酶消化法分离培养大鼠血管平滑肌细胞方法的改良

目的 改良酶消化法并建立一种简单方便且高效的血管平滑肌细胞原代培养方法.方法 在无菌条件下分离大鼠胸主动脉,0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞并进行培养.用倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学特性,用免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白(α-actin)的表达.结果 相差显微镜下细胞早现"谷和峰"的生长特...     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞胶原酶解法培养与鉴定

目的 探讨复合胶原酶解离大鼠胸主动脉的原代细胞培养方法 及其生长特性.方法 0.2%Ⅰ型胶原酶和0.2%Ⅱ型胶原酶解离大鼠胸主动脉平滑肌,用相差显微镜观察其生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞的纯度.结果 24h内细胞贴壁生长,1周左右细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长,第3代细胞用α-actin染色鉴定平滑肌细胞,其纯度为96%.结论 复合胶原酶解离法原代细胞培养是一种简单、周期短、纯化速度快的方法 ;可作为一种可靠的细胞模型.     

酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞

目的采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞,为血管疾病的研究提供大量的原代平滑肌细胞。方法无菌取老龄SD大鼠主动脉,采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞,自然纯化及差速贴壁纯化血管平滑肌细胞,免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。结果免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。结论酶消化法用于血管平滑肌细胞的培养有利于获得大量的高纯度细胞供实验研究。     

环匹阿尼酸对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响

目的研究环匹阿尼酸(CPA)对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及可能机制。方法原代培养大鼠远端PVSMC,并通过形态学和免疫荧光染色鉴定,利用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测高钾(60 mmol/L KCl)溶液及CPA对PVSMC的[Ca2+]i影响。结果原代培养的PVSMC表现出典型血管平滑肌细胞生长特征,并对平滑肌α-actin免疫荧光染色呈阳性反应;高钾溶液使PVSMC的[Ca2+]i显著升高,5μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应;10μmol/LCPA能使含5μmol/L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后,10μmol/L CPA能使含5μmol/L硝苯地平的Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i迅速升高。结论 CPA能够使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与Ca2+从肌浆网释放,并诱发细胞外Ca2+通过钙池操纵性钙通道(SOCC)内流有关。     

人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较

目的寻求简单有效的人妊娠子宫平滑肌细胞原代培养方法,建立稳定、高纯度、高产量的子宫平滑肌细胞原代培养体外模型。方法利用20例妊娠子宫组织,分别使用组织块法和胶原酶消化法分离及纯化人子宫平滑肌细胞,通过免疫荧光方法检测平滑肌细胞的肌动蛋白(α-SMA)及钙调节蛋白(calponin)的表达。结果组织块法和胶原酶消化法培养的平滑肌细胞均呈梭型,峰谷样生长,α-SMA及calponin的免疫荧光化学检测结果为阳性,胶原酶消化法较组织块培养法稳定且缩短原代培养时间。结论胶原酶法简便,快速,稳定,可建立稳定、高纯度的子宫平滑肌细胞体外培养体系。     

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法,评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。     

改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞

目的：改进大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCS）的培养方法,了解其生长特性,为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树,去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后,采用改良组织贴块法培养ASMCS,应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d,细胞开始从组织块周围长出,5～8 d在组织块附近出现＂谷-峰＂结构,9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点,为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。     

组织块消化法原代培养大鼠输精管平滑肌细胞及鉴定

目的 建立一种稳定高效、存活率高的大鼠输精管平滑肌细胞体外分离及培养方法,为相关研究提供理想的细胞模型。方法 采用组织块消化法对大鼠离体输精管平滑肌细胞进行原代培养。采用形态学观察、HE染色、抗α-SMA免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定,台盼蓝染色计算细胞存活率及细胞总数,胰酶消化传代并绘制生长曲线。结果 对照实验表明胶原酶Ⅱ消化效果优于胶原酶Ⅰ,最佳消化时间为60min,同时控制吹打次数、沉淀时间及培养环境,获得了理想的平滑肌细胞总数及存活率。平滑肌细胞呈典型的梭形、长条形,可传代,且出现平滑肌细胞培养典型的“峰-谷”状特征,生长曲线为“S”型。经抗α-SMA免疫荧光鉴定,培养细胞为平滑肌细胞,纯度为(92.6±4.3)%。结论 采用组织块消化法成功建立了大鼠输精管平滑肌细胞的体外分离及培养方法。     

酶消化法急性分离大鼠主动脉平滑肌细胞及其鉴定

目的 探讨采用酶消化法快速分离SD大鼠胸、腹主动脉平滑肌细胞的方法,为膜片钳实验提供大量原代平滑肌细胞.方法 取SD大鼠胸、腹主动脉,用酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶等)、酶液Ⅱ(胶原酶和透明质酸酶等)酶解分离平滑肌细胞,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别选取10、15、20、25、30 min,并两两组合以确定最佳消化时间.分离的细胞经台盼蓝染色测定其活性并通过平滑肌特异性α-肌动蛋白(α-actin)免疫组化染色鉴定.结果 分离的平滑肌细胞在倒置显微镜下计数,酶液Ⅰ、Ⅱ的消化时间分别在30、15 min时平滑肌细胞数量最多为(18.3 1.5)个/低倍视野,与其他各时间点组合相比,差异有统计学意义(P＜0.05).镜下观察典型的平滑肌细胞呈长梭形,细胞膜完整,边缘光滑;台盼蓝染色,90%以上的细胞为活细胞;免疫组化染色鉴定为平滑肌细胞.结论 酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单、成本低,采用本法可获得较大量的平滑肌细胞供实验使用.     

