负载BMP的新型组织工程骨的构建及骨缺损修复实验

OBJECTIVE: To construct a new tissue-engineered bone with poly (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA), bone morphogenetic protein (BMP) and bone marrow-derived stem cells (BMSCs) and observe its effect in repairing segmental bone defects. METHODS: A 15-mm bone defect in the right radius was induced in New Zealand white rabbits, and the models were randomized into three groups to receive implantation of the tissue-engineered bone grafts constructed with PLGA carrying 5 mg BMP and about 1 x 10(6) BMSCs (experimental group), grafts of PLGA with about 1 x 10(6) BMSCs (control group), or grafts of exclusive PLGA (blank control group), respectively. The osteogenesis in the bone defect after the implantation on was evaluated X-ray films, and the histological changes of the tissues sampled from the bone defect 4, 8, and 12 weeks after operation were observed and new bone formation was measured by image analysis. RESULTS: The bone defect was completely repaired in the experimental group 12 weeks after the implantation, showing the best results among the 3 groups. The bone defects in the blank control group was filled with only fibrous and connective tissues at 12 weeks. CONCLUSION: This tissue-engineered bone constructed with PLGA, BMP and BMSCs possesses good ability in repairing segmental bone defect.     

负载BMP-2组织工程骨修复骨缺损的研究进展

组织工程骨修复骨缺损是当前研究的热点。骨形态发生蛋白(BMP)具有强大的促成骨活性,能够诱导间充质细胞不可逆地分化为骨、软骨组织;BMP-2是成骨能力最强的BMP之一,目前已被广泛应用于骨组织工程领域,并且展现出良好的应用前景。在此分析了近年来BMP-2在骨组织工程中应用研究的文献,概述国际上关于负载BMP-2组织工程骨研究现状及临床应用进展。     

兔MSCs-PGA复合物在RCCS中的成骨潜能

目的：探讨联合应用兔骨髓基质干细胞（MSCs）、聚乙醇酸（PGA）支架材料和成骨诱导因子在旋转式细胞培养系统（RCCS）中构建组织工程化骨的可行性。方法：利用密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞，采用动力接种方法形成骨髓基质干细胞-PGA支架复合物，以成骨条件培养液为生长介质，在RCCS中进行培养。用趋骨性荧光素四环素标记、茜素红染色以及扫描电镜、透射电镜观察，研究细胞-PGA支架在RCCS中的成骨潜能。结果：组织化学研究显示，兔骨髓基质干细胞-PGA支架结构中RCCS中培养第7d时，茜素红钙质染色呈弱阳性反应，至第21d及28d时，茜素红钙质染色呈强阳性反应。荧光显微锏上，培养组织趋骨性荧光素四环素标记呈现金黄色荧光，荧光亮度与分泌物堆积程度成正相关，与钙质染色阳性反应结果一致。超微结构观察，见骨髓基质干细胞合成分泌胶原纤维，释放基质小泡，并出现钙盐沉积，形成丛毛球状钙球，最终形成骨组织。结论：在旋转式细胞培养系统中，骨髓基质干细胞-PGA支架结构具有形成类似活体骨组织特征的组织工程化骨的潜能。     

组织工程化骨组织诱导脊柱融合的实验研究

目的：在体外构建一种自体骨组织替代物,回植入体内,以期诱导兔脊柱融合。方法：体外培养兔的骨髓基质干细胞,基因重组工程生产出具有诱骨活性的重组人骨形态发生蛋白-4（recombinant human bone morphogenetic protein-4,rhBMP-4）,采用真空冷冻抽干技术将一定量的rhBMP-4和Ⅰ型胶原结合,构建出一种新的载体,并将一定量的骨髓基质干细胞吸附在载体上。建立兔脊柱关节突融合的动物模型,实验组植入复合rhBMP-4和骨髓基质干细胞的Ⅰ型胶原,对照组只采用Ⅰ型胶原和骨髓基质干细胞,植入兔脊柱的关节突之间来诱导脊柱融合。结果：应用rhBMP-4和Ⅰ型胶原组新骨形成良好,此侧的脊柱融合良好,而对侧无明显的骨组织形成。结论：应用含有骨生长因子、骨前体细胞和胶原载体的复合物是一种较为理想的自体骨组织替代物。     

