两种PCR方法检测感染家兔血液中弓形虫DNA的动态比较

目的:对比两种方法检测感染家兔血液中弓形虫基因动态检测结果。方法:用RH株弓形虫感染雄性家兔16只,在感染前后耳缘静脉采集血液标本。用荧光定量PCR(Fluorescence Quantitiative PCR,FQ-PCR)和普通PCR分别检测血液标本中虫体DNA基因片段。结果:FQ-PCR检测,其总阳性率为64.42%。感染家兔血液中虫体密度高峰期在感染后1～3 wk左右,其后长期维持在较低水平;普通PCR检测感染家兔总阳性率为45%。感染后第1wk检出率仅22%,高峰期维持在感染后2～4 wk,检出率约为60%左右。其后检出率下降为25%左右并一直维持。结论:两种PCR检测方法有相同的动态检出效果,采用血液作为样品进行弓形虫PCR检测时其最佳检测时间为感染后1～4 wk,其后检出率逐渐下降。     

PCR对弓形虫感染家兔血液中虫体DNA的动态检测

目的了解弓形虫感染家兔血液中是否有虫体存在,探明虫体在血液中动态变化情况。方法用不同剂量的RH株弓形虫速殖子经腹腔感染家兔6只。在家兔感染前后分别采集血液,抗凝处理后,-40℃冻存备用,用普通PCR检测弓形虫感染家兔血液中弓形虫DNA。结果5只家兔在感染后的6~14d死亡,仅1只家兔在感染后的6~72d,用PCR检测手段在血液中均可检测到弓形虫DNA。结论弓形虫感染雄兔血液中有虫体存在。     

实验动物弓形虫SPA—ELISA检测方法的初步建立

建立用于实验动物弓形虫感染检测的敏感、稳定、特异的 PCR检测体系 ,用 B1基因设计引物 ,建立普通PCR,用 P30基因设计引物 ,建立巢式 PCR;用两种方法检测实验感染弓型虫小鼠血液和腹腔中的 DNA动态变化 ;用巢式 PCR检测自然状态下的豚鼠感染率。结果 ,巢式 PCR可检测到 0 .0 1pg DNA含量 ,比普通PCR敏感 10 0倍 ,且特异性强 ,对其他微生物 DNA无交叉现象 ,稳定性好 ,对同一样品重复检测三次 ,阴、阳性结果一致。小鼠感染弓形虫 2 d后 ,巢式 PCR腹水阳性率为 10 0 % ,血液阳性率为 33.3% ;感染阳性率为 6 6 .7% ;感染 4 d后 ,…     

弓形虫感染家兔精液中果糖含量的动态变化

目的动态观察弓形虫感染家兔精液中果糖变化。方法RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前和感染后的1~13周分别采集精液,-40℃冻存备用。采用间苯二酚法检测家兔精液中果糖含量,绘制感染前后精液中果糖含量动态曲线图。结果弓形虫感染家兔精液中果糖含量在感染后逐渐下降,7周左右降到最低峰值,此后果糖含量逐渐恢复并在感染后第8周至第13周维持较低水平,此值低于感染前果糖含量。结论弓形虫感染可影响家兔精囊腺功能。     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

甘肃省会宁县兔弓形虫感染分子流行病学调查

目的了解甘肃省会宁县兔弓形虫的感染情况。方法酚试剂方法提取家兔血液中总DNA,将弓形虫529 bp多拷贝片段基因作为待检弓形虫序列,通过单管一步法巢式PCR技术检测兔弓形虫感染情况。结果共检测117份兔血液样本,弓形虫阳性13份,阳性率为11.11%(13/117)。散养兔(在兔圈中散养)阳性率为11.63%(5/43),笼养兔(单只笼养)阳性率为10.81%(8/74),差异无统计学意义(P0.05);雌兔阳性率为8.70%(6/69),雄兔阳性率为14.58%(7/48),差异无统计学意义(P0.05);獭兔阳性率为11.39%(9/79),长耳兔阳性率为10.35%(4/38),差异无统计学意义(P0.05)。结论甘肃省会宁县农村兔弓形虫感染较为普遍,其感染率与兔的饲养方式、雌雄以及品种无关。     

