大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向色素上皮样细胞分化的研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)向色素上皮样细胞诱导、分化的可行性,为视网膜移植提供种子细胞的来源.方法 体外培养人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,HRPE)和 MSC,应用免疫细胞化学法检测CD34、CD44 和角蛋白的表达情况,确定2种细胞的来源;通过 Transwell 6孔板非接触共培养的方式,建立 HRPE 和 MSC 共培养体系,显微镜下观察人 MSC 的形态学变化;对于诱导后的 MSC 进行免疫细胞化学鉴定,确定角蛋白的表达情况.结果 MSC呈纤维样克隆样生长,人MSC的CD44(+),CD34(-);HRPE原代培养时细胞内布满色素颗粒,角蛋白表达(+).HRPE和MSC共培养体系中,部分长梭形的MSC逐渐变成多边形,细胞内出现典型的色素颗粒;分化的色素上皮样细胞角蛋白表达阳性.结论 MSC与HRPE在非接触共培养诱导方式下能分化成色素上皮样细胞;分化的细胞具有上皮细胞的特异性标志,诱导后的细胞是否具有HRPE的功能尚有待于进一步研究.     

应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定

目的:应用组织块培养大鼠视网膜干细胞的有效性。方法:机械分离出生10d大鼠睫状体组织,剪成细小组织块,置入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,同时取大鼠胚胎脑组织,应用常规机械-酶消化法进行神经干细胞的分离培养作为阳性对照。应用免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)的表达,应用含100mL/L的胎牛血清的培养基促进其分化以确定其神经干细胞特性。结果:原代培养48h后在组织块边缘开始出现细胞团,折光性强,呈球形或者桑葚状悬浮生长。培养4～5d后,悬浮生长的细胞团数量增多,出现较大的细胞团,原代培养7d后传代,传代后细胞能重新形成细胞团。应用免疫荧光方法可检测到细胞内nestin阳性表达,且视网膜干细胞可在以血清为诱导条件下变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞。其形态、增殖及可分化特性与作为阳性对照的神经干细胞相似。结论:组织块培养法对细胞损伤小,操作简便,可成功对大鼠视网膜干细胞进行分离培养。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外可诱导分化为角膜上皮细胞

目的:探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell,MSC) 分化为角膜上皮细胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性.方法:用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSC,经体外与角膜基质细胞共培养诱导分化,免疫荧光法检测角膜上皮细胞特异标志物K12的表达.结果:体外培养的大鼠骨髓MSC表现出很强的增殖潜能,原代培养的骨髓MSC CD29免疫荧光染色阳性,CD34和CD45为阴性,符合骨髓MSC的特征.MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞,少部分细胞形态上相对偏小,免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12.结论:体外培养的MSC在角膜基质细胞的诱导下可横向分化为角膜上皮细胞.     

胚胎千细胞诱导分化为视网膜祖细胞的体外研究

目的 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)诱导为视网膜祖细(retinal progenitor cells,RPC)的体外培养方法,为致盲性视网膜变性疾病的治疗提供种子细胞.方法 用细胞免疫荧光染色法和流式细胞术对mESC进行mESC标记物阶段特异性胚胎抗原1、细胞增殖核抗原Ki67、细胞周期和碱性磷酸酶进行鉴定后,在无血清条件下悬浮培养形成拟胚体(embryoid bodies,EB)并添加抑制因子1、左右决定因子A和γ-促分泌酶抑制剂等诱导分化为RPC,并对其分化的细胞进行标记物兔来源配对盒基因6(paired box6,Pax6)、兔来源性别决定区Y框蛋白(Sox2)和鼠来源转录因子同源异型框蛋白(orthodentical homeobox2,Otx2)的检测以及增殖能力和细胞周期的检测.结果 mESC标记物碱性磷酸酶阳性表达,特异性胚胎抗原1阳性率为(80.66±0.64)％,Ki67和细胞周期检测显示有较高增殖能力.定向诱导分化后,RPC标记物Pax6、Sox2和Otx2阳性率分别为(50.87±2.97)％、(49.10±2.60)％和(32.01±3.87)％,Ki67和细胞周期检测均显示诱导后的RPC具有一定的增殖能力.结论 在特定的细胞因子作用下,mESC可以诱导分化为RPC.     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的:检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSC)和视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物(BRE)以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果:BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE,Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论:RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的：检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法：体外培养人骨髓间充质干细胞（BMSC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物（BRE）以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果：BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE．Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论：RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

视网膜修复中干细胞的应用

视网膜疾病由于其不可逆转的致盲性而影响人类生存质量.随着对干细胞研究的深入,基于干细胞移植的细胞替代疗法为视网膜疾病的治疗开辟了新的途径.近年来眼组织来源的视网膜干细胞或祖细胞、非眼组织来源的间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞在视网膜损伤疾病中的应用取得了很多突破性进展,它们不仅可以被诱导分化为各种视网膜神经元细胞、胶质细胞,而且移植到体内可以整合到损伤视网膜,甚至可以发挥正常视网膜神经元细胞功能.     