组织工程骨在颅颌面骨缺损临床修复中的应用

目的 探索人自体骨髓基质干细胞(hBMS6C)为种子细胞的组织工程骨在治疗临床颅颌面骨缺损中的可行性。方法 自1999到2002年问,选择颅颌面骨缺损病11例(外伤性颅骨缺损4例,先天性梨状孔周围骨凹陷畸形7例)进行治疗研究。从患者髂前上棘穿刺取骨髓,密度梯度离心法分离hBMSC,经体外成骨诱导和扩增至第3代。将诱导的hBMSC,与部分脱钙骨(partly demineralized bone mattix,pDBM)复合,并于体外培养一周后,手术回植骨缺损区。选择3例梨状孔凹陷畸形患者,在凹陷明显侧植入hBMSC／pDBM复合物,对侧轻度凹陷区仅植入单纯pDBM。分别于术后1,3,6,12,24,48,50个月进行临床外形和三维CT检查随访。2例患者在Ⅱ期手术时,取少量植入物活检,行组织学(HE染色),免疫组织化学(骨桥蛋白、骨粘连蛋白)检测。结果 患者三维CT检查结果示术后3～6月能形成组织工程化骨,并修复骨组织缺损。术后1～2．5年的随访表明组织工程骨稳定存在,无明显骨吸收现象,临床治疗效果稳定。组织工程骨活检标本HE染色显示其组织学结构与正常松质骨相同,并有典型软骨内化骨现象。免疫组织化学显示有骨桥蛋白、骨粘连蛋白阳性表达。而植入的单纯部分脱钙骨于术后3～6月吸收,组织学显示为脱钙骨降解碎片和纤维组织的混合物。结论 以自体hBMSC为种子细胞,利用组织工程技术可在人体内形成稳定的工程化骨组织,并临床修复颅颌面骨组织缺损。这项研究的结果为组织工程骨的临床大规模应用奠定了坚实的基础。     

pcDNA3.1-VEGF165转染BMSCs构建组织工程骨修复骨缺损的实验研究

目的：依据组织工程的原则,首先将pcDNA3.1-血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）165质粒转染至骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells ,BMSCs）,然后将其与纳米羟基磷灰（nano-hydroxyapatite,n-HA) /羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan,CMCS）支架材料复合构建组织工程骨,观察该组织工程骨在兔桡骨骨缺损模型处的成骨能力及降解速度。 方法：采用化学共沉淀法制备纳米羟基磷灰石,以京尼平（Genipin）为交联剂,通过粒子沥滤结合冷冻干燥工艺制备纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖复合支架材料。采用扫描电镜观察其微观结构;三点弯曲法测试其力学性能;通过细胞形态分析测试其体外细胞毒性;激光共聚焦显微镜观察其荧光性能。根据设计的引物反转录合成VEGF165,pcDNA片段,构建pcDNA3.1-VEGF165质粒。骨髓间充质干细胞取自兔骨髓,培养、传代,采用电转法将 pcDNA3.1- VEGF165转至 BMSCs 然后与 n-HA/CMCS支架材料复合构建组织工程骨;建立动物模型将其植入兔桡侧,通过大体观察,X射线,HE染色及三点弯曲强度评价其成骨能力及降解速度。 结果：京尼平交联的n-HA/CMCS支架材料微观结构、力学性能与天然松质骨相似,可满足支架材料的要求;与戊二醛做交联剂所得支架相比,本研究所得支架生物毒性更小,更利于细胞的吸附与增殖,并且使用京尼平交联是支架材料具有自发荧光特征;成功构建出 pcDNA3．1-VEGFl65质粒,将其转至 BMSCs,并与n-HA/CMCS 复合构建组织工程骨。大体标本观察表明复合材料植入骨缺损处可见骨缺损处愈合良好,植入材料大部分已转化为自体骨组织仅少许未降解。X射线观察显示实验侧可见明显骨痂生成,骨髓腔形成,骨髓腔基本贯通。HE染色结果表明实验组骨缺损愈合,皮质骨形成,皮质主要由编织骨组成,部分由新生的骨单位构成,髓腔再通。 结论： pcDNA3.1-VEGF165转染BMSCs复合n-HA/CMCS支架材料具有生物相容性好、无毒副作用、促进局部微血管形成、加快骨缺损修复的作用,其降解速度与骨生长速度基本匹配;使用京尼平交联的支架不同于其他骨组织工程支架材料,其具有自发荧光特征。通过激光共聚焦显微镜可以清楚地观察到支架和细胞的界面,细胞的粘附特征,以及支架的微结构和降解时微结构特征变化。综上可知本研究所得复合骨是一种潜在的性能优良的骨修复材料。     

