荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

深圳市龙岗区群体性发热流感样病例检测结果分析

目的：对2005年1月至12月深圳市龙岗区流感样疫情进行病原学分析和流行病学调查并进行检测方法比较。方法：对群体性发热的14起病例107份鼻咽拭子和85份血清标本，采用荧光定量RT—PCR方法、Influenza A／B IgM ELISA、胶体金法、鸡胚分离培养方法和血凝抑制试验进行病原学和血清学检测。结果：14起107份标本中荧光定量RT—PCR检测10起45份阳性，阳性率为42％（45／107）；10起85份血清标本中，A型流感IgM7起17份阳性，阳性率20％（17／85）；对2起30份标本采用胶体金法检测1起3份阳性，阳性率10％（3／30）。鸡胚培养12起77份标本中，3起3份阳性，阳性率3．9％（3／77），其中，2起分离出H1N1流感病毒株，1起分离出流感病毒H3N2亚型病毒株。暴发时间分布情况集中在3～5月份，其中5月份的4起疫情中，3宗分离出流感病毒株。结论：3～5月份是深圳市龙岗区流感暴发流行的高峰期，以A型流感为主，其次为B型流感。采用荧光定量RT—PCR方法检测流感病毒，特异性强，灵敏度高，能在3～4h内得结果，可作为快速的流感病毒检测诊断方法，有效控制疫情。     

乙型流行性感冒病毒的基因快速检测

〔目的〕建立乙型流行性感冒病毒的核酸快速诊断技术。〔方法〕采用RT -PCR方法对乙型流感病毒的HA基因进行检测 ,我们对乙型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物 ,进行扩增 ,并作了特异性与灵敏度比较。〔结果〕该引物只能扩增乙型流感病毒的特异性片段 ,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、腮腺炎病毒无交叉反应。检测的灵敏度一次PCR可达 1TCID50 ,二次PCR反应可达 0 .1TCID50 。〔结论〕采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率 ,比采用MDCK细胞分离的阳性率更高 ,可达到迅速、正确地诊断乙型流感的实用目的。     

荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究

目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法。方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较。结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

甲3型流行性感冒病毒基因的快速检测

为建立流行性感冒(流感)的快速诊断技术,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测甲3型流感病毒的血凝素(HA)基因.对甲3型流感病毒的HA基因保守区域设计相关引物并进行PCR扩增,比较了它的特异性与灵敏度.结果显示该引物只能扩增甲3型流感病毒的特异性片段,而对其它型别的流感病毒以及麻疹、风疹、流行性腮腺炎病毒无交叉反应.检测的灵敏度1次PCR可达10TCID50/50ml以下,2次PCR反应可达0.1TCID50/50ml以下.采用该方法从临床患者含漱液标本中的检出率,比采用狗肾传代细胞(MDCK)分离病毒的阳性率更高,可达到迅速、正确诊断甲3型流感的实用目的.     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测副流感3型病毒

目的:建立特异、快速、灵敏的荧光定量RT-PCR方法用于副流感3型病毒核酸检测。方法:对副流感3型病毒的N基因应用C lustalW软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqM an-MGB探针,并对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,敏感性和稳定性,同时应用于疑似患者临床标本检测。结果:该方法对副流感3型病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、4型,甲型、乙型流感病毒,麻疹病毒,风疹病毒,腮腺炎病毒,呼吸道合胞病毒和腺病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似患者含漱液标本中直接检出,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:本研究建立的TaqM an荧光定量RT-PCR是一种快速检测副流感3型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

多重荧光逆转录PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

目的建立多重荧光逆转录PCR（RT-PCR）同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法。方法在肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型VP1基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化多重荧光RT-PCR反应体系,评价所建多重荧光RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于临床样品检测。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测具有高度特异性,检出限分别为0.1 TCID50和1 TCID50,具有较好的稳定性,可直接应用于临床样品的检测。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR可以同时准确检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的新方法。     

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立Taqman MGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用Taqman MGB技术,根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列,设计登革1~4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针,以登革热毒株作为标准,以乙脑毒株作对照,建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本,2份阳性,阳性率为25%。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0.17pg/μl,病毒液灵敏度为10-5TCID50,与乙脑病毒无交叉反应,检测8份临床血清标本,5份阳性,阳性率为62.5%。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强,可作为登革病毒的快速检测方法,应用于登革热的临床早期诊断。     

荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸

目的：采用荧光定量一聚合酶链反应（FQ-PCR）法，检测麻疹病毒核酸，用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法：TaqMan特异性荧光标记探针法，进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果：FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性，本次试验检测灵敏度达0．1TCID砷。在14份麻疹患者咽拭子标本中，有13份标本检出麻疹病毒核酸，从核酸提取至完成检测仅需3h。结论：FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。