视网膜内源性干细胞研究进展

视网膜的神经细胞一旦损伤,便无法再生修复,利用干细胞疗法使神经细胞得到再生修复已成为当今研究的热点.视网膜中存在具有自我修复能力的内源性干细胞,激活视网膜中的内源性干细胞,利用其对损伤的视网膜神经元进行修复,具有重要的研究价值和应用前景,近年来受到世界神经生物学、眼科学等领域研究者的重视.鱼类、两栖类动物的视网膜具有较强的再生修复能力,而鸟类和哺乳类动物的视网膜的再生能力有限,且各类动物的视网膜再生存在各自的特征.睫状体边缘带、视网膜色素上皮细胞、Müller细胞等细胞都是视网膜再生可能的细胞来源,如鱼类、鸟类和哺乳类动物新生成的视网膜细胞来自于视网膜Müller细胞,而两栖类动物再生的视网膜则来源于视网膜色素上皮细胞.各种视网膜内源性干细胞需要被活化后才能发挥干细胞特性对损伤的视网膜神经细胞进行修复,激活这些细胞的方法有多种,如利用兴奋性氨基酸、生长因子、转录因子、细胞内信号等.本文就不同物种,包括鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类动物在内的视网膜的再生能力、睫状体边缘带、视网膜色素上皮细胞、Müller细胞等不同的视网膜内源性神经干细胞的来源及各种能够活化视网膜内源性干细胞进行增生和分化的因素的相关研究进展进行综述.     

兔骨髓间充质干细胞及人羊膜上皮细胞移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的研究

背景角膜缘干细胞缺乏可引起致盲性眼病,但传统的治疗方法疗效欠佳。最近的研究表明,骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人羊膜上皮细胞（AECs）有分化成多种细胞的能力,但其对角膜缘于细胞缺乏的疗效仍有待研究和评价。目的观察和对比兔BMSCs和人AECs移植治疗兔角膜缘干细胞缺损的治疗效果。方法将18只新西兰白兔采用随机数字表法分为羊膜基质（AS）移植组、兔BMSCs移植组和人AECs移植组,每组6只。将浸有NaOH溶液的滤纸贴附于角膜表面建立碱烧伤角膜缘干细胞缺损的动物模型。抽取兔髂窝处骨髓并收集人胎盘组织分别分离、制备兔BMSCs和人AECs,通过密度梯度离心加贴壁培养法及胰蛋白酶多次分步消化法获取兔BMSCs和人AECs,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法对培养细胞进行鉴定,再接种于人去上皮AS上,按照动物的分组分别将上述材料缝合至动物模型的角膜表面。术后28d,对各组动物的角膜新生血管（CNV）评分以及角膜混浊度评分进行对比,对角膜组织行组织病理学检查并针对角膜上皮细胞特异性标记物细胞角蛋白3（CK3）行免疫组织化学染色。结果第3代兔BMSCs接种于AS载体上12h后贴附生长,第1代人AECs接种于AS载体上48h后呈单层膜状生长,传代细胞经RT—PCR鉴定符合目标细胞的特征。兔BMSCs移植组术后28d,免疫组织化学染色结果显示,兔BMSCs移植组和人AECs移植组的角膜表面细胞CK3均呈阳性表达,而AS组CK3表达阴性。与AS移植组比较,兔BMSCs移植组和人AECs移植组CNV评分以及角膜混浊度评分明显降低,差异均有统计学意义（BMSCs：Z=-2．983,P=0．003;Z=-2．844,P=0．004;AECs：Z=-2．817,P=0．005;Z=-2．041,P=0．041）。组织病理学检查显示,AS组兔角膜组织有较多的炎性细胞生长,胶原纤维排列紊乱。兔BMSCs组术后角膜表层形成了角膜上皮样的复层结构,无明显杯状细胞,角膜基质内无新生血管生长,炎性细胞减少,胶原纤维排列更加规则,且兔BMSCs移植组角膜透明度明显优于人AECs移植组,差异有统计学意义（Z=-2．091,P=0．037）,而2组间CNV评分的差异无统计学意义（Z=-0．267,P=0．789）。结论移植至兔角膜缘干细胞缺损角膜表面的兔BMSCs和人AECs均能分化为角膜上皮细胞样细胞,可抑制CNV,减轻角膜混浊。在改善角膜透明度方面,兔BMSCs优于人AECs。     

骨髓间充质干细胞移植治疗视网膜病变

目前,对视网膜病变的治疗仍缺乏有效的药物.为解决视网膜损伤的修复问题,有研究者用胚胎干细胞、胚胎视网膜祖细胞、成体哺乳动物眼干细胞等进行了实验,但这些方法都存在着伦理学和移植学上的不足.骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中一类具有多向分化潜能的细胞群,在体外可诱导分化为神经元样细胞,进行BMSC移植,为视网膜病变的治疗提供了一条新的途径.现就BMSC生物学特征、体外的分离和纯化、向神经元样细胞的诱导分化及在视网膜病变治疗中的研究进展作一综述.     