酶消化法分离培养原代肺动脉平滑肌细胞及免疫组化鉴定

目的建立体外胶原酶消化法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)及免疫鉴定的方法。方法采用I型胶原酶对PASMCs进行体外培养。在无菌环境下,分离提取雄性Sprague Dawley(SD)大鼠肺动脉主干,剥离外膜、剔除内皮细胞,经酶消化法,体外培养PASMCs。倒置相差显微镜观察PASMCs生长状态及特点;台盼兰测定细胞活力;免疫细胞染色法进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SM actin)鉴定。结果酶消化法分离培养的PASMCs 3 d后,可见细胞贴壁呈梭形生长,6 d后生长迅速呈典型的峰-谷状生长,9 d后达90%融合。通过形态学观察及免疫荧光染色法鉴定表明:培养的细胞为PASMCs;细胞存活率为98.5%;原代培养8~10 d后即可传代,3-10代细胞生长迅速、细胞形态不易发生改变,可用于进行细胞实验。结论采用I型胶原酶消化法简单易行、可靠、PASMCs生长迅速、传代周期短的特点;尤为重要的是,培养的原代PASMCs可用于肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

β_2受体下调细胞模型的构建研究

目的：通过沙丁胺醇刺激的方法构建细胞水平β2肾上腺素能受体（β2AR）下调的模型,为研究β2AR下调的分子生物学机制奠定基础。方法：取正常Balb/c小鼠气道平滑肌细胞（ASMC）进行原代培养（组织贴块法）,第2～5代细胞经形态学及间接免疫荧光法进行鉴定,将第3～4代纯度在95%以上的ASMC随机分为2组：正常ASMC对照组和沙丁胺醇刺激组。采用RT-PCR和Western Blot分别检测对照组和沙丁胺醇刺激组β2AR mRNA及蛋白水平的表达。结果：（1）原代培养的ASMC呈典型的＂峰谷＂状生长,细胞浆内有与细胞纵轴平行的特异性平滑肌α-肌动蛋白丝的阳性表达,证实了平滑肌细胞的来源,并符合平滑肌细胞的形态学和生物学特性;（2）沙丁胺醇刺激组β2AR mRNA的表达较对照组降低（P〈0.05）,β2AR蛋白表达亦明显降低（P〈0.05）。结论：成功构建了小鼠气道平滑肌β2AR下调的细胞模型,为进一步研究哮喘患者β2AR减敏的机制奠定了良好的基础。     

酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞

目的建立一种适用于体外有效分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞的技术方法。方法分离主动脉,用优化的酶联合消化法获取主动脉平滑肌细胞,用形态学法、免疫细胞化学法鉴定。结果该方法所分离的主动脉平滑肌细胞生长旺盛,细胞活性好,7～9d后细胞总量可达到5×105个/瓶,细胞纯度可达85%以上,细胞呈长梭形、放射状、束状生长,平行排列呈峰谷状,免疫荧光显示胞浆内α-SMA蛋白表达阳性。结论该酶联合消化法可在体外短时间内获取数量可观、高纯度的主动脉平滑肌细胞。     

血管内皮和平滑肌细胞联合培养构建组织工程化血管的方法

目的：探讨组织工程血管种子细胞原代培养、传代扩增、鉴定的方法，为组织工程血管的构建提供理想的种子细胞。方法：无菌条件下取正常产妇分娩的脐带动静脉，ROSS法（即组织贴块法）原代培养混合血管细胞。倒置相差显微镜、免疫组化法对细胞进行鉴定。结果：倒置显微镜显示原代细胞及经传代培养后的细胞，呈现内皮样细胞、平滑肌样细胞混合生长的特征。免疫组化法检测示内皮细胞Ⅷ因子、平滑肌细胞α-肌动蛋白呈阳性反应。细胞经3次～5次传代，数量可增殖达到8×10^6—10×10^6。结论：使用组织贴块法原代培养可获得内皮细胞、平滑肌细胞混合体，细胞经体外联合培养、传代可以达到组织工程血管种子细胞所需的数量。     