组织工程骨复合骨形态发生蛋白修复兔颅骨缺损

目的 探讨组织工程化骨修复兔颅骨缺损的实用价值及合理应用BMP的方法。方法 将自体成骨样细胞即刻种植在复合BMP的胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）的基质材料和不含BMP的基质材料上，然后将不同的复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区，作为实验侧Ⅰ、实验侧Ⅱ或实验侧Ⅲ。对侧设对照，不作任何植入。将60只新西兰兔分别于术后2，6，8及12wk处死，标本行大体组织学检查，X线摄片及灰量测定检查。结果 表明实验侧Ⅰ成骨量明显大于实验侧Ⅱ或实验侧Ⅲ（P＜0．01），而对照侧仅为纤维组织修复。结论 组织工程骨可修复自体的兔颅骨缺损，应用外源性BMP可促进骨再生，为组织工程化骨在颅面外科及整形外科领域的临床应用奠定了基础。     

PLGA复合Ⅱ型胶原和生长因子诱导组织 工程软骨修复兔关节软骨缺损

 【目的】 观察骨髓基质干细胞(BMSCs)种植到复合胶原和生长因子的聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)生物材料上,再种植到兔体内,进一步诱导成组织工程软骨组织的可行性,并观察此组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的能力｡【方法】 相分离法制作PLGA,复合Ⅱ型胶原和成软骨生长因子bFGF,TGF-β1｡将P3代的BMSCs种植到复合材料上｡36只新西兰大白兔随机分为实验组､对照组､空白组,分别于肌袋内植入BMSCs/复合生长因子和胶原的PLGA､复合生长因子和胶原的PLGA､复合胶原的PLGA,于术后第4､8､12周取材观察细胞的定向分化及生长情况,包括大体观察､苏木精-伊红染色､甲苯胺蓝染色､Ⅱ型胶原染色､扫描电镜观察｡16只新西兰白兔分2组,上述组织工程骨植入实验兔膝关节软骨缺损处,对照组仅做缺损,12周后取材初步观察修复情况｡【结果】 大体观察可见实验组材料有类软骨样组织生长,而对照组和空白组则仅见纤维组织生长｡各种染色及电镜观察显示:实验组复合物内可见多的成软骨细胞及少量的破骨细胞｡实验组甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组和空白组均为阴性｡大体观察兔膝关节软骨缺损得到修复,苏木精-伊红染色显示表面关节软骨形成,与周围正常软骨形成连接｡【结论】 胶原修饰的PLGA生物材料具有较好的细胞相容性;BMSCs种植到复合胶原和生长因子的PLGA生物材料上在兔体内可诱导成为组织工程软骨复合组织,并初步证实有修复兔关节软骨缺损的能力｡     

BMP／BMC／SB修复大块骨缺损实验研究

目的对骨形态生成蛋白、骨髓细胞及煅烧骨所形成的ＢＭＰ／ＢＭＣ／ＳＢ生物复合体修复骨缺损的能力进行探讨。方法在雄性大白兔双侧桡骨中远段各作一１０ｍｍ骨缺损。右侧缺损内植入ＢＭＰ／ＢＭＣ／ＳＢ，左侧植入不含骨膜的自体皮质骨。结果术后８个月，在ＢＭＰ／ＢＭＣ／ＳＢ植入组骨愈合率为８８９％，自体皮质骨为４４４％。在新骨生成及塑形方面，ＢＭＰ／ＢＭＣ／ＳＢ组明显优于自体皮质骨移植组。结论ＢＭＰ／ＢＭＣ／ＳＢ在修复大块骨缺损方面优于自体皮质骨，是一种理想的人工骨材料     

