酸性肽对大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子水平的影响

背景：神经生长因子和脑源性神经因子对神经细胞的存活和增殖非常重要。阿尔茨海默病患者的神经生长因子和脑源性神经因子水平均较低。目的：探讨酸性肽能否增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。设计：随机对照动物实验。单位：郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料：实验于2003—09／2005—05在郑州大学生物活性肽研究所第一实验室和郑州大学基础医学院细胞培养中心完成。选取出生后2d内的SD乳鼠15只作为实验对象。方法：①将SD乳鼠在无菌条件下断头取出大脑皮质部分，进行星形胶质细胞的纯化培养，采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定星形胶质细胞。②将培养的星形胶质细胞随机分为6组：空白对照组、血清对照组、阳性对照组、酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组。空白对照组不施加任何实验因素，血清对照组加入体积分数为0．2的血清，阳性对照组加入1000U／mL干扰素，酸性肽治疗组则分别加入37．5，75，150mg／L的酸性肽。③将长满瓶底的第2代星形胶质细胞消化成单细胞悬液，以5&;#215;10^5mL等量接种于3块12孔培养板中。各组均于培养24，48，72h各时间点测定细胞存活率、细胞上清液中和细胞内神经生长因子及脑源性神经因子含量。主要观察指标：①不同培养时间各组细胞计数和存活率的检测结果。②酸性肽对大鼠星形胶质细胞增殖的影响。③不同培养时间各组星形胶质细胞上清液中神经生长因子及脑源性神经因子含量的变化。结果：①与空白对照组比较，酸性肽75，150mg／L治疗组细胞计数和细胞存活率在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．05，0．01，0．001）；酸性肽37．5mg／L治疗组虽有所增加但不明显。②与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞增殖率均显著升高（0，17．5％，45．5％，72．5％，P〈0．001）。③与空白对照组比较，酸性肽37．5，75，150mg／L治疗组细胞上清液中神经生长因子的吸光度值在培养24，48，72h时均明显增加（P〈0．001）；除了在培养24h时间点酸性肽37．5mg／L治疗组不能增加星形胶质细胞分泌脑源性神经因子外，其他各浓度酸性肽治疗组在培养24，48，72h时脑源性神经因子的吸光度值均显著提高（P〈0．05，0．001）。结论：酸性肽能够不同程度地增加大鼠星形胶质细胞分泌神经生长因子和脑源性神经因子。     

半乳糖凝集素-1对低氧去血清培养星形胶质细胞表达和分泌BDNF的影响

目的：研究不同浓度半乳糖凝集素-1（Gal-1）对低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌脑源性神经营养因子（BDNF）的影响。方法：建立星形胶质细胞原代培养,设定10mg／L Gal—1组、1mg／L Gal-1组、0．1mg／LGal-1组和对照组分别予以10、1、0．1、0mg／LGal-1干预并进行低氧去血清培养,在低氧去血清培养1h、3h、6h、12h、1d、3d时通过RT—PCR、Western blotting、ELISA检测星形胶质细胞BDNFmRNA、蛋白的表达水平和培养上清液中细胞分泌的BDNF的浓度。结果：与对照组比较,10mg／L Gal—1组低氧去血清培养3h～1d星形胶质细胞合成BDNF持续增加,6h～3d星形胶质细胞分泌BDNF明显增多,均以6h时最为明显;1mg／L Gal-1组低氧去血清培养12h--1d星形胶质细胞合成BDNF明显增加,但分泌BDNF没有明显变化;0．1mg／L Gal-1组对低氧去血清培养各时问点星形胶质细胞表达和分泌BDNF均无明显变化。结论：10mg／L Gal-1能有效促进低氧去血清培养的星形胶质细胞表达和分泌BDNF;Gal-1可能通过此途径在脑缺血后起到神经保护作用。     

