人CD123稳定表达细胞株的建立与鉴定

目的探索建立人CD123稳定表达细胞株的方法,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产提供材料。方法构建人CD123 CDS区真核表达载体(hCD123 CDS-pEGFP-N1);经脂质体包裹转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-S;经流式分选结合G418筛选,并用流式细胞术和Western印迹法检测人CD123蛋白的表达情况,初步筛选出人CD123高表达的CHO-S细胞株;并进一步用经人CD123 Fc重组融合蛋白免疫的小鼠血清检测该细胞株hCD123表达情况。结果测序及GenBank中序列比较结果显示扩增到的人CD123基因序列是正确的,酶切结果表明表达质粒构建正确;流式分选结合G418筛选得到1个人CD123高表达的细胞株——克隆8G9 CHO-S,其CD123-APC阳性细胞百分数为92.07%,用融合蛋白免疫的血清检测各细胞株人CD123表达情况,结果显示克隆8G9 CHO-S细胞和对照CHO-S细胞的CD123阳性率分别为(97.94±1.93)%和(2.84±1.35)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论建立了人CD123抗原稳定高表达的细胞株克隆8G9 CHO-S,为进一步实现人CD123的抗体规模化生产及其导向治疗奠定了坚实的基础。     

稳定表达犬转铁蛋白受体CHO细胞系的建立和鉴定

目的 构建犬转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,建立稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。方法 从犬腺细胞系（WRD）提取总RNA,逆转录合成 cDNA,采用PCR方法扩增TfR 基因,将其克隆至真核表达载体pCDNA3,酶切和测序鉴定;利用脂质体法转染CHO细胞,通过RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR的表达。结果 构建的pCDNA3-TfR 重组质粒经过酶切和测序鉴定,TfR 基因序列成功插入到pCDNA3载体,且无突变。转染CHO细胞后,RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR表达阳性,成功建立了稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。HTH]结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3-TfR ,并获得了稳定表达TfR的CHO-TfR 细胞系。     

稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ的CHO细胞株的建立与鉴定

目的:建立稳定表达突变减毒志贺样毒素Ⅰ(Stx1)的CHO细胞株。方法:用脂质体介导将突变减毒Stx1真核表达载体pcDNA3.1-Stx1D10、pcDNA3.1-Stx1D100转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO,G418筛选抗性克隆,PCR、RT-PCR、Western blot等方法检测阳性细胞株,有限稀释法获得稳定表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。检测阳性细胞株的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用,并使用Stx 1 B亚基抗体对该作用进行阻断。结果:经2次克隆化获得稳定表达突变减毒Stx1的基因工程细胞株,Western blot检测和SKOV3细胞生长抑制实验证实该细胞株可以分泌突变减毒Stx1,该毒素对SKOV3细胞具有生长抑制作用且该作用可以被Stx1 B亚基抗体阻断。结论:成功地建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株,命名为CHO/Stx1D10和CHO/Stx1D100。证实Stx1的天然信号肽可以被真核细胞识别从而使其被真核细胞分泌性表达。     

人促甲状腺激素受体全长表达载体在真核细胞内的稳定表达

目的构建pcDNA3.1/人TSH受体（human thyroid-stimulating hormone receptor,hTSHR）基因真核表达载体（已完成）,将该真核表达载体在CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中表达,并筛选获得稳定表达细胞株。方法通过脂质体介导,用重组质粒pcDNA3.1-hTSHR转染CHO细胞,以G 418筛选稳定表达细胞株,挑取单克隆,扩大培养并传代;取P5代细胞,抽提基因组DNA及蛋白分别用PCR及Western blot方法鉴定被转染CHO细胞hTSHR的表达情况。结果得到阳性单克隆5个,传代培养。P5代细胞PCR扩增产物为约530 bp特异性条带,大小与预期相符,未见非特异性条带。Western印记法结果表明被转染CHO传代细胞有hTSHR蛋白表达。结论pcDNA3.1-hTSHR真核表达载体可以在CHO细胞中稳定表达,成功构建稳定表达细胞株。为测定自身免疫性甲状腺疾病患者血清TSHR奠定了基础。     

