三氧化二砷对肠癌HCT116细胞Smads表达的影响

目的 研究三氧化二砷对肠癌细胞HCT116中TGF-β/Smads信号通路的Smads相关基因表达变化,阐述Smads相关基因在肠癌HCT116细胞中的变化规律,探讨肠癌发生的病理机制,和分析As2O3作用新靶点。方法 实验分空白对照组,低剂量As2O3组,中剂量As2O3组,高剂量As2O3组,在体外培养72 h后取出细胞用于实验。采用免疫荧光化学术和Westernblotting检测Smad3、Smad7蛋白的表达变化。结果 三氧化二砷为0.5~2.5μmol/L时,Smad3分别为（19.94±1.57）,（34.17±1.28）,（39.64±1.63）,Smad7分别为（31.53±0.67）,（21.69±0.94）,（20.04±0.31）,与对照组Smad3（16.61±0.64）,Smad7 3（8.61±0.64）比较,各组差异有统计学意义（P〈0.05）;westernblotting显示三氧化二砷能同时下调Smad7蛋白的表达,上调Smad3蛋白的表达而对肿瘤细胞的生长进行调控。结论 TGF-β/Smads信号通路的Smad3,7在肠癌发生发展起重要的调控作用,三氧化二砷可通过改变Smad3,7表达,而对肠癌细胞HCT116生长进行抑制。     

3-溴丙酮酸联合顺铂抑制肺癌细胞株A549的生长

目的 探讨3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate,3-BrPA)联合顺铂体外抗肺癌A549细胞的作用及其可能机制.方法 采用CCK-8检测不同浓度的3-BrPA、顺铂单用及联用对A549细胞的增殖抑制;选择低于半数抑制浓度(IC50)的40 μmol/L 3-BrPA与1 mg/L顺铂单独和联合作用A549细胞48 h后,用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡;不同浓度的3-BrPA作用A549细胞48 h后,流式细胞术检测细胞周期变化,己糖激酶(hexokinase,HK)活性检测试剂盒检测3-BrPA对细胞内HK活性的影响.结果 CCK-8结果显示,与阴性对照组比较,3-BrPA浓度大于20 μmol/L时对A549细胞有明显抑制作用(P＜0.01),与单用顺铂组比较,3-BrPA联合顺铂组可显著增强顺铂对A549细胞的毒性作用(P＜0.01);3-BrPA作用A549细胞48 h后,倒置显微镜观察到3-BrPA组大多数细胞出现凋亡,而联合用药组细胞凋亡更加明显,部分区域出现细胞碎片等坏死征象;流式细胞术结果显示,3-BrPA和顺铂单用组及联合用药组细胞凋亡率均明显高于阴性对照组(P＜0.01),且联合用药组细胞凋亡率明显高于单独用药组(P＜0.01);细胞周期检测结果显示3-BrPA可将A549细胞阻滞于G1期;HK活性结果显示:与阴性对照组比较,3-BrPA组HK活性明显降低(P＜0.01).结论 3-BrPA有抑制肺癌A549细胞增殖、诱导其凋亡的作用,且与顺铂具有协同抗肺癌A549细胞增殖作用,其机制可能为抑制肺癌细胞糖酵解,进而影响肺癌细胞能量代谢.     

3-溴丙酮酸联合阿霉素对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究3-溴丙酮酸(3-BRPA)联合阿霉素(ADM)对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响。方法:采用3-BRPA 80、160、320mol/L作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞18 h后,测定其对细胞内ATP的影响;分别用3-BRPA 10、20、40、80、160mol/L和ADM 0.75、1.5、3、6、12mol/L,以及3-BRPA 80mol/L与ADM 0.75、1.5、3、6、12mol/L合用作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48和72 h后,MTT法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖情况;3-BRPA 80mol/L组、ADM0.75mol/L组以及3-BRPA 80mol/L与ADM 0.75mol/L合用组作用于乳腺癌细胞MDA-Mb-231 24 h后,利用碘化丙啶染色,流式细胞仪检测其诱导乳腺癌细胞凋亡的影响;采用3-BRPA 16mol/L、ADM 0.2mol/L以及3-BRPA 16mol/L与ADM0.2mol/L合用作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231,5 d后观察对集落克隆形成的影响。结果:3-BRPA对乳腺癌细胞MDA-MB-231 ATP的生成有抑制作用;3-BRPA联合ADM后可明显增强ADM的细胞毒性作用;3-BRPA 80mol/L与ADM 0.75mol/L合用组诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 24 h凋亡率为39.6%,均显著高于对照组、3-BRPA单用组和ADM单用组(P0.01);3-BRPA增强ADM对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落克隆形成的抑制作用。结论:3-BRPA可以增强ADM对乳腺癌细胞MDAMB-231增殖的抑制作用以及增强ADM诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。     

miRNA-455-3p对HCT116结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及机制研究

目的 探讨miRNA-455-3p对HCT116结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及机制研究.方法 采用脂质体LipofectamineTM 3000将miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转入HCT116结肠癌细胞中,Real-time PCR检测细胞中miR-455-3p表达,MTT法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测细胞中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、MMP9、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路相关蛋白的表达.结果 与miR-455-3p NC组比较,miR-455-3p mimics组miR-455-3p表达量显著提高(P＜0.01),细胞活力、迁移能力、侵袭能力均显著降低(P＜0.01),MMP2、MMP9、PI3K及p-AKT表达量均显著下调(P＜0.01).结论 miR-455-3p mimics可能通过阻断PI3K/AKT信号通路抑制HCT116细胞的迁移及侵袭.     