小分子量透明质酸促进星形胶质细胞中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的表达

背景:国外研究表明透明质酸可以促进脊髓损伤后大鼠运动功能的改善,但其机制尚不清楚。目的:观察透明质酸对星形胶质细胞营养因子表达的影响。方法:无菌条件下分离SD大鼠脑组织星形胶质细胞进行原代培养,对培养第3代细胞采用免疫化学方法对其鉴定。对第4代细胞给予透明质酸(相对分子质量125000～175000)作用星形胶质细胞24h,并设置对照组。结果与结论:免疫化学方法鉴定原代培养星形胶质细胞阳性率近100%。Westernblot和RT-PCR分析结果显示,胶质细胞在质量浓度100,1000mg/L透明质酸作用下同10,1mg/L透明质酸组和对照组比较,脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子表达明显升高(P<0.05);免疫荧光双标显示在质量浓度1000mg/L透明质酸作用下,同对照组相比,胶质细胞脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子表达明显增加。证实小分子量透明质酸可上调星形胶质细胞中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的表达。     

黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

背景:实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例.但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚.目的:分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟.设计、时间及地点:细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成.材料:取孕14 d SD大鼠,用以分离培养神经干细胞.方法:利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养.用含有10 μmol/L黄芩苷的培养基作用 7 d,并设置空白对照组.以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞.主要观察指标:应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子mRNA表达的影响.结果:与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例(P<0.05).与星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷对β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无明显影响(P>0.05).与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例(P<0.01).黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48 h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01);作用72 h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达(P<0.01).结论:黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关.     

表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导体外培养大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的影响

目的:获得大量神经干细胞并且能够控制其向神经元定向分化可为进一步修复损伤大脑和治疗退行性神经系统疾病奠定种子细胞基础,实验观察了表皮生长因子对脑源性神经生长因子诱导神经干细胞向神经元分化过程中的影响.方法:实验于2007-08在中国医科大学神经解剖研究室完成.①材料:清洁级雄性成年SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 μ m时,滴加DMEM/F12 2?7 20μg/L表皮生长因子 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 条件培养液(细胞原代培养第7天的上清液的过滤液),进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、表皮生长因子组、脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组.空白对照组培养液为含体积分数0.1胎牛血清的DMEM/F12,其余3组培养液在此基础上分别加入各自对应的细胞因子培养1周,表皮生长因子浓度为20 μg/L,肺源性神经生长因子浓度为50 μg/L.③实验评估:传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定.计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况.结果:①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,表皮生长因子组有所降低:脑源性神经生长因子组、表皮生长因子 脑源性神经生长因子组均明显提高(t=2.309～2.779,P＜0.05),且后者提高幅度尤为显著(t=2.309,P＜0.05).结论:表皮生长因子可以提高脑源性神经生长因子诱导成年大鼠脑海马神经干细胞向神经元分化的比例.     

脂多糖对星形胶质细胞增殖和细胞内钙离子水平及活性氧与一氧化氮释放的影响

背景:星形胶质细胞是中枢神经系统中分布最广泛的细胞之一,但其在中枢神经退行性疾病中的作用目前尚未明确。目的:观察脂多糖对星形胶质细胞内钙离子、活性氧、一氧化氮水平和细胞存活率的影响。设计:观察对比实验。单位:苏州大学附属第二医院脑循环研究室。材料:实验于2005-05/2005-08在苏州大学附属第二医院脑循环研究室完成,选择8只新生1～3d内SD乳鼠,雌雄不限,由苏州大学动物中心提供,[许可证号:SYXK(苏)2002-0037];脂多糖(Sigma公司),MTT和一氧化氮测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。方法:参照KevinSt.McNaught等人的方法体外分离培养新生大鼠皮质星形胶质细胞,经反复传代培养和纯化后,根据加入脂多糖剂量的不同将星形胶质细胞分为5组:空白对照组、脂多糖5mg/L组、脂多糖10mg/L组、脂多糖20mg/L组和脂多糖40mg/L组,脂多糖对星形胶质细胞的作用时间为30min和60min。MTT法测脂多糖作用细胞30min和60min细胞存活率;Griess法测量脂多糖作用细胞30min上清液一氧化氮的含量;采用激光共聚焦显微镜观察不同剂量脂多糖作用细胞30min对离体大鼠星形胶质细胞内钙离子、作用细胞60min时活性氧水平的影响,采用相对荧光强度百分比表示星形胶质细胞内钙离子浓度的变化及细胞释放活性氧的水平。主要观察指标:各组星形胶质细胞存活率;星形胶质细胞上清液中一氧化氮的含量;激光共聚焦显微镜下星形胶质细胞内游离钙和活性氧水平的变化。结果:①脂多糖作用星形胶质细胞60min时,脂多糖5mg/L,10mg/L,20mg/L组的细胞存活率均升高,与对照组相比差异均有显著性(P<0.05),脂多糖10mg/L组的细胞存活率高于脂多糖5mg/L组和脂多糖20mg/L组。②脂多糖40mg/L作用细胞30min后引起一氧化氮水平的升高,与对照组和其余3个剂量组相比差异有显著性(P<0.05)。③脂多糖5mg/L,10mg/L,20mg/L组细胞内游离钙的相对荧光强度是其相应的基础状态的200～400倍,脂多糖40mg/L组的荧光强度是其相应的基础状态的1000倍作用;④脂多糖5mg/L,10mg/L组,20mg/L组的活性氧水平是其基础状态的200～300倍,而脂多糖40mg/L组的绝对荧光强度峰超过了检测的范围,推测脂多糖40mg/L组的活性氧水平至少是相应基础状态的300～400倍。结论:脂多糖作用于星形胶质细胞后可使其胞钙离子浓度升高,活性氧和一氧化氮释放增加,促进细胞增殖。     