弓形虫感染对大鼠、小鼠血清一氧化氮水平的影响

目的测定正常大鼠、地塞米松处理大鼠以及小鼠感染弓形虫前后的血清一氧化氮水平,探讨弓形虫感染对其血清一氧化氮水平的影响。方法将36只雌性SD大鼠分为6组,每组6只。Ⅰ组:正常对照组;Ⅱ组:弓形虫感染组;Ⅲ组:地塞米松2mg/kg体重,隔天皮下注射2周后停止注射;Ⅳ组:地塞米松2mg/kg体重,隔天皮下注射2周后感染弓形虫,并停止注射地塞米松;Ⅴ组:实验期间,地塞米松2mg/kg体重,隔天皮下注射;Ⅵ组:地塞米松2mg/kg体重,隔天皮下注射2周后感染弓形虫,继续注射地塞米松。每周采集实验大鼠血液并分离血清。第6周时处死大鼠,收集血清,将弓形虫感染鼠的脑组织匀浆转种小鼠,并以脑组织为模板PCR扩增弓形虫SAG1基因。雌性昆明小鼠36只,于感染弓形虫后0,1,2,3,4,5d时每天处死6只,收集血清。硝酸根还原酶法测定大鼠、小鼠血清一氧化氮浓度。结果正常组大鼠6周平均一氧化氮浓度为(29.30±2.77)μmol/L;地塞米松注射2周后,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组大鼠血清一氧化氮水平分别为(13.24±2.30)μmol/L、(13.33±2.41)μmol/L、(14.98±1.71)μmol/L、(14.55±2.99)μmol/L;Ⅱ组大鼠感染弓形虫后,血清一氧化氮第3周时升至(76.79±6.93)μmol/L,而后持续下降,至第6周时为(52.34±4.50)μmol/L;Ⅲ组大鼠停止注射地塞米松后血清一氧化氮水平逐渐上升,至第4周时为(26.32±2.93)μmol/L,其后维持在正常水平;Ⅳ组大鼠感染弓形虫后第3周时其一氧化氮水平升至(36.19±7.42)μmol/L,然后继续上升,至第5周时达最高至(63.60±16.32)μmol/L,然后下降;Ⅴ组大鼠的一氧化氮浓度则维持在从(13.96±2.50)μmol/L到(14.98±1.71)μmol/L之间的较低水平;Ⅵ组大鼠感染弓形虫后血清一氧化氮水平缓慢上升,至第5周时升至最高,为(58.89±21.70)μmol/L,然后下降。采用PCR的方法从Ⅳ组中的1只大鼠的脑组织扩增出SAG1片段,Ⅵ组有2只大鼠的脑组织扩增出SAG1片段,并且其脑组织匀浆转种小鼠后回复分离出弓形虫速殖子;PCR阳性的3只大鼠血清一氧化氮浓度在实验期间均维持在较低水平。小鼠感染弓形虫前一氧化氮水平为(27.47±4.41)μmol/L,感染后1d其血清一氧化氮水平有所降低,为(19.29±3.07)μmol/L,然后快速升高,至感染后5d达最高峰(114.51±8.19)μmol/L,此时小鼠处于频死状态。结论地塞米松可降低大鼠血清一氧化氮水平,弓形虫感染可升高大鼠血清一氧化氮水平;注射地塞米松或未注射地塞米松的大鼠感染弓形虫后其血清一氧化氮水平都有升高,但升高的幅度与速度有所不同,未注射地塞米松的大鼠升高的速度更快、幅度更高。小鼠感染弓形虫后血清一氧化氮水平先降低而后升高,但不能防止小鼠因急性感染而死亡。     

孕妇弓形虫感染的调查

目的了解孕产妇弓形虫感染状况。方法用ELISA检测弓形虫IgG、IgM抗体和PCR检测弓形虫DNA（TOX-DNA）,对1 400例孕产妇血液进行弓形虫感染检测。结果孕产妇弓形虫感染率12.5%。结论孕产妇弓形虫感染的发生率较高,应引起重视。     

SAG2基因片段的体外扩增及在孕妇弓形虫感染诊断中的应用

目的：根据弓形虫表面抗原SAG2基因序列，设计弓形虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行弓形虫感染的检测。结果：从弓形虫DNA提取物中扩增出593bp的基因片段，与预期的扩增片段大小相符;与弓形虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、间日疟原虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；该检测体系至少可检测出相当于每μl血样中2个弓形虫的水平；将该检测体系用于临床孕妇产前诊断，56份标本中检查出3例。结论：所建立弓形虫PCR检测体系灵敏、特异，适用于孕妇弓形虫感染的诊断。     

弓形虫乙肝病毒多重PCR及芯片杂交技术的研究

目的 建立同时检测弓形虫和乙肝DNA的多重PCR和芯片杂交检测方法，为孕产妇TORCH检测的进一步研究提供实验依据。方法以病人血液及弓形虫RH腹水为样本，多重PCR方法为基础，通过基因片段筛选及引物比例调整，进行弓形虫和乙肝病毒基因片段的扩增。然后进一步建立生物芯片检测法以排除PCR假阳性。结果在确定合适的多重PCR引物比例后，扩增结果清晰可辨。在PCR体系中加入Norwalk扩增监控进一步证实了扩增结果的可靠性。芯片与PCR产物杂交的结果具有较好的灵敏性和特异性。结论 建立的针对弓形虫和乙型肝炎病毒检测的多重PCR和芯片杂交方法是有效的，芯片杂交可用于对PCR检测结果的进一步确认。     