3－溴丙酮酸促进胃癌细胞凋亡的机制

目的：探讨3－溴丙酮酸（3－BrPA）抑制胃癌细胞生长并诱导凋亡的作用机制。方法将胃癌细胞MGC－803分为以纯培养基培养为阴性对照,3－BrPA低、中、高剂量处理和5氟尿嘧啶（5－FU）作为阳性对照。分别以0、4、6、8μg／mL的3－BrPA及0.5 mmol／L的5－FU处理。药物作用24、48 h后,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,酶偶联法检测细胞内乳酸含量及HK活性,Real－time PCR检测Bcl－2、BaX和Cyt－c的mRNA表达。结果 MTT结果和凋亡检测结果表明,随着3－BrPA浓度增加、作用时间延长,细胞生长抑制率和凋亡率也随之增大（P＜0.05）。酶偶联检测结果显示,随3－BrPA浓度增加、作用时间延长,细胞内乳酸含量及HK的活性是降低的,且呈浓度依赖性（P＜0.05）;Real－time PCR结果显示随3－BrPA浓度增加, BaX和Cyt－c的mRNA表达量升高,而Bcl－2的mRNA表达量降低（ P＜0.05）。结论3－BrPA对MGC－803细胞的生长抑制作用和促凋亡作用可能与其能抑制MGC－803细胞内关键酶HK的活性,降低糖酵解效率,并通过激活线粒体凋亡通路相关。     

3-溴丙酮酸联合阿霉素对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究3-溴丙酮酸(3-BrPA)联合阿霉素(ADM)对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的影响。方法:采用3-BrPA 80、160、320μmol/L作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞18 h后,测定其对细胞内ATP的影响;分别用3-BrPA 10、20、40、80、160μmol/L和ADM 0.75、1.5、3、6、12μmol/L,以及3-BrPA 80μmol/L与ADM 0.75、1.5、3、6、12μmol/L合用作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞24、48和72 h后,MTT法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖情况;3-BrPA 80μmol/L组、ADM0.75μmol/L组以及3-BrPA 80μmol/L与ADM 0.75μmol/L合用组作用于乳腺癌细胞MDA-Mb-231 24 h后,利用碘化丙啶染色,流式细胞仪检测其诱导乳腺癌细胞凋亡的影响;采用3-BrPA 16μmol/L、ADM 0.2μmol/L以及3-BrPA 16μmol/L与ADM0.2μmol/L合用作用于乳腺癌细胞MDA-MB-231,5 d后观察对集落克隆形成的影响。结果:3-BrPA对乳腺癌细胞MDA-MB-231 ATP的生成有抑制作用;3-BrPA联合ADM后可明显增强ADM的细胞毒性作用;3-BrPA 80μmol/L与ADM 0.75μmol/L合用组诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231 24 h凋亡率为39.6%,均显著高于对照组、3-BrPA单用组和ADM单用组(P0.01);3-BrPA增强ADM对乳腺癌细胞MDA-MB-231集落克隆形成的抑制作用。结论:3-BrPA可以增强ADM对乳腺癌细胞MDAMB-231增殖的抑制作用以及增强ADM诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。     

靶向CK2α基因的siRNA对结肠癌HCT116细胞生长抑制作用及其机制

目的：探讨RNA干扰酪蛋白激酶2（CK2α）基因表达后对HCT116细胞生长的抑制作用并阐明其作用机制。方法：针对CK2α的mRNA序列设计CK2α-siRNA序列,将体外培养的HCT116细胞分为正常对照组(未转染)、阴性对照组(转染siRNA)和CK2α-siRNA组(转染CK2α-siRNA),应用Lipofectamine 2000进行转染,利用Western blotting 法检测CK2α、cyclin H、P53和P21蛋白表达水平;应用MTT法检测各组HCT116细胞增殖;采用流式细胞术检测细胞周期时相的分布。结果：与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组CK2α和细胞周期蛋白cyclin H的表达水平明显降低（P<0.01）,P53蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,P21蛋白表达水平则明显升高（
P<0.01）;MTT检测,与阴性对照组比较,转染48和72 h,CK2α-siRNA组细胞存活率明显降低（P<0.01）;流式细胞术分析,与阴性对照组比较,CK2α-siRNA组S期细胞所占比例逐渐减少（P<0.01）,G1期细胞则明显增加（P<0.01）,细胞滞留在G1期。结论：RNA干扰CK2α表达能够抑制HCT116细胞增殖,发生G1期阻滞;其机制可能与RNA干扰CK2α表达后cyclin H表达下调及P53活性恢复有关。     