甲泼尼龙琥珀酸钠对许旺细胞分泌功能的影响

背景:许旺细胞分泌多种神经营养因子在神经再生中发挥关键作用,但其分泌能力受诸多因素影响,寻找可行方法促进许旺细胞分泌神经生长因子是神经缺损后再生的重要环节.目的:观察不同浓度甲泼尼龙琥珀酸钠对许旺细胞分泌功能的影响.方法:酶消化法分离培养SD乳鼠许旺细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况;传代后,一部分进行S-100蛋白免疫鉴定许旺细胞的纯度;另一部分用细胞计数板调整细胞浓度为1×10~9 L~(-1),移入到6孔平底培养板(接种15个孔)继续培养.培养板中培养4 d后4个孔分别加入不同浓度的甲泼尼龙琥珀酸钠(10~(-3),10~(-4),10~(-6),10~(-8) mol/L),并设立1个孔为不加药物的空白对照组,分别作用于细胞24,48,72 h后行RT-PCR检测,观察许旺细胞24,48,72 h神经生长因子mRNA水平的变化.结果与结论:原代细胞培养至第7天数量明显增加,细胞铺满培养瓶底部80%以上;传代细胞形态为梭形,有2个细长的突起,荧光染色阳性,成纤维细胞为圆形或扁圆形,荧光染色阴性.RT-PCR检测结果显示,10~(-8) mol/L的甲基强地松龙作用72 h分泌的神经生长因子与空白对照组及其他浓度、时间组相比均表达增加(P < 0.05);10~(-3) mol/L甲基强地松龙在各时间段分泌的神经生长因子与空白对照组及其他浓度、时间组相比表达均减少(P < 0.05).提示高浓度的甲泼尼龙琥珀酸钠抑制许旺细胞分泌神经生长因子,长时间、低浓度的甲泼尼龙琥珀酸钠则促进许旺细胞分泌神经生长因子.     

骨髓基质细胞移植缺血性脑梗死大鼠后神经营养因子的表达

背景:骨髓基质细胞在适宜条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,分泌可溶性分子促进神经元存活。目的:观察骨髓基质细胞移植后缺血性脑梗死大鼠脑组织神经营养因子表达情况及其对神经功能的影响。方法:改良的Longa栓线法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,1h后再灌注,24h后治疗组尾静脉注射3×106骨髓基质细胞,盐水对照组尾静脉注射1mL生理盐水,空白对照组不进行注射。结果与结论:在梗死后第7,14天治疗组的神经损伤评分明显低于对照组(P<0.05);治疗组神经生长因子和脑源性神经营养因子表达在各时间点均高于对照组(P<0.05)。结果显示静脉移植骨髓基质细胞可改善缺血性脑梗死大鼠神经功能,移植骨髓基质细胞后缺血脑组织中神经生长因子及脑源性神经营养因子表达促进了神经功能的恢复。     

