生物素交联补骨脂素标记HPV基因探针的制备

对含ＨＰＶ１６和ＰＶ１８ＤＮＡ质粒的大肠村菌进行培养、扩增，提取大鼠质粒ＤＮＡ，纯化、酶切、回收ＨＰＶＤＮＡ片段，用国产生物素交联补骨脂素标记，再经纯化鉴定，制备的ＨＰＶＤＮＡ探针用亲合素－辣根过化物酶显色，敏感性可达１ｐｇ。检测靶核苷酸的敏感性可达５ｐｇ。该探针用于原位杂交检测１０例食管癌组织及相应癌旁粘膜组织中的ＨＰＶＤＮＡ，也取得良好结果，结果提示：用生物素交联补骨脂素标记基因探针是一种简单     

多重多聚酶链反应和原位杂交检测成人咽喉病变中人乳头瘤病毒感染

用多重我聚酶链反应（ＰＣＲ）和生物素标记探针的原位杂交方法对３６例石蜡包埋的成人咽、喉部乳头状瘤、上皮不典型增生和鳞状细胞癌的组织标本进行了检测。结果共检出６例ＨＰＶＤＮＡ阳性病例，全部为ＨＰＶ６／１１，其中仅１例伴ＨＰＶ１６型感染。６例阳性病例包括喉乳头状瘤３例，咽乳头状瘤、喉粘膜上皮高度不典型增生及喉鳞癌各１例。原位杂交显了ＨＰＶＤＮＡ在肿瘤组织、组织中的分布。     

DIG—DNA探针检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒6,11,16,18型DNA

用地高辛配基分别标记，制备ＨＰＶ－６、ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ－１６及ＨＰＶ－１８的ＤＮＡ探针，应用核酸杂交技术，对３７例宫颈癌活检组织ＤＮＡ作了检测，各型ＨＰＶＤＮＡ的检出率为：ＨＰＶ－６０％、ＨＰＶ－１１２．７、ＨＰＶ－１６６７．５％、ＨＰＶ－１８１３．５％，联合应用ＨＰＶ－１６和ＨＰＶ－１８探针共同检测结果为８１％。结果显示：我国宫颈癌的发生与ＨＰＶ感染密切相关，联合应用高危型ＨＰＶ探针可提高检     

人乳头瘤病毒与呼吸道肿瘤关系的研究：Ⅰ.HPV与喉癌的关系

应用α－３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记ＨＰＶ－１１及ＨＰＶ－１６ＤＮＡ为探针，以Ｓｌｏｔｂｌｏｔ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ两种核酸杂交技术，检测了取自青岛及北京两个地区的３７例喉鳞癌组织ＤＮＡ中ＨＰＶ－１１及ＨＰＶ－１６ＤＮＡ相关序列。结果表明，Ｓｌｏｔｂｌｏｔ杂交中，与ＨＰＶ－１１探针杂交阳性者占８６％（３２／３７），与ＨＰＶ－１６探针杂交阳性者占８１％（３０／３７）。在同一癌组织中，与两型探针同时呈现阳性者占８１％（３０／３７）。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交中，与所用探针ＤＮＡ的内切酶ＰｓｔⅠ酶切图谱比较，有４６％（１３／２８）与ＨＰＶ－１６ＤＮＡ的酶切图谱相同，可定为ＨＰＶ－１６型。当用ＨＰＶ－１１探针时无一例出现与ＨＰＶ－１１相同的图谱。提示喉癌的发生与ＨＰＶ－１６有关。     

口腔颌面外科学

口腔颌面外科学邱蔚六一、颌面肿瘤人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ）与口腔癌发生的关系又引起了人们的兴趣。以放射性核素３２Ｐ标记ＨＰＶ１１，ＨＰＶ１６和ＨＰＶ１８ＤＮＡ探针，用核酸斑点杂交法检测了部分口腔癌的ＨＰＶ相关序列。３种探针总和的检测结果证明：１２例口腔...     

