人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析

目的：克隆出正确的人源性角质细胞生长因子（KGF）并探讨影响其表达的因素。方法：应用RT－PCR技术克隆出KGF基因，并用pBV220表达质粒对其进行表达，然后用RNAdraw对其RNA进行分析。结果：带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10％左右，而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1％－2％；利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构，而后者则形成了茎环结构，结论：KGF基因在细菌中表达量较低，信号肽是影响其表达量的重要因素。     

胶原沉积抑制因子cDNA的分子克隆及其在大肠杆菌DH5α的表达

目的：获取胶原沉积抑制因子（Deeorin）互补脱氧核糖核酸（cDNA）并在大肠杆菌DH5α中表达出成熟蛋白。方法：用巢式逆转录聚合酶链反应（nest-RT-PCR）法从体外培养的成纤维细胞（2BS）中获取Deeorin cDNA，克隆入pMD18-T载体。测序后，将成熟蛋白区亚克隆入pGEX-4T-1中，用PCR法、限制性酶切和测序对融合克隆进行鉴定。经过鉴定的融合克隆在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：获取的1181bp的Decorin cDNA片段与基因bank中收录的序列相似性达99．75％：可从GST-Deeorin成熟蛋白cDNA融合克隆中扩增出和酶切出1005bp的目的片段；融合克隆有完整的开放阅读框架；融合蛋白在大肠杆菌DH5α中成功表达。结论：获取了Decorin cDNA并在大肠杆菌DH5α中表达出GST-Deeorin成熟蛋白。     

KGF-2与PRO2605蛋白相互作用的初步研究

目的：利用酵母双杂交系统筛选KGF-2的相互作用蛋白，为阐明其分子作用机制提供有益线索。方法：通过聚合酶链反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2，并对其自身转录激活活性进行鉴定，利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库，挑选双阳性克隆。将KGF-2和候选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中，共同转染COS-7细胞，通过CAT分析验证KGF-2和候选蛋白之间的相互作用。结果：VDNA序列分析和同源检索显示所获候选蛋白为PR02605。以KGF-2和PRO2605 cDNA共转化酵母宿主Y190后可激活报道基因，但共转染COS-7细胞后，CAT分析结果阴性。结论：KGF-2和PRO2605在酵母体内存在相互作用，但在COS-7细胞中未能检测到两者的相互作用。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的：在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3)。方法：从pGE-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因，插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体，转化E．coli DH5α宿主菌，进行IPTG诱导，诱导菌经超声裂解后获得包涵体，包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白，再经凝血酶切割。获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果：以与GST融合表达的方式，运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3，融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使删释放出来，其对金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/ml；对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论：采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。     

一种热稳定人成纤维细胞生长因子突变体原核表达及活性鉴定

目的原核系统可溶性地表达一种热稳定性的人角质细胞生长因子-2（human keratinocyte growth factor-2,hKGF-2）并鉴定其生物活性。方法通过重叠PCR方法进行定点突变,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2突变体的核酸序列并克隆至原核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。分别检测重组KGF-2及其突变体重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。结果 KGF-2及其突变体具有相同的促Hep-2细胞的增殖能力。室温状态下48 h内,rhKGF-2出现明显降解现象而rhKGF-2突变体几乎没有出现降解,表现出强的热稳定性。结论 KGF-2突变体具有天然KGF-2的生物活性,但其热稳定性明显优于天然KGF-2蛋白,为进一步研究KGF-2的结构和功能奠定了一定的基础。     

寻常型天疱疮自身抗原Dsg3片段的重组表达和免疫识别

探讨寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris,PV)自身抗原桥粒芯蛋白3（desmoglein 3,Dsg3)的抗原决定簇，为自身免疫性疾病机制的研究提供依据。根据Gene Bank中的Dsg3序列分析，采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）法克隆自身抗原Dsg3 E1、E2、E3、E4、E5多肽片段的cDNA，定向插入表达载体pGEX-2T，并且导入大肠杆菌JM109中表达重组融合蛋白，经免疫印迹法与PV患者及疾病对照组、正常对照组血清进行反应。结果显示，Dsg3 E1、E2和E4与PV患者血清反应，而不与疾病对照组、正常对照组血清反应。不同患者抗原优势表位有所不同。研究表明，Dsg3 E1、E2和E4表位在PV发病中起重要作用。     