弓形虫表面抗原SAG2重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希氏菌（E．coli）中表达弓形虫表面抗原2（SAG2）,纯化制备重组蛋白rSAG2。方法采用聚合酶链反应（PCR）技术从弓形虫基因组中扩增出SAG2编码基因片段,以pMD-18T质粒作TA克隆,序列测定后亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,并转化E．coliJMl09感受态菌,IPTG诱导表达rSAG2蛋白,重组rSAG2蛋白采用B—PER谷胱甘肽巯基转移酶（GsT）融合蛋白纯化试剂盒纯化并进行SDS—PAGE与免疫印迹（Western—blot）鉴定。结果SAG2编码基因扩增片段大小为469bp;测序结果显示,克隆的SAG2基因序列与GenBank中弓形虫RH株的同源序列（序列号GI：161925）完全一致;所诱导表达的含GST的融合rSAG2蛋白大小约43kDa,纯化后的rSAG2经SDS—PAGE电泳显示一条纯化条带;蛋白免疫印迹结果显示rSAG2能够被兔弓形虫感染血清所识别。结论在大肠埃希氏菌中融合表达了弓形虫SAG2重组蛋白,纯化的rSAG2蛋白具有一定的免疫活性。     

FQ—PCR法与IBT法在人巨细胞病毒检测中的价值比较

目的对荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）方法与免疫印迹法（IBT）检测人巨细胞病毒进行比较分析。方法分别应用FQ—PCR和IBT检测疑似人巨细胞病毒（HCMV）感染小儿和成人各42例尿HCMVDNA和血清HCMV IgM。结果42例小儿尿HCMVDNA阳性检出率为57．14％,血HCMV IgM阳性检出率为35．71％。前者的诊断阳性率高于后者（χ2=3．88,P〈0．05）,有统计学差异;42例成人尿HCMVDNA阳性检出率为14．29％,血HCMVIsM阳性检出率为71．43％。后者的诊断阳性率显著高于前者（χ2=28,P〈0．005）,有统计学差异;84例患者尿HCMVDNA阳性检出率为38．10％,血HCMVIgM阳性检出率为48．81％。2种方法检测HCMV活动性感染的差异无统计学意义（χ2=1．96,P〉0．1）。结论FQ—PCR检测HCMVDNA是早期诊断小儿HCMV感染的有效的方法;免疫印迹法检测血清HCMV IgM水平对于判断成人HCMV活动性感染具有一定意义;做人群HCMV普查时,免疫印迹法有较好的应用价值。     

肾移植受者并发巨细胞病毒感染的临床实验研究

目的 :探讨肾移植受者并发巨细胞病毒 (Cytomegalovirus ,CMV)感染后实验指标的变化及各指标的相关性 ,为诊断CMV感染及预防CMV病发作提供依据。方法 :运用Real TimePCR及流式细胞分析法等技术对肾移植受者的标本进行检测。结果 :(1)肾移植术后 14周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 73 5 %、79 4 %及85 3% ;肾移植术后 18周内 ,尿液、血浆及白细胞中CMV DNA阳性检出率分别为 82 1%、85 7%及 85 7% ;(2 )肾移植术后 8周内 ,血浆及白细胞中CMV DNA的载量随术后时间的延长而增加 ;尿液中CMV DNA的载量在术后 12周内随时间的延长而波动性增加 ;(3)尿液、血浆及白细胞内CMV DNA检出率的峰值分别出现在肾移植术后第 12周、第 8周内及第 8周时 ;(4 )肾移植术后第 8周时 ,尿液中CMV DNA载量与CD3 T淋巴细胞 (P =0 0 0 2 0 )、CD4 T淋巴细胞 (P=0 0 0 19)、CD5 6 T淋巴细胞 (P =0 0 2 35 )及血清肌酐 (P =0 0 2 5 3)的相关性具有统计学意义 ,而与CD8 T淋巴细胞、丙氨酸转移酶、谷草转氨酶、血清尿素氮等的相关性无统计学意义 (P >0 0 5 ) ;血浆及白细胞中CMV DNA载量均只与丙氨酸转移酶的相关性有统计学意义 (P <0 0 0 1) ;结论 :(1)Real TimePCR是监测肾移植受者CMV感染进程的     