用PCR和地高辛标记的核酸杂交技术检测女性下生殖道人乳头瘤病毒感染

应用多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）和地高辛标记的ＨＰＶＤＮＡ的斑点及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交３种方法，同时检测了１７例外阴和宫颈湿疣的标本。检测结果表明ＰＣＲ结合地高辛标记的斑点杂交技术是目前检测女性下生殖道人乳头瘤病毒ＨＰＶ感染较为敏感、特异、简便的分子生物学方法。因杂交中所使用的ＨＰＶＤＮＡ探针为非放射性标记的，弥补了３２Ｐ标记探针的缺点，可制成试剂盒在临床推广、应用。从而为临床对ＨＰＶ感染的诊断提供一条有效的检测方法。     

地高辛标记探针与生物素标记探针用于斑点杂交检测HBV DNA的初步研究

为研究地高辛标记和生物素标记核酸探针斑点杂交检测ＨＢＶ ＤＮＡ的敏感性、特异性和稳定性，用两种探针和＾３２Ｐ标记探针进行平行检测对照。结果表明，地高辛探针检测灵敏度为０．１Ｐｇ，已达到＾３２Ｐ标记探针水平。生物素探针为１￣１０Ｐｇ。两种探针与＾３２Ｐ标记探针相比。符合率分别９６．６５％和８９．１３％；敏感性分别为９４．４４％和８３．３３％；特异性分别为９６．４３％和９２．８６％。两种探针在－２０℃     

复发尖锐湿疣皮损内HPVDNA的PCR的检测

目的：检测复发光湿疣皮损表皮和真皮内的人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）ＤＮＡ，探讨其反复复发的原因。方法：对取自１６例复发尖锐湿疣（ＲＣＡ）患者的１６个皮损组织，用溴化的钠溶液分离表皮和真皮，从组织中提取的ＤＮＡ和溴化钠分别用聚合酶链反应ＨＰＶＤＮＡ，阳性病例采用地高辛标记的型特异性寡核苷酸探针斑点杂交法进行盼型。结果：１６例ＲＣＡ表皮内均检出了ＨＰＶＤＮＡ，ＨＰＶ。阳性占６２．５％，ＨＰＶ１１阳生占２５．     

PCR结合核酸分子杂交放射自显影检测HPV16,18实验条件的研究

为建立一种快速、简便、高敏感性和特异性的检测消化道肿瘤组织中ＨＰＶ１６，１８ＤＮＡ序列的方法，用ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６早期区Ｅ６的１２０ｂｐ片段和扩增ＨＰＶ１８Ｅ６、Ｅ７区２６７ｂｐ片段，扩增产物与相应的５′－末端Ｐ３２标记的特异性寡核苷酸探针进行斑点杂交放射性自显影。探讨了影响ＰＣＲ和杂交的关键因素，从中选出较佳的反应条件：即ＰＣＲ退火温度及杂交温度均为５５℃，反应缓冲液镁离子浓度为１．５ｍｍｏｌ／Ｌ，引物浓度各为５０ｐｍｏｌ／１００μｌ，探针浓度各为１．０ｐｍｏｌ／ｍｌ，杂交时间３ｈ，放射性自显影时间２４ｈ。在上述条件下，该方法可检出低至０．０１ｆｇ的ＨＰＶ１６或ＨＰＶ１８质粒ＤＮＡ，ＨＰＶ１６与ＨＰＶ１８之间无交叉反应，为进一步探讨ＨＰＶ与消化道肿瘤的关系奠定了基础。     

应用聚合酶反应制备HBV DNA生物素探针

通过聚合酶链反应将Ｂｉｏ－１１－ｄｕＴＰ掺入扩增的ＨＢＶ ＤＮＡ中，制备了长度为１２０ｂｐ的生物素探，检测到０．１ｐｇ的ＨＢＶ ＤＮＡ。ＰＣＲ标记法简便迅速，特异性，用ＤＮＡ量少且无需分离纯化，其标记探针得率高，活性强。     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针的制备

通过大量培养克隆有 HPV11、16、18、51型 DNA 序列的菌株,扩增其质粒,并采用碱变性法提取、纯化质粒 DNA,然后对质粒进行酶切、电泳回收 HPV DNA 片段并进行生物素标记,制备出生物素标记的 HPV11、16、18、51型 DNA 探针.用斑点杂交方法检测探针的灵敏度为 HPV11、16型0.05pg,HPV18 0.25 pg,HPV51 0.1 pg.     