重组肉毒毒素E(BoNT/E)重链C端的表达、纯化及其抗原性分析

目的：克隆、表达并纯化肉毒毒素E重链C端(BoNT／EHC2)保护性抗原片段，为BoNT／E的抗体制备和检测方法的建立奠定基础。方法：采用PCR扩增BoNT／EHc2基因，插入表达载体pET28a，转化E．coli BL2l(DE3)pLysS获得表达工程菌株，并对诱导表达条件和纯化条件进行优化。利用Western印迹和间接ELISA方法鉴定rBoNT／EHc2的抗原性。结果：表达工程菌pEq28a-EHC2／BL21(DE3)pLysS于37℃用0．2mmol／L IPTG诱导6h，表达的目的蛋白可以达到全茵蛋白的37．9％。经过固定化金属螯合亲和层析一步纯化，rBoNT／EHC2的纯度可达95％以上。Western印迹和间接ELISA显示其具有良好的抗原性。结论：首次克隆、表达并纯化了BoNT／EHC2片段，并可被抗天然BoNT／E马血清所识别，为制备相应的抗体及建立快速检测方法做好了准备。     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白的表达和纯化

目的 克隆人血管能抑素canstatin基因,构建其原核表达载体,表达并纯化出canstatin蛋白。方法 从人胎盘组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增出canstatin基因,克隆进质粒pUCm-T,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-22b( )相应位点,转化E.coli BL21,IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体,Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白。结果 从人胎盘组织中提取总RNA,显示3条清晰条带,分别对应28S,18S,5S,分光光度计法测得总RNA浓度为1．8g／L;RT-PCR扩增出与预期目的基因canstatin长度一致的cDNA片段;构建出克隆质粒pUCm-T／canstatin,基因测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致;构建出表达质粒pET-22b( )／canstatin,BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实构建正确;IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24kD左右出现新的蛋白表达条带,诱导后1h、2h、3h、4h表达蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为18．2％、18．8％、23．0％和23．4％;诱导3h的菌体超声破碎后,Ni柱亲和层析,125、250mmol／L眯唑洗脱液SDS-PAGE电泳显示出清晰的单一条带。结论 成功克隆出canstatin基因,成功构建了其原核表达载体,并且成功表达、纯化出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。     

纤连蛋白的分段表达及与乙肝表面抗原相互作用研究

目的:克隆纤连蛋白(fibronectin)各功能区域基因,在大肠杆菌中表达以筛选与HBsAg相互作用的区域.方法:将纤连蛋白分成7个片段,设计引物,利用RT-PCR从HepG2.2.15中扩增出相应的PCR产物,连接到表达载体pGEX4T-1中,用IPTG诱导目的蛋白在E.coli中表达,通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定.融合蛋白纯化后制备蛋白芯片,与HBsAg杂交,筛选纤连蛋白中与HBsAg相互作用的区域.结果:经RT-PCR从HepG2.2.15中扩增到各结构域片段的cDNA,序列分析均正确;SDS-PAGE分析表明,各结构域片段的可溶性表达产物均占细菌可溶性蛋白的10%以上;Western印迹分析提示,诱导表达产物可与GST单抗发生特异性反应.经制备蛋白芯片并杂交,发现片段FN1、FN2信号最强.结论:成功地表达了纤连蛋白各片段,蛋白芯片杂交结果显示纤连蛋白可能是通过Ⅱ型肝素结合区及其羰基端(c端)与HBsAg相互作用.     