骨髓基质细胞移植缺血性脑梗死大鼠后神经营养因子的表达

背景：骨髓基质细胞在适宜条件下可分化为神经元和星形胶质细胞,分泌可溶性分子促进神经元存活。目的：观察骨髓基质细胞移植后缺血性脑梗死大鼠脑组织神经营养因子表达情况及其对神经功能的影响。方法：改良的Longa栓线法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,1h后再灌注,24h后治疗组尾静脉注射3×106骨髓基质细胞,盐水对照组尾静脉注射1mL生理盐水,空白对照组不进行注射。结果与结论：在梗死后第7,14天治疗组的神经损伤评分明显低于对照组（P〈0.05）;治疗组神经生长因子和脑源性神经营养因子表达在各时间点均高于对照组（P〈0.05）。结果显示静脉移植骨髓基质细胞可改善缺血性脑梗死大鼠神经功能,移植骨髓基质细胞后缺血脑组织中神经生长因子及脑源性神经营养因子表达促进了神经功能的恢复。     

脂多糖对星形胶质细胞增殖和细胞内钙离子水平及活性氧与一氧化氮释放的影响

背景：星形胶质细胞是中枢神经系统中分布最广泛的细胞之一，但其在中枢神经退行性疾病中的作用目前尚未明确。 目的：观察脂多糖对星形胶质细胞内钙离子、活性氧、一氧化氮水平和细胞存活率的影响。 设计：观察对比实验。 单位：苏州大学附属第二医院脑循环研究室。 材料：实验于2005-05／2005-08在苏州大学附属第二医院脑循环研究室完成，选择8只新生1～3d内SD乳鼠，雌雄不限，由苏州大学动物中心提供，[许可证号：SYXK（苏）2002—0037]；脂多糖（Sigma公司），MTT和一氧化氮测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）。 方法：参照Kevin St．McNausat等人的方法体外分离培养新生大鼠皮质星形胶质细胞，经反复传代培养和纯化后，根据加入脂多糖剂量的不同将星形胶质细胞分为5组：空白对照组．脂多糖5mg／L组、脂多糖10mg／L组、脂多糖20mg／L组和脂多糖40mg／L组，脂多糖对星形胶质细胞的作用时间为30min和60min。MTT法测脂多糖作用细胞30min和60min细胞存活率；Griess法测量脂多糖作用细胞30min上清液一氧化氮的含量；采用激光共聚焦显微镜观察不同剂量脂多糖作用细胞30min对离体大鼠星形胶质细胞内钙离子、作用细胞60min时活性氧水平的影响，采用相对荧光强度百分比表示星形胶质细胞内钙离子浓度的变化及细胞释放活性氧的水平。 主要观察指标：各组星形胶质细胞存活率；星形胶质细胞上清液中一氧化氮的含量；激光共聚焦显微镜下星形胶质细胞内游离钙和活性氧水平的变化。 结果：①脂多糖作用星形胶质细胞60min时，脂多糖5mg／L，10mg／L，20mg／L组的细胞存活率均升高，与对照组相比差异均有显著性（P〈0．05），脂多糖10mg／L组的细胞存活率高于脂多糖5mg／L组和脂多糖20mg／L组。②脂多糖40mg／L作用细胞30min后引起一氧化氮水平的升高，与对照组和其余3个剂量组相比差异有显著性（P〈0．05）。③脂多糖5mg／L，10mg／L，20mg／L组细胞内游离钙的相对荧光强度是其相应的基础状态的200～400倍，脂多糖40mg／L组的荧光强度是其相应的基础状态的1000倍作用；④脂多糖5mg／L，10mg／L组，20mg／L组的活性氧水平是其基础状态的200～300倍，而脂多糖40mg／L组的绝对荧光强度峰超过了检测的范围，推测脂多糖40mg／L组的活性氧水平至少是相应基础状态的300～400倍。 结论：脂多糖作用于星形胶质细胞后可使其胞钙离子浓度升高，活性氧和一氧化氮释放增加，促进细胞增殖。     

