PCR检测BK病毒时尿样本的优化处理

目的建立简便有效的样本处理方法,提高实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量的敏感性和准确性。方法任意选择24例BK病毒阳性样本,每一样本进行4种不同的处理:原尿、原尿病毒DNA提纯、1:10稀释尿液、1:100稀释尿液,实时荧光定量PCR法检测各组样本BK病毒载量,所测数据用SPSS11.0进行统计学分析。结果4种不同的处理方法对实时荧光定量PCR法检测尿液中BK病毒载量有明显的影响:原尿阴性3例,病毒载量在4组中的最低值占66.7%;1:100稀释尿阴性2例,病毒载量在4组中的最高值占79.2%,但中位值和1:10稀释组差异无统计学意义;DNA纯化组与1:10稀释尿液病毒检出率相当,均为100%,但DNA纯化组目标基因的流失量较明显。结论在临床尿液中BK病毒载量检测时,1:10稀释尿在实时荧光定量PCR检测BK病毒时DNA损失小,效率高,且处理过程简便、成本低,是一种较好的尿样本处理方法。     

双荧光标记法定量检测Igf-2r在克隆牛组织中的表达

 的建立克隆牛Igf-2r mRNA实时定量PCR的检测方法,并探讨Igf-2r mRNA的表达在克隆牛发育中的作用。方法用Trizol抽提正常及克隆牛的脑、肺、心、肝组织RNA,运用本研究建立的实时荧光定量PCR方法检测各组织中Igf-2r mRNA的表达情况。结果正常牛各组织中每μg总RNA中含Igf-2r mRNA拷贝数分别为107.39（脑）、108.04（肺）、107.25（心）、107.99（肝）。克隆牛中,每μg 总RNA中含Igf-2r mRNA表达水平变化较大。结论与正常牛相比,克隆牛不同组织中Igf-2r mRNA的表达水平变化较大,在同一克隆牛的不同组织以及不同克隆牛的同一组织中Igf-2r mRNA的表达水平相差较大,提示在克隆牛不同组织中Igf-2r mRNA的表达水平不一。Igf-2r mRNA的表达水平与动物的生长发育有一定的关系,Igf-2r基因的表达异常可能与胎儿过度肥大和围产期死亡等现象的有一定的关系。对克隆牛各组织中Igf-2r mRNA的表达的精确定量有助于进一步研究Igf-2r基因在动物生长发育中所起的作用。     

实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中的应用效果评价

【目的】探讨应用实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中应用效果。【方法】分别应用细菌培养法,PCR检测法,实时荧光定量PCR方法对987例群体食源性食物中毒腹泻患者和疑似患者的粪便或呕吐物2084份样品进行食源性病原体检测。【结果】检测2084个感染性腹泻标本,细菌培养法阳性检出率45.2%,普通PCR检测法阳性检出率63.4%;采用实时荧光PCR技术阳性检出率90.1%。实时荧光定量PCR检测法阳性检出率显著高于细菌培养检测法和普通PCR检测法,相比较均有显著性差异（P〈0.05）。【结论】实时定量荧光定量PCR技术准确、快速、简便、特异性强,在食源性细菌检测中,能为突发食源性食物中毒事件提供更早的控制措施并争取时间。     

纳米磁分离实时荧光RT-PCR检测食管鳞状细胞癌患者血清miR-21表达的价值?

目的：建立食管鳞状细胞癌( ESCC)患者血清中miR-21纳米磁分离( MS)实时荧光RT-PCR检测方法,观察ESCC患者血清miR-21的表达。方法分别采用Trizol法和MS法提取60例ESCC患者及60例健康体检者血清总RNA,采用实时荧光RT-PCR检测miR-21的表达。利用Bland-Altman法检验Trizol法与MS法提取的血清中miR-21表达量的一致性,利用ROC曲线评价MS法提取的miR-21表达量筛查ESCC的效能。结果 MS法能够提取血清中miR-21,其灵敏度与Trizol方法相当,Bland-Altman法检验结果显示两种方法提取的miR-21表达量具有很好的一致性。 ESCC患者miR-21表达量明显高于健康体检者( P<0．05)。 ROC曲线下面积为0．878,最佳临界值为1．115,此时敏感度为85．00%,特异度为81．67%。 ESCC患者血清miR-21的表达与TNM分期以及淋巴结转移情况相关( P<0．05)。结论 MS实时荧光RT-PCR在血清miRNA检测中有着很大的应用价值,血清miR-21的表达水平有可能作为食管癌诊断一个新的分子生物学指标。