三峡库区兴山县艾滋病监测分析

目的了解兴山县艾滋病(AIDS)的流行现状,预测其流行趋势。方法收集2004-2009年高危人群监测、自愿咨询检测(VCT)及专题调查等资料进行统计分析。结果共监测高危人群22098人次,发现HIV阳性10例,阳性率为0.5%,其中既往有偿献血(单采血浆)阳性8例(含VCT咨询HIV阳性4例),阳性率为12.90%(8/62),孕妇阳性2例,阳性率为0.025%(2/7899),其它人群监测均为阴性;VCT咨询检测1311人次,性病334例,患病率为25.48%;检测专供献血员43人,未发现HIV阳性;调查20～65岁人群101865人,未发现供献血人员。结论通过加强有偿献血管理后,艾滋病防治工作的重点是加强性传播性疾病的监测和管理。     

定量PCR检测CMV在异基因造血干细胞移植中的临床意义

目的通过监测造血干细胞移植后患者的外周血CMV DNA含量,探讨对患者进行抗病毒治疗的有效性。方法采用实时定量PCR方法对接受异基因造血干细胞移植（Allogeneic HCT）患者进行外周血CMV DNA定期检测。可评价患者57例,其中男38例,女19例,年龄13-59岁（中位年龄31岁）;含急性白血病30例（ALL 11例、AML 19例）,慢粒（CML）11例,淋巴瘤（NHL）8例,骨髓增生异常综合征（MDS）5例,急性重症再障（SAA）3例。在移植后每周检测1次,CMV DNA拷贝数〉102为阳性,连续2次〉103或1次〉1×10^4时行抗病毒治疗。结果57例患者中有32例（56.1%）在病程中检测到CMV DNA阳性,拷贝数1.2×10^2-7.8×10^5,行抗病毒治疗26例,死亡11例,仅1例与CMV感染有关。结论CMV DNA的定期检测可以使患者在病毒血症时及时接受治疗,减少CMV疾病的发生,有利于改善患者的生存。     

恶性肿瘤患者弓形虫感染调查

目的了解延安市恶性肿瘤患者弓形虫感染概况,探讨两者相关性。方法采用酶联免疫吸附实验（ELISA）间接法对120例不同类型的恶性肿瘤患者和80名正常体检者进行ArAb检测。结果研究组病人抗弓形虫抗体（AtAb）免疫吸附实验的阳性率为16．67％（20／120）,与健康对照组AtAb的阳性率6．25％（5／80）比较,两组间差异有统计学意义（X^2=4．76,P〈0．05）。不同系统恶性肿瘤患者ArAb的阳性率略有不同,其中消化系统为18．75％（9／48）,呼吸系统为15．00％（3／20）,生殖系统为16．67％（6／36）,其它系统为12．50％（2／16）,但各系统恶性肿瘤患者AtAb的阳性率比较,无有统计学意5t（X^2=-6．00,P〉0．05）。不同性别恶性肿瘤AtAb的阳性率也不同,其中男性为19．64％（11／56）,女性为14．06％（9／64）,但两者间差异无有统计学意义（X^2=0．67,P〉0．05）。结论免疫功能低下的恶性肿瘤患者容易感染弓形虫或促使潜伏的弓形虫活动,应引起医务人员的足够重视。     

温州地区婴幼儿HCMV感染现状的分析及其临床意义

目的探讨婴幼儿人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）的感染状态与其感染标志物的关系及其临床意义。方法收集我院住院婴幼儿（0～3岁）病例,以化学发光法（chemiluminesence immunoassay,CLIA）定量检测其HCMV—IgM以及HCMV—IgG,以实时荧光定量PCR法（Fluorescence Quantitative PCR,FQ—PCR）检测HCMV-IgM阳性者尿液标本中病毒核酸载量,分析婴幼儿HCMV的感染状态及其临床意义。结果在900例患者中,HCMV—IgM阳性病例为161例（17．9％）,即HCMV现症感染率达到17．9％;HCMV—IgG阳性者738例（82％）,即82％的婴幼儿通过胎盘获得HCMV—IgG抗体,其中148例为HCMV—IgM及HCMV—IgG同时阳性（16．4％）,即16．4％的婴幼儿在从母体获得了HCMV—IgG抗体的基础上感染了HCMV;HCMV—IgM及HCMV—IgG均阴性者为73例,即未获得HCMV感染及免疫力的患者占8．1％。在161例现症感染患者中,有59例检测到HCMV的DNA（36．7％）,即约有一半的现症感染患儿出现了病毒活动性感染。结论虽然绝大部分婴幼儿从母体获得了HCMV—IgG抗体,但由于该抗体缺乏中和病毒的作用以及0～3岁婴幼儿免疫系统的不完善,有超过四分之一（17．9％±8．1％）已经感染HCMV或者将受到HCMV感染的威胁,且活动性HCMV感染主要发生在婴儿组（28d～1岁）。该病毒感染是导致婴幼儿肝功能损害的重要病原体之一,因此加强HCMV的防治具有十分重要的意义,尤其是目前出现了对更昔洛韦等抗病毒药物耐受的病毒突变,开发疫苗将是行之有效的手段。