酸性肽对阿尔茨海默病模型大鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸受体、神经生长因子和β淀粉样蛋白水平的调节作用

背景:一些研究已经证实酸性肽对痴呆模型大鼠有良好的治疗作用,但其发挥作用的途径尚需探讨。目的:观察酸性肽能否抑制阿尔茨海默病大鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸受体和淀粉样β蛋白的产生以及促进神经生长因子的产生和分泌。设计:随机对照动物实验。单位:郑州大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2005-03/2006-05在郑州大学生物活性肽研究所第一实验室和郑州大学基础医学院细胞培养中心完成。选取10周龄的健康且经Y-迷宫测定无痴呆症状的雄性SD大鼠70只,单纯随机分为7组,正常对照组、模型组、生理盐水组、谷氨酸0.3g/kg组、酸性肽15,30,60mg/kg组,每组10只。方法:正常对照组不干预,其他6组用鹅膏蕈氨酸损毁大鼠双侧迈内特基底核,建立阿尔茨海默病病的动物模型,造模后谷氨酸0.3g/kg组灌胃谷氨酸0.3g/kg,酸性肽15,30,60mg/kg组灌胃相应剂量酸性肽(自制),生理盐水组灌胃等量生理盐水,1次/d,2mL/次,连续20d。主要观察指标:①灌胃期满后各组大鼠即做Y-迷宫实验以检测大鼠的学习记忆能力,以正确反应次数为指标。②学习记忆测试结束后,各组大鼠断头取脑,免疫组化染色,再用BiosensDigitalImagingSystem灰度扫描仪扫描以检测大鼠脑内神经生长因子、N-甲基-D-天冬氨酸受体、淀粉样β蛋白的水平。结果:70只大鼠全部进入结果分析。①Y-迷宫实验中正确反应次数:其他6组均低于正常组(P<0.01);酸性肽30,60mg/kg组高于模型组、生理盐水组、谷氨酸0.3g/kg组及酸性肽15mg/kg组(P<0.01)。②基底前脑神经生长因子灰度值:模型组、生理盐水组、谷氨酸0.3g/kg组及酸性肽15mg/kg组低于正常对照组(69.60±2.41,69.62±1.46,69.62±1.46,69.73±1.87,80.77±2.72,P<0.01),酸性肽30,60mg/kg组与正常对照组比较差异不显著(79.39±2.23,80.20±1.7,P>0.05),但高于其他几组。③大脑皮质N-甲基-D-天冬氨酸受体和淀粉样β蛋白表达的灰度值:模型组、生理盐水组、谷氨酸0.3g/kg组及酸性肽15mg/kg组高于正常对照组(N-甲基-D-天冬氨酸受体:81.01±1.38,81.31±2.06,81.37±1.39,79.38±1.23,69.50±1.04;淀粉样β蛋白:74.26±1.39,74.89±8.66,74.88±1.46,74.16±2.48,67.40±3.06,P<0.01),酸性肽30,60mg/kg组与正常对照组比较差异不显著(N-甲基-D-天冬氨酸受体:70.55±2.89,69.78±1.24;淀粉样β蛋白:67.66±2.25,67.58±2.21,P>0.05),但低于其他几组。结论:30,60mg/kg的酸性肽能明显改善阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆能力,其治疗作用途径可能是通过上调基底前脑中的神经生长因子水平,下调大脑皮质中N-甲基-D-天冬氨酸受体和β淀粉样蛋白的水平实现的。     