一种组织工程骨修复兔股骨头坏死模型的效果评价

目的观察双相陶瓷生物骨(biphasic ceramic biologic bone,BCBB)、骨形态发生蛋白(bone morphogeneticprotein,BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)复合培养形成的组织工程骨修复股骨头坏死(femoral head necrosis,FHN)模型病灶清除区缺损,评价该组织工程骨修复FHN的效果。方法取32只新西兰成年大白兔共64侧股骨头,微波灭活建立股骨头坏死模型,按随机数字表法分为4组,每组16侧。A组:空白对照组;B组:植入BCBB/BMP/bFGF;C组:植入BCBB/BMP/bFGF/MSCs;D组:植入自体松质骨。术后2、4、8、12周分批处死动物,每组每次处死4只。行股骨头大体及解剖观察、X线摄片、组织学观察、钙含量及钙磷比检测、血管免疫组织化学染色。结果股骨头大体及解剖观察:A组8周和12周各有一侧股骨头塌陷;B组2周时纤维结缔组织生长活跃;C、D组12周时植骨区与宿主骨界限不清。②X线评分:12周时,...     

骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的研究骨形态发生蛋白微球对兔骨髓基质细胞生物学行为的影响。方法将壳聚糖与海藻酸钠制成复合微球,包裹或不包裹骨形态发生蛋白。采用体外细胞培养技术,将两种微球分别与细胞一起培养,通过对细胞增殖率及碱性磷酸酶活性、考马斯亮蓝的检测,观察两种微球对培养细胞的影响。结果两种微球对骨髓基质细胞的增殖均无明显影响,但骨形态发生蛋白微球对细胞的分化及分泌功能有明显的促进作用。结论骨形态发生蛋白能够提高骨髓基质细胞的体外成骨能力,且壳聚糖海藻酸钠微球可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

hBMP-7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)基因转染对兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSc)增殖和向成骨细胞分化的影响。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染BMSc,免疫组织化学方法检测hBMP-7蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。结果经BMP-7基因转染的兔BMSc有hBMP-7的阳性表达,增殖能力无明显改变(P>0.05),但其合成碱性磷酸酶的能力得到显著提高,与空载体病毒液转染、未经转染的BMSc相比差异有显著性(P<0.01)。结论经BMP-7基因转染的BMSc能够表达外源BMP-7,hBMP-7基因转染能够促进体外培养的BMSc向成骨细胞转化,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。     

骨形态发生蛋白诱导髓外造血的实验研究

目的:探讨骨形态发生蛋白(BMP)诱导髓外造血以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法:采用60Co-γ+氯霉素(CH)+环磷酰胺(CY)的方法诱导小鼠致死性再生障碍性贫血模型,实验组于诱导再障前6d肌肉内植入重组人-BMP-4(rh-BMP-4),对照组小鼠肌肉内植入琼脂。观察血象、病理形态等变化以及两组再障小鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-4,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位(CFU-S)以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果:正常小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,2周后才出现软骨化骨和骨小结形成,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障小鼠,不仅血象与对照组相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有46.7%存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照小鼠除1只存活超过3个月外(占6.7%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论:肌肉内植入BMP-4可诱导髓外造血,其机制可能与BMP-4诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关,这一结果将为干细胞治疗提供了一条新的思路。     

组织工程骨预制及其骨缺损修复作用的研究

目的 探索组织工程化骨预制的方法,研究组织工程化预制骨修复骨缺损的可行性及实用性。方法 实验1：应用骨髓基质成骨细胞(MSO)和脱细胞骨基质(ABM)形成MSO／ABM复合人工骨(MACAB),并将其植入肌瓣内。实验2：将预制8周后的MACAB移植修复骨缺损。术后用X线摄片、组织学检查评价MACAB成骨、血管化情况及其骨缺损的修复作用。结果 MACAB肌瓣内移植成骨效果优于对照组,术后8周已完全血管化。预制骨的骨缺损修复作用优于对照组。结论 在肌瓣内成功地预制了组织工程化骨组织,预制骨(MACAB)修复了骨缺损。     