人可溶性CD14基因在CHO细胞中的表达

目的：将人可溶性CD14重组基因，用真核表达系统进行表达，为进一步研究CD14的功能打下基础。方法：用PCR方法扩增sCD14^348aa片段，将产物与载体pEF1/HisC酶切。纯化，连接后克隆至大肠杆菌DH5α中，酶切鉴定；将重组质粒pEF1/HisC/sCD14^348aa用脂质体转染法转染至CHO细胞中，用SDS-PAGE、Westen-Blot方法进行检测。结果：阳性重组子可以切出1044bp大小的片段，得到重组质粒pEF1/HisC/sCD14^348aa；转染后的CHO细胞裂解液，Westen-Bolt在大小约53000附近有一条较强的特异性棕色条带。说明sCD14^348aa基因在CHO细胞中得到表达，在CD14的N端有5个潜在糖基化位点，经真核系统表达，表达产物分子量与文献报道基本一致，证明重组蛋白糖基化完全。结论：重组质粒pEF1/HisC/sCD14在真核细胞中得到表达。     

人乙酰肝素酶稳定表达CHO细胞株的建立

目的 在CHO细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株.方法 在脂质体的介导下,用本实验室构建的pEGFP-N1-HPA重组质粒转染CHO细胞,经G418筛选稳定表达的细胞.通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况,同时通过RT-PCR检测HPA基因转录水平、免疫细胞化学法检测HPA蛋白表达、MTT方法测定外源基因对CHO细胞增殖的影响.结果 荧光显微镜下可见转染的CHO细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在HPA基因mRNA的表达,成功获得HPA的稳定表达细胞株.结论 成功建立人HPA稳定表达CHO细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础.     

t—PAcDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定有达人组织型纤维溶酶原激活剂珠细胞的株，将ｔ－ＰＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。     

人胎儿胸腺细胞株8810的建立及其生物学特性研究

采用剖腹取胎的５月龄胎儿，分离其胸腺细胞，经过筛选培养，获得能传代培养的细胞株，在体外连续培养已２年多，共传２００余代，命名为人胎儿胸腺细胞株８８１０（简称ＨＦＴ８８１０）。该细胞生长繁殖旺盛、迅速，经多次液氮冻存复苏后，细胞仍生长良好。经长期传代培养，该细胞仍保持分泌胸腺素的功能。     

乙酰肝素酶稳定表达细胞株的建立

目的:在真核细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株。方法:构建包含人乙酰肝素酶全长编码序列的真核表达载体pcDNA-hpaFL,转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定表达细胞株。通过RT-PCR,Western-blot分析与鉴定蛋白的表达;用荧光HPLC法检测蛋白的活性。结果:在CHO-K1细胞中成功地表达出有活性的人乙酰肝素酶,并获得该酶的稳定表达细胞株。结论:成功地建立了人乙酰肝素酶稳定表达细胞株,为其抑制剂的筛选及其功能的研究奠定了基础。     

构建稳定表达PDL1的B16F10细胞株

目的通过转染及流式细胞仪(flow cytometry,FCM)筛选出稳定表达小鼠细胞程式死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PDL1)的B16F10细胞株。方法将携带PDL1的真核表达质粒通过脂质体法转染到B16F10细胞株中,经FCM进行多次分选,筛选出稳定表达PDL1的B16F10细胞株,将其与抗CD3/抗CD28抗体活化的CD4⁺ T细胞共培养48 h后,FCM检测CD4⁺ T细胞表面CD69以及CD25的表达。结果建立了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,该细胞株表面的PDL1可诱导CD4⁺ T细胞高表达CD25。结论成功地得到了稳定表达PDL1的B16F10细胞株,为后续研究奠定了物质基础。     

稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系的建立

目的 建立稳定高效表达BRP 44的PC-3细胞系.方法 下载BRP 44的全长mRNA序列,用Oligo 6进行引物设计,在上下游引物的5'引入相应的Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶识别序列及保护碱基.提取LNCaP细胞的总RNA反转录成cDNA进行PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA 3.1/myc-His A中构建成重组体.重组载体经酶切和测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染PC-3细胞、G 418筛选、Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆.结果 成功构建BRP 44的真核表达载体并获得高效稳定表达的BRP 44基因的PC-3细胞亚克隆.结论 高效稳定表达BRP44的PC-3细胞亚克隆可用于下一步研究.     

稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系。方法:CaC l2法将pEGFR-EGFP质粒转化DH5α,酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞;以EGFP作为荧光报告分子,克隆化培养以获取单克隆阳性细胞;流式细胞术、荧光显微镜术、W estern B lot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达;比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线;反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。结果:获得1株稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,命名为CHO-EGFR-GFP1,融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论:成功获得膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。     

表达bcr-abl基因片段的可移植小鼠细胞系的生物学特性

目的建立稳定表达bcr-abl融合基因的、可移植的小鼠肿瘤细胞系,解决慢性粒细胞白血病疫苗研究的瓶颈问题。方法从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进反转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组反转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行反转录病毒滴度测定,计算病毒效价为2×107CFU/mL。收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。然后用SP2/0/bcr-abl细胞攻击同品系BALB/c小鼠,观察SP2/0/bcr-abl移植瘤生长的情况。结果经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。SP2/0/bcr-abl细胞能够在同品系小鼠体内形成移植肿瘤。结论该表达bcr-abl融合基因片段的小鼠肿瘤细胞系将作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发的小鼠CTL应答研究奠定物质基础。     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.     

人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的 :建立稳定表达人胰岛素样生长因子 - 1 ( h IGF- 1 )的细胞株。方法 :用脂质体转染法将含有 h IGF- 1 c DNA的真核表达载体转染 BHK细胞 ,经 G41 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养4周 ,进行原位杂交和免疫细胞化学检测。结果 :原位杂交检测在转染细胞的胞浆中有棕黄色颗粒样阳性杂交信号 ;免疫细胞化学检测在转染细胞的胞浆中有氯化镍蓝色阳性信号。结论 :G41 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,继续培养 4周 ,原位杂交和免疫细胞化学检测表明 h IGF- 1基因得到稳定表达     

M-CSF胞质内稳定表达细胞系的构建和鉴定

目的构建真核细胞pCMV/cyto/myc-M-CSF载体,建立M-CSF胞质内稳定表达细胞系,为进一步研究M-CSF的胞内作用奠定基础。方法构建靶向定位载体pCMV/cyto/myc-M-CSF,PCR及双酶切鉴定后转染HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,RT-PCR和免疫细胞化学鉴定M-CSF的表达及M-CSF的蛋白定位。结果重组质粒pCMV/cyto/myc-M-CSF用M-CSF特异性的引物进行PCR扩增,结果显示插入片段约为1 400 bp,双酶切后分别得到约5.0 kb和1 400 bp的两条带,M-CSF分子大小与预期一致。RT-PCR、免疫细胞化学结果表明转染M-CSF的HeLa细胞高表达M-CSF（P〈0.05）,并且转染M-CSF的HeLa细胞表达的M-CSF蛋白定位于细胞质。结论成功构建了稳定高表达胞质M-CSF的HeLa细胞系。     

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型.方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达.结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高.结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素.     

建立doxycycline诱导表达Xaf1的肿瘤细胞株

[目的]为探索XIAP相关因子1(Xaf1)调节肿瘤细胞凋亡的机制,利用基因开关调节系统(Teton),拟建立由doxycycline调控表达的Xaf1诱导细胞株.[方法]将pTREHA-Xaf1和pWZL-Hyg质粒用基因转染技术转入稳定表达rtTA的Saos-2细胞中.经过hygromycin的抗性筛选,挑出并扩增表达Xaf1的细胞株.在8例实验组中加入doxycycline,和不加doxycycline的8例对照组比较,重复3次实验用免疫印迹法和免疫荧光显微镜检测doxycycline对Xaf1表达的调控.Xaf1诱导的细胞凋亡由流式细胞检测DNA含量来表示.[结果]在30个抗hygromycin的细胞株中,免疫印迹法筛选出5个明显由doxycycline调控诱导表达Xaf1的细胞株,免疫荧光显微镜检测显示doxycycline诱导Xaf1表达于细胞核内.流式细胞检测Xaf1于8h开始诱导Saos细胞凋亡,凋亡率最高约20%,而且不影响细胞周期.[结论]Xaf1-Saos诱导细胞株是研究Xaf1调节肿瘤细胞凋亡机制的良好细胞模型;Xaf1是一种核蛋白,能独立诱导肿瘤细胞凋亡.     

痘苗病毒D13L基因在BHK21细胞系中的稳定表达

目的 建立稳定表达痘苗病毒D13L基因的细胞系。方法 克隆D13L基因并将其插入真核表达质粒pEGFP-C2中构建重组质粒pEGFP-D13L，利用脂质体法转染BHK21细胞，G-418进行筛选，有限稀释法获取亚克隆细胞株。荧光显微镜观察和RT-PCR分析表达效果。结果 D13L基因在细胞中稳定表达，连续传代10次后仍然能检测到其表达，荧光显微镜下能看到绿色荧光，RT-PCR可以得到1650bp大小的目的条带。结论 筛选到了稳定表达D13L基因的细胞株，为下一步构建缺陷型痘苗病毒以及研究D13L基因的功能奠定基础。