联合应用碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响

背景:调控神经干细胞分化的微环境因素很多,数种因素可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞更有效地分化为神经元尤为关键.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子与脑源性神经营养因子联合应用对成年大鼠脑海马神经干细胞分化为神经元的影响.设计、时间及地点;细胞学体外观察,于2008-05在中国医科大学神经解剖研究室完成.材料:清洁级雄性SD大鼠3只,由中国医科大学实验动物部提供.方法:无菌条件下分离大鼠脑海马组织,胰蛋白酶消化后采用无血清培养技术体外培养神经干细胞,传至第4代克隆球直径约为200 pm时,滴加含B27、表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12进行单细胞克隆培养.传代的神经干细胞分成4组:空白对照组加入含体积分数为10%胎生血清的DMEM/F12培养液,碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组分别在空白对照组培养液的基础上加入10 pg/L碱性成纤维细胞生长因子、200 μg/L脑源性神经营养因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+200 μg/L脑源性神经营养因子,培养1周.主要观察指标:免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞,检测神经干细胞分化为神经元的比例.结果:单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达.与空白对照组比较.碱性成纤维细胞生长因子组、脑源性神经营养因子组、联合组神经干细胞分化为神经元的比例均明显提高(t=3.409～7.558,P<0.05),且联合组升高幅度尤为显著.结论:适宜浓度的碱性成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子联合应用,比其单独应用具有更强的促神经干细胞向神经元分化的作用.     

硫酸软骨素对HL60细胞增殖分化的影响

背景:硫酸软骨素是细胞基质的重要成分,可促进肿瘤细胞的增殖,抑制其转移。目的:观察硫酸软骨素对阿霉素作用下HL60细胞增殖分化的影响。设计:开放性实验。单位:青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室。材料:实验于2003-09/2004-12在青岛大学医学院生物化学与分子生物学研究室完成。HL60细胞株购于中国医学科学院上海细胞库,为人类早幼粒白血病细胞。牛软骨硫酸软骨素(Sigma)。方法:①细胞传代培养后将进入对数增殖期的细胞用含体积分数0.1灭活胎牛血清的RPMI1640培养液配制成1×108L-1的细胞悬液,分装于45个培养瓶中,4mL/瓶。②取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。采取细胞计数法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞密度的变化。③取分装好的细胞悬液30瓶,分为硫酸软骨素 阿霉素组、硫酸软骨素组,各15瓶。按照0,5,25,50,75mg/L浓度向两组加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mmol/L磷酸盐缓冲液。用MTT法测定硫酸软骨素处理后的HL60细胞加入阿霉素后细胞存活率的变化。④取分装好的细胞悬液15瓶,按照0,5,25,50,75mg/L浓度加入硫酸软骨素,每个浓度平行3瓶,空白对照组加入等量的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。用酶联免疫反应测定各组细胞的酸性磷酸酶活性,观察其对细胞分化的影响。主要观察指标:①硫酸软骨素对HL60细胞增殖的影响。②硫酸软骨素 阿霉素对HL60细胞存活率的影响。③硫酸软骨素对HL60细胞酸性磷酸酶活性的影响。结果:共制备细胞悬液45瓶,全部进入结果分析。①与空白对照组比较,不同浓度硫酸软骨素处理24h后HL60细胞密度均显著升高(P<0.01);且50,75mg/L硫酸软骨素浓度组的细胞密度升高尤为明显,但两组间比较基本相似(P>0.05),说明在这个浓度范围内硫酸软骨素对细胞生长的促进作用变化不大。②与空白对照组比较,加入不同浓度硫酸软骨素后,硫酸软骨素 阿霉素组细胞存活率均有不同程度的降低,硫酸软骨素浓度超过25mg/L时降低明显(P<0.01)。③与空白对照组比较,5,25,50mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值均明显升高(1.268±0.038,1.305±0.101,1.321±0.021,1.354±0.013,P<0.01或0.05),尤其是75mg/L硫酸软骨素浓度组HL60细胞酸性磷酸酶吸光度值高达1.406±0.113,与空白对照组比较差异有极显著意义(P<0.001)。结论:硫酸软骨素在适当浓度时对HL60细胞的增殖产生促进作用,可提高HL60细胞对阿霉素的敏感性,促进细胞分化。     