骨形态发生蛋白激活自身肌肉间质细胞拯救骨髓衰竭

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)激活自身肌肉间质细胞以拯救骨髓造血衰竭的作用。方法采用5-氟脲嘧啶与白消安合用诱导大鼠致死性再生障碍性贫血模型,于诱导再障前3d肌肉内植入重组人-BMP-2(rh-BMP-2),并以肌肉内植入琼脂为对照。观察血象、病理形态等变化以及两组再障大鼠的死亡率。同时,给正常小鼠大腿肌肉内植入rh-BMP-2,动态观察植入后局部的形态变化、形成骨及骨髓的形态特点,脾集落形成单位以及基质细胞干细胞生长因子(SCF)的表达。结果小鼠在BMP肌肉内植入1周内,在BMP周围有大量间质细胞增殖,随后形成骨及骨髓,其骨髓基质细胞的SCF表达明显高于自体骨髓;BMP植入组的再障大鼠,不仅血象与对照相比有明显改善,而且死亡率也明显下降,有56.3%大鼠存活超过3个月,其血象完全恢复正常,骨髓和脾脏的组织形态学改变也恢复正常。对照大鼠除1只存活超过3个月外(占4.3%),其余均死于急性再生障碍性贫血。结论BMP肌肉内植入可拯救骨髓造血衰竭,其机制可能与BMP诱导成年自体肌肉内存在的干细胞向造血分化有关;本研究结果为应用成体自身干细胞进行细胞治疗提供了新的途径。     

软骨形态发生蛋白1诱导SD仔鼠脂肪干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究

目的:应用软骨形态发生蛋白1(CDMP1),以诱导SD仔鼠脂肪干细胞(ADSCs)以修复兔膝关节软骨缺损,探讨异种细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法:自SD仔鼠腹股沟脂肪组织分离、培养ADSCs,复合于自制牛松质骨支架上,经CDMP1诱导,体外继续培养2周,免疫组化鉴定后备用。建立兔双侧髌骨关节缺损模型。左侧缺损处植入ADSCs-支架复合物,为实验侧;右侧缺损处植入空支架,为对照侧。术后8、16、24和48周各处死9只兔子,缺损处行H-E染色和番红O染色。结果:实验侧8周时可见缺损周围表面充填有薄层白色半透明组织,与周围软骨的界线清楚;16周时缺损表面界限连接较8周时模糊,但仍可辨,24周时,修复良好,修复区新生软骨细胞与周围正常软骨细胞形态相近,呈球形,可见软骨陷窝,H-E染色和番红O染色阳性;48周时,能较容易分清缺损处与修复区的界限,修复效果不及24周时。对照侧8、16、24和48周4个时期标本基本相同,软骨缺损处与周围正常组织边界清楚,缺损处凹陷空洞,被肉芽组织填充,新生细胞呈长梭形,H-E染色和番红O染色阴性。结论:利用CDMP1诱导SD仔鼠ADSCs复合自制牛松质骨支架可较好修复兔膝关节软...     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphogenetic protein 7, rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞,构建rhBMP7逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,经G418筛选后,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,病毒液感染骨骼肌卫星细胞,使用RT-PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果成功地构建了逆转录病毒真核表达载体,逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7 的mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中,目的基因可在mRNA水平有效表达。     

可长时间缓释骨形态发生蛋白2的聚己内酯复合支架的制备及应用

目的 制备一种可长时间缓释骨形态发生蛋2(BMP-2)的聚己内酯(PCL)复合支架,并通过检测其对人源骨髓间充质于细胞(BMSC)成骨分化的影响探讨其在骨组织工程中的应用.方法 将磷脂(PL)和BMP-2混合形成的BMP-2/PL混合物(B/P)分散在二氯甲烷中,与PCL混合后,采用相分离法制备负载BMP-2的三维PCL-B/P复合支架和PCL-B传统支架,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两种支架的BMP-2缓释效果.将BMSC种植在PCL-B传统支架和PCL-B/P复合支架中,分别采用CCK-8法和实时定量PCR(qPCR)检测两种支架上BMSC的增殖和成骨分化能力.结果 与PCL-B传统支架对比,PCL-B/P复合支架对BMP-2缓释效果更佳,缓释时间更长,可达22 d.在BMSC培养的第7、14和21天,PCL-B/P复合支架上BMSC的增殖能力均优于PCL-B传统支架(P＜0.05),且PCL-B/P复合支架上BMSC中碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原蛋白、骨钙、骨桥蛋白3种成骨基因mRNA的表达均高于PCL-B传统支架(P＜0.05,P＜0.01).结论 成功地制备出一种可长时间缓释BMP-2的高分子三维PCL-B/P复合支架,其较PCL-B传统支架能更好地诱导BMSC的增殖和成骨分化.