间充质干细胞在视网膜疾病中的临床应用展望

间充质干细胞(MSC)用于治疗视网膜疾病有两种移植方法:全身静脉注射和局部移植,后者具有更好的针对性。根据疾病不同,需要采用不同的MSC治疗策略:(1)MSC定向分化替代受损细胞,如光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞;(2)利用其免疫抑制作用治疗自身免疫性葡萄膜视网膜炎;(3)利用其神经保护作用减轻或延缓视网膜组织损伤,如目前的视网膜色素变性、视网膜缺血再灌注损伤和青光眼动物模型;(4)转基因后的MSC移植靶向治疗,如脉络膜新生血管的治疗;(5)利用MSC抗炎和促进创伤愈合作用治疗多种视网膜疾病。迄今为止,其抑制葡萄膜视网膜炎进展以及视神经营养保护作用较为明确。但MSC在各种视网膜疾病中的疗效还需要严格评估,其发挥作用的机制尚未完全明了,不同研究结果差异较大。此外,MSC的移植途径和方法,治疗的远期效果及安全性也有待进一步评估。     

骨髓间充质干细胞向视网膜细胞诱导分化的研究

骨髓间充质干细胞作为成体干细胞的一种,具备自我更新能力和多向分化潜能的特性,在适当条件下能分化为骨、肌肉、脂肪、神经等多谱系细胞.在不同诱导环境下,骨髓间充质干细胞具有向视网膜神经细胞、视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞等视网膜细胞分化的潜能,为视网膜疾病的治疗提供新思路.     

诱导多能干细胞在视网膜疾病研究中的应用

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是成体细胞通过重编程而获得的一类具有胚胎干细胞相似特性和功能的细胞.近年来,iPSCs在再生医学和干细胞研究领域备受关注,尤其是患者特异源性iPSCs,来源方便、无免疫排斥和伦理学问题,同时还可以保留特定个体基因型,为再生医学以及细胞移植疗法提供了新的细胞来源.目前,iPSCs在视网膜疾病研究领域取得了长足的进步.本文主要对iPSCs向视网膜色素上皮细胞、感光细胞和神经节细胞的诱导分化及细胞移植研究、安全性评价等方面进行综述,探讨iPSCs在视网膜疾病研究中的应用和前景.     

诱导多能干细胞在眼科疾病的研究进展

可诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)是由体细胞或成体细胞重编程转化而来,这项技术引起了学术界空前的关注,越来越多的相关研究随之开展。它是通过人工方法将适当的外源性转录因子导入体细胞或成体干细胞,使之转化为具有无限增殖潜能和定向分化能力、类似于胚胎干细胞的一类干细胞。在不断探索发展多能干细胞培养转化技术的过程中,已经取得不少突破性的进展,这为将来细胞移植成为临床治疗方法奠定了基础。同时各种研究成功诱导出类似人体细胞的干细胞,并在动物实验中得到乐观的结果。我们主要探讨iPSC在眼科疾病方面的研究进展。     

从胚胎干细胞诱导视网膜细胞的分子生物学

近年来诱导人多能干细胞的研究激发了人们对再生医学和组织工程的极大热情,干细胞在眼科疾病治疗中的可能应用也得到了更多的重视。在这里我们着重讨论视网膜发育中的细胞分子生物学过程,以及从胚胎干细胞诱导分化的一些考虑,以期对进一步的研究工作及实现其临床应用有所帮助。     

人角膜缘干细胞的原代培养和生物学鉴别

目的 探讨人角膜缘干细胞（stem cell,SC)体外培养方法并观察其生物学活性。方法 应用消化培养法对人角膜缘组织进行原代培养,记录其生长特性。待细胞生长至80％汇合时,分别采用针对64KD角蛋白的AE5、针对一组酸性角蛋白的AE1单克隆抗体,抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（anti-proliferatin cell nuclear antigen,PCNA),针对50KD烯醇酶特异的单克隆抗体4G 10．3,通过间接免疫荧光细胞化学染色对培养细胞进行鉴别。结果 人角膜缘组织应用消化培养法在6－7d达到80％汇合状态,应用间接免疫细胞化学染色,AE1、AE5染色,胞浆染色呈阳性。PCNA染色、细胞核染色阳性,4G 10．3亦可见阳性结果。结论 应用消化培养法可成功地对人角膜缘组织进行原代培养,培养后细胞既可保持角膜上皮特性,又含有具有强增殖潜力的原始细胞,适合用于临床移植治疗眼表疾病。