酸性肽对神经元凋亡的抑制

背景:高浓度的一氧化氮能引起神经细胞的凋亡。因此抑制一氧化氮引起的细胞凋亡就能达到预防和治疗老年痴呆病的目的。目的:观察酸性肽能否抑制一氧化氮引起的神经元凋亡。设计:对照观察细胞和分子实验。材料:实验于2003-05/2005-05在郑州大学生物活性肽研究所第二实验室和郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室细胞培养室完成。新生的24h内SD雄性大鼠,由河南省动物中心提供(410117)。方法:对新生的SD大鼠海马神经元进行原代培养。取培养至第11天的神经细胞,用不同剂量的酸性肽预处理6h,再加入终浓度为50μmmol/L的亚硝基铁氰化钠,继续培养24h,收集细胞进行实验。每次实验均分为以下5组:正常对照组、亚硝基铁氰化钠处理组、亚硝基铁氰化钠 0.0375mg/mL酸性肽组、亚硝基铁氰化钠 0.075mg/mL酸性肽组,亚硝基铁氰化钠 0.15mg/mL酸性肽组。用噻唑蓝法测定细胞的存活率,用免疫组织化学法对神经丝蛋白进行染色,再用吖啶橙荧光染色法显示细胞凋亡的形态。用琼脂糖凝胶电泳法分析凋亡细胞的DNA梯带。用WesternBlot和吸光度扫描分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达水平。主要观察指标:①噻唑蓝法比色法检测细胞存活率的实验结果。②细胞凋亡的核型观察结果。③细胞凋亡的DNA电泳分析。④Bcl-2和Bax蛋白的WesternBlot分析结果。结果:①亚硝基铁氰化钠处理组的神经元存活率为58.9%,亚硝基铁氰化钠 0.037mg/mL酸性肽处理组为70.0%,亚硝基铁氰化钠 0.075mg/mL酸性肽处理组为72.8%,亚硝基铁氰化钠 0.15mg/mL酸性肽处理组为75.3%。②细胞凋亡的核型观察结果:亚硝基铁氰化钠处理组呈现细胞凋亡的明显特征。不同浓度的酸性肽 亚硝基铁氰化钠共同处理组海马神经元的细胞核接近正常对照组的细胞核形态。③细胞凋亡的DNA电泳分析结果表明,仅亚硝基铁氰化钠处理组的神经元DNA在琼脂糖凝胶电泳上显示出清晰的细胞凋亡的特征性DNA梯带。④Bcl-2和Bax蛋白的Western Blot和吸光度扫描分析结果显示,亚硝基铁氰化钠处理组Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax蛋白表达水平升高。而不同浓度的酸性肽 亚硝基铁氰化钠共同处理组的Bcl-2蛋白水平随酸性肽浓度逐渐增加,Bax蛋白的表达水平逐渐下降。结论:酸性肽能够抑制神经元的凋亡,增加神经元Bcl-2蛋白的表达水平,抑制神经元Bax蛋白的表达水平。     

碱性成纤维生长因子和神经生长因子联合应用培养成年大鼠海马神经干细胞向神经元样细胞的分化

背景：影响神经干细胞向神经元分化的因素很多,各种营养因子可以不同程度地刺激神经干细胞向神经元分化,如何使神经干细胞大量分化为神经元是研究的热点问题。目的：观察联合应用碱性成纤维生长因子和神经生长因子对成年大鼠海马神经干细胞为神经元的影响。方法：无菌条件下分离大鼠脑海马组织,传至第4代克隆球直径约为200μm时,滴加DMEM/F12＋2%B27＋20μg/L表皮生长因子＋20μg/L碱性成纤维细胞生长因子,进行单细胞克隆培养,传代的神经干细胞分成空白对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子＋神经生长因子组。观察传代后的克隆球进行神经干细胞免疫细胞化学染色鉴定,计数神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率,检测神经干细胞向神经元的分化情况。结果与结论：①单细胞克隆培养后,克隆球细胞表达巢蛋白,诱导分化后神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白均呈阳性表达。②与空白对照组神经干细胞分化为神经元的比例比较,碱性成纤维细胞生长因子组、神经生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组均明显提高（P〈0.05）,且碱性成纤维细胞生长因子组＋神经生长因子组神经元的比例最高（P〈0.05）。提示,碱性成纤维细胞生长因子可以提高神经生长因子诱和神经生长因子均可促进神经干细胞向神经元分化,且二者联合应用效果更佳。     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景:体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化.一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例.目的:观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性.方法:取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μJ/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L.睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例.结果与结论:①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构.②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例.其中20 μg/L.的脑源性神经营养因子联合20 μg/t.睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高.提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞.     

氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的作用

背景氯胺酮是临床常用的静脉全麻药,静脉或硬脊膜外腔用药都有镇痛作用,它是N-甲基-D-天冬氨酸受体非竞争性拮抗剂,可拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用.目的观察氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.设计随机对照观察.单位郧阳医学院附属太和医院麻醉科.材料实验于2003-09/2005-01在郧阳医学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成.由武汉大学动物实验中心提供新生两三天Wistar大鼠.方法取Wistar大鼠T11～L6脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养.胶质纤维酸性蛋白鉴定星形胶质细胞纯度达98%后用于实验.将培养细胞24孔板随机分为6组(每组9份)①对照组加Hanks液50μL.②N-甲基-D-天冬氨酸组加药浓度为100μmol/L.③氯胺酮组加药浓度为1 mmol/L.④100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.1 mmol/L氯胺酮组.⑤100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.5 mmol/L氯胺酮组.⑥100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+1mmol/L氯胺酮组.1 mmol/L氯胺酮为临床镇痛剂量.培养24 h后检测超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量,免疫细胞化学观察Bcl-2蛋白和形态学变化,流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率.主要观察指标①Bcl-2蛋白免疫组织化学苏木精-伊红复染细胞着色及形态学变化.②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率.③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化.结果①Bcl-2平均吸光度值(A)作为半定量测量Bcl-2蛋白表达水平100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组低于对照组,差异显著[分别为0.054±0.021,0.108±0.039,P＜0.01],100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+1 mmol/L氯胺酮组高于100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组,差异显著[分别为0.148±0.045,0.054±0.021,P＜0.01].②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组高于对照组,差异显著[分别为(25.26±6.13)%,(5.66±2.24)%,P＜0.01],100μmol/LN-甲基-D-天冬氨酸+1 mmol/L氯胺酮组低于100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组,差异显著[分别为(24.41±4.82)%,(25.26±6.13)%,P＜0.01].③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸使星形胶质细胞内丙二醛含量显著升高,而超氧化物歧化酶活性明显降低;1 mmol/L氯胺酮明显降低丙二醛含量,显著增强超氧化物歧化酶活性,该效应在临床镇痛剂量以内有明显量效关系,与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异显著(P＜0.01).1 mmol/L氯胺酮组与对照组相比、100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.1 mmol/L氯胺酮组与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异均无显著性.结论N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活可诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞大量凋亡,适量氯胺酮显著抑制细胞凋亡,其机制可能增强星形胶质细胞Bcl-2蛋白表达,同时抑制自由基的产生和增强超氧化物歧化酶活性.     

骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子表达的影响

背景:近年来关于骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复方面的研究较多,但目前相关机制尚不清楚.目的:观察间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-04/07在中国医科大学神经解剖学实验室完成.材料:选取鼠龄3个月的SD大鼠64只,雌雄不拘,体质量250～300 g,随机抽取4只大鼠用于骨髓间充质干细胞的分离与培养,其余60只用于制备脊髓横断损伤模型.方法:60只大鼠随机抽签法分为3组,细胞移植组(n=24):脊髓损伤后第7天,无菌条件下以微量注射缓慢注入含骨髓间充质干细胞(1×109L-1)的培养液5μL至脊髓损伤区;PBS组(n=24):注入等量(5μL)磷酸盐缓冲液体;空白对照组(n=12):注入生理盐水5μL.主要观察指标:分别于造模后7,14,28 d取材,观察骨髓间充质干细胞的形态变化;免疫组织化学法检测间充质干细胞移植后大鼠脊髓损伤区脑源性神经营养因子的表达.结果:60只SD大鼠均进入结果分析.10代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得扁平,若加入碱性成纤维细胞生长因子,则可维持其增殖能力和形态.大鼠脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达,细胞移植后第7,14,28天,细胞移植组脑源性神经营养因子表达均高于PBS组和空白对照组(P＜0.05);空白对照组与PBS组脑源性神经营养因子表达无明显差异(P＞0.05).结论:骨髓间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生,可能是治疗脊髓损伤的重要机制.