人宫颈癌HPC2基因的克隆及其原核和真核表达载体的构建

目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。     

HCCR-2基因的克隆及原核表达

目的:克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a( )表达载体中,构建HCCR-2表达载体,IPTG诱导表达1~5h,做SDS-PAGE分析,鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果:DNA测序证明,获得了HCCR-2基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,HCCR-2蛋白获得高效表达,其相对分子质量为39kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。     

重组人KGF-2的制备及生物学活性研究

目的:实现重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)的原核可溶性高效表达,并获得活性良好的重组蛋白.方法:将编码人成熟KGF-2的cDNA构建至pET/21a表达载体中,利用大肠杆菌BL21进行表达,对表达条件(如诱导温度和诱导时间等)进行优化,并对目的蛋白的表达情况进行电泳分析;利用阳离子交换柱对重组蛋白进行纯化,对纯化的rhKGF-2利用MTT法检测其促IEC-6及NIH/3T3细胞的增殖活性.结果:通过对表达条件的优化,rhKGF-2的表达量可占到全菌总蛋白的25%,并且基本上全部为可溶性形式表达;利用阳离子交换柱对rhKGF-2进行纯化,薄层扫描分析其纯度高于90%.利用MTT法对rhKGF-2的活性进行研究,结果表明,低浓度的rhKGF-2就能够促进IEC-6细胞增殖,但对于NIH/3T3细胞需高浓度的rhKGF-2才能促进其增殖.结论:本研究实现了对rhKGF-2的可溶性高效表达,纯化后的rhKGF-2具有较好的活性,这为进一步的功能研究以及基因工程重组药物的开发奠定了基础.     

东部马脑炎病毒E2基因的克隆与表达

目的 :克隆表达东部马脑炎病毒 (easternequineencephalomyelitisvirus ,EEEV)E2基因 ,研究重组蛋白的抗原性 ,为研制东部马脑炎病毒基因工程诊断试剂奠定基础。方法 :由病毒感染的鼠脑制备总RNA ,利用RT_PCR技术扩增EEEVE2基因全长序列 ,并将其克隆至pGEM_Teasy载体测序 ,再将E2基因克隆至谷胱甘肽转移酶 (GST)融合表达载体pGEX_5x_2中表达。采用免疫印迹试验 (Westernblotting)和ELISA法分析表达的重组蛋白的抗原性。结果 :经过RT_PCR扩增和测序 ,证明得到的E2基因片段的序列是正确的 ,并且在原核载体中得到表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白的 2 4 .5 % ,主要以包涵体形式存在。Western印迹分析表明GST_E2蛋白有良好的抗原性 ;包涵体经Tri tonX_10 0 ,1mol L和 2mol L尿素洗涤 ,初步纯化后 ,用表达的E2融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA法 ,结果表明与兔抗EEEV血清起特异反应 ,但与兔抗WEEV血清无交叉反应。结论 :东方马脑炎病毒的E2基因在大肠杆菌中得到稳定表达 ,表达的GST_E2蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,为从分子水平上对EEEVE2蛋白的功能性研究和发展EEEV基因工程诊断试剂奠定了基础     

胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213,制备高纯度的GCRG213蛋白。方法 采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果 SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约29．4kD的Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白的28．7％。经凝胶回收法得到纯度近1009,5的蛋白产品。结论 在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin,／GCRG213融合蛋白,并制备出高纯度蛋白产品,为后续的功能研究及其抗体研制奠定了基础。     

人睫状神经营养因子的克隆与原核表达

目的：克隆人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，并探索其在大肠杆菌中高效表达。方法：提取总ＲＮＡ，逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），序列测定正确后原核表达并用制备电泳纯化。结果：克隆了人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达量至少达到２６％，制备电泳纯化后，重组蛋白纯度达到９５％。结论：从胎儿坐骨神经组织中克隆到人睫状神经营养因子基因ｃＤＮＡ，制备电泳纯化出高纯度的重组蛋白     

人心肌肌钙蛋白I第2和第4个密码子同义突变对其在大肠埃希菌中表达的影响

目的 对人心肌肌钙蛋白I（cTnI）基因实行定点突变并进行原核表达，观察此突变对cTnI表达量的影响。方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，设计引物将其第2和第4个密码子突变后插入原核表达载体形成重组体，并导人宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot鉴定，观察突变对cTnI表达的影响。结果 突变后的cTnI基因与对照组相比在大肠埃希菌中得到高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。结论 成功克隆了cTnI基因，所设计的同义突变可促进cTnI在大肠埃希菌中的高效表达。