RhoA/ROCK信号系统对血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和表型变化的影响

 目的 探讨RhoA/ROCK信号系统在血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖和表型变化中的作用机制。 方法 将20只Wistar大鼠按随机数字表法均分为模型组（用硅胶管包裹大鼠颈动脉1周,造成血管外膜的慢性炎性损伤）和对照组,取材后HE染色,分别观察2组血管形态学变化,采用RT-PCR和Western blot检测血管组织中SM α-actin 与ROCK2的表达。 结果 与对照组相比,模型组颈动脉血管外膜增厚,炎性细胞浸润,中膜平滑肌细胞增生,排列紊乱,VSMC中SM α-actin mRNA水平和蛋白表达水平均增高,ROCK2 mRNA水平与对照组相比无显著差异,蛋白表达水平均明显增高。 结论 RhoA/ROCK信号系统可能参与血管外膜炎症介导的大鼠颈动脉VSMC增殖和表型变化的调控。     

一种改良成人肺动脉平滑肌细胞的培养方法

目的：探讨成人肺动脉平滑肌细胞（pulmonaryarterialsmoothmusclecells,PASMCs）体外培养及培养效率的方法。方法：在无菌条件下,取3ctn左右肺动脉,去除内膜后,剪成1mm×1mm大小的组织块,贴块法培养,在高糖DMEM／F121：1培养基中加入血小板衍生长因子（PDGF）10／g／L培养hPASMCs,采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光法鉴定a一平滑肌肌动蛋白（smoothmuscle—Ct—actin,SM—a—actin）和钙调蛋白calponin。结果：采用改良组织块培养,克服了hPASMCs体外培养休眠期过长的缺点,稳定获得纯度达98％以上,细胞呈长梭型,生长致密时排列成相互平行的束状,未见明显异形的细胞,SM-0t-actin和calponin阳性。结论：该改良方法能成功分离和培养出纯度较高的成人肺动脉平滑肌细胞,且重复性好,细胞常量大,简便而有效。     

组织块重复贴壁使用在原代细胞培养中的实验意义

目的旨在提高采用人脐静脉组织块贴壁法进行平滑肌细胞原代培养组织块的重复利用率,进而缩短采用细胞培养进行实验的培养周期。方法以改良人脐静脉平滑肌细胞贴壁培养法为基础,当原代培养细胞(对照组)进行第1次细胞传代后,将培养组织块再次接种于新培养瓶中继续培养(实验组),分别记录两组细胞爬出时间、第1次传代时间、以及第1次传代后24、48、72、96h的细胞计数,通过倒置显微镜对两组细胞进行形态学观察,采用抗α-actin免疫细胞化学方法,对两组传代细胞的类型和性质进行鉴定。结果与对照组比较,实验组细胞爬出时间及第1次传代时间均明显缩短(P<0.05);两组第1次传代后24、48、72、96h细胞计数差异均无统计学意义(P>0.05);两组细胞形态经α-actin鉴定差异无统计学意义。结论人脐静脉组织块重复贴壁培养后,经传代其细胞数量、细胞形态与原代组织块贴壁培养的细胞差别均无统计学意义。     

骨髓问充质干细胞体外培养表达平滑肌肌动蛋白的实验研究

目的观察骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,自身表达平滑肌肌动蛋白（smooth muscle alpha-actin,α-actinSM）情况。方法采用直接贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,传代培养至第4代时,对间充质干细胞进行鉴定。利用抗α-actin SM荧光抗体,检测间充质干细胞胞质内α-actin SM表达,计算其阳性率。结果骨髓间充质干细胞在无诱导因素干预下,其自身即可表达平滑肌早期特异性标志α-actin SM,阳性率高达44.1%。结论骨髓间充质干细胞体外培养时,无需诱导因素干预,能够自发向平滑肌细胞方向分化。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

低氧对大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞功能的影响

目的培养鉴定大鼠不同级别肺动脉平滑肌细胞（ pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs）,探讨其对缺氧刺激反应性的不同。方法酶消化法分离大鼠不同级别PASMCs并分为3组：大肺动脉组,包括肺动脉干及肺内一级主干;中动脉组,包括肺内主干的第二级和第三级分支;小肺动脉组,包括肺内主干四级分支后的更细小分支。分别给予常氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、21%O2、37益）和低氧（ DMEM＋2%FBS、5%CO2、3%O2、37益）培养48 h,用四甲基偶氮唑盐（ methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）比色法和Western blotting检测增生细胞核抗原（ proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的蛋白表达水平的方法检测细胞的增生能力;应用伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。结果倒置显微镜下PASMCs呈现长梭形,免疫荧光法检测平滑肌细胞标志物即平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）为阳性,生理情况下（常氧）,3组肺动脉平滑肌细胞增生及迁移能力均较一致;低氧培养48 h后,中小肺动脉平滑肌细胞的增生与迁移能力均显著高于大动脉,PCNA结果与MTT结果一致,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论在低氧条件刺激下,不同级别肺动脉平滑肌细胞反应性不同,中小肺动脉平滑肌细胞的增生及迁移能力均显著高于大肺动脉平滑肌细胞。