用PCR和地高辛标记的核酸杂交技术检测女性下生殖道人乳头瘤病毒感染

应用多聚酶链反应(polymerase chain reaction)和地高辛标记的HPVDNA的斑点及Southernblot杂交3种方法,同时检测了17例外阴和宫颈湿疣的标本.检测结果表明PCR结合地高辛标记的斑点杂交技术是目前检测女性下生殖道人乳头瘤病毒HPV感染较为敏感、特异、简便的分子生物学方法.因杂交中所使用的HPVDNA探针为非放射性标记的,弥补了³²P标记探针的缺点,可制成试剂盒在临床推广、应用.从而为临床对HPV感染的诊断提供一条有效的检测方法.     

中国妇女宫颈癌组织中HPV_(16)L_1晚期基因克隆及重组质粒的构建

本实验采用ＰＣＲ方法，以中国妇女宫颈癌组织ＤＮＡ为模板扩增出了３株ＨＰＶ１６Ｌ１晚期基因ＤＮＡ片段，扩增参数为９４℃１ｍｉｎ，５５℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环。将扩增产物ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ片段与克隆载体ｐＣＲ２．１连接构建了ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＣＲ２．１重组质粒。经酶切ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＣＲ２．１重组质粒回收ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将其与表达载体ｐＰＩＣ３．５连接，构建了ＨＰＶ１６Ｌ１－ｐＰＩＣ３．５重组体，并经酶切鉴定得到确认。为进一步对感染型ＨＰＶ１６Ｌ１晚期基因的测序及表达打下了基础。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

血管内皮生长因子的基因克隆与表达

目的　构建编码正反义血管内皮生长因子 1 65(vascularendothelialgrowthfactor 1 65 ,VEGF1 6 5)的真核表达质粒 ,观察质粒转染体外培养的人脐静脉血管内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)后 ,靶细胞VEGF的分泌及细胞生长速度是否发生改变。方法　RT PCR从人胚胎肾组织中获hVEGF1 6 5的cDNA片段 ,构建编码正反义hVEGF1 6 5真核表达质粒 (pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5及 pCR3 .1 /VEGF1 6 5) ,通过脂质体介导将质粒转入HU VEC细胞 ,ELISA测定转染后细胞VEGF的分泌量 ,设空载体组及未转染的细胞为对照。筛选稳定表达外源基因的细胞克隆 ,在相差显微镜及透射电镜下观察转染后细胞形态是否发生变化 ,MTT方法检测细胞生长曲线是否有改变。结果　DNA测序结果 ,获得重组质粒pCR3 .1 /anti VEGF1 6 5与pCR3 .1 /VEGF1 6 5所携带的外源基因序列与文献报道的基本一致。质粒转染后靶细胞形态均无明显变化 ,仅在透射电镜下观察到与蛋白质合成相关的细胞器结构发生了相应的改变。反义VEGF转染明显降低靶细胞VEGF的分泌量 ,抑制率为 67.7% (P <0 .0 1 ) ,同时细胞生长速度明显减慢 (P <0 .0 5)。而转入正义基因的细胞VEGF的分泌量则能明显提高 ,与空白对照组比较增长率为984.8% (P <0 .0 1 ) ,细胞生长速     

应用70mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法 酵母经常规培养，抽提mRNA逆转录成cDNA后，经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段，根据目的基因SSAl设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记，与oligo阵列杂交，洗脱，扫描：然后进行杂交后剥除．收集剥除液．采用限制性通用引物扩增，产物克隆于PUC18T载体中，并转化至JM109大肠杆菌中培养，抽提质粒，进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明，用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因，而无需构建cDNA文库。另外，本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段,并进行克隆、测序分析,制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法利用Oligo6.4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物,纯化PCR扩增产物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定,提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明,所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。