3-溴丙酮酸增强人鼻咽癌细胞对顺铂敏感性的作用及机制研究

目的探讨3-溴丙酮酸（3-BrPA）增强人鼻咽癌细胞对顺铂敏感性的作用及作用机制。方法MTT法检测3-BrPA和顺铂对鼻咽癌HNE1细胞增殖的影响。集落克隆形成实验观察3-BrPA和顺铂对HNE1细胞克隆形成能力的影响。线粒体膜电位检测试剂盒分析细胞早期凋亡情况。DAPI荧光染色法检测细胞核形态变化。AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化。ATP检测试剂盒测定细胞内ATP水平的变化。Western blotting检测Bcl-2、Bax、Mcl-1、Bak蛋白的表达。结果3-BrPA（20、40、80、160、320 μmol/L）、顺铂（2、4、8、16、32 μmol/L）以及80 μmol/L 3-BrPA联合不同浓度顺铂都能明显抑制HNE1细胞的体外增殖活性,与对照组比较,差异有统计学意义（P < 0.01）。8 μmol/L 3-BrPA+0.8 μmol/L顺铂组细胞集落数明显低于3-BrPA、顺铂单独处理组及对照组（P < 0.01）。80 μmol/L 3-BrPA+8 μmol/L顺铂组细胞红色荧光向绿色荧光转变明显;细胞核碎裂及核固缩明显增加;细胞凋亡率明显高于3-BrPA、顺铂单独处理组及对照组（P < 0.01）;细胞内ATP水平明显低于3-BrPA、顺铂单独处理组及对照组（P < 0.01）;Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达降低,Bax、Bak蛋白的表达增高,与3-BrPA、顺铂单独处理组及对照组比较,差异有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）。结论3-BrPA能诱导HNE1细胞凋亡,并能增强HNE1细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低细胞内ATP水平以及下调Mcl-1和Bcl-2表达、上调Bak和Bax蛋白的表达有关。     

JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖及凋亡的影响

目的 研究JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖及凋亡的影响。方法 不同浓度JS-K 处理 HCT116 细胞48 h 后,采用MTS 法检测JS-K 对HCT116 细胞增殖活性的影响;PI 单染流式细胞术检测 JS-K 对HCT116 细胞周期的影响;Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术检测JS-K 对HCT116 细胞凋亡的 影响;Texas Red-X 鬼笔环肽荧光染色观察细胞骨架形态;实时荧光定量聚合酶链反应检测Bcl-2 家族基 因mRNA 表达。结果 JS-K 对人结肠癌细胞HCT116 增殖有抑制作用,且呈浓度和时间依赖性（P <0.05）。 JS-K 诱导HCT116 细胞被阻滞在G2/M 期（P <0.05）。JS-K 可致HCT116 细胞发生晚期凋亡（P <0.05）。 JS-K 可改变HCT116 细胞骨架形态、微丝结构与分布。随着JS-K 浓度增加,促凋亡基因Bax、Bik、Bim、 Puma mRNA 相对表达量上调,抗凋亡基因Mcl-1 mRNA 相对表达量下调（P <0.05）。结论 JS-K 对人结肠 癌HCT116 细胞增殖有明显抑制作用,通过调节Bcl-2 家族基因表达,阻滞细胞G2/M 期,促进细胞发生晚 期凋亡。     

3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的:观察糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸对肝癌Bel7402细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测3-溴丙酮酸对Bel7402细胞的增殖抑制效应,PI单染流式细胞术检测不同浓度3-溴丙酮酸（0、50、100、200 μmol/L）对Bel7402细胞凋亡的影响,ATP检测试剂盒分析细胞内ATP水平,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果:3-溴丙酮酸可浓度和时间依赖性地抑制Bel7402细胞的增殖（P<0.01）,作用24、48、72 h的IC₅₀值分别为422.9、143.9、85.0 μmol/L。3-溴丙酮酸可诱导Bel7402细胞发生明显的细胞凋亡,50、100、200 μmol/L 3-溴丙酮酸作用24 h的细胞凋亡率均明显高于对照组（P<0.01）。ATP水平检测结果表明,3-溴丙酮酸可明显降低Bel7402细胞内的ATP水平（P<0.01）。Western blot结果显示,3-溴丙酮酸可下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,并上调凋亡诱导蛋白Bax的表达。结论:3-溴丙酮酸具有诱导肝癌Bel7402细胞凋亡的作用,其机制可能是通过引起细胞内ATP降低、调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。     

人HCT116结肠癌细胞系中CD133+结肠癌干细胞分离及鉴定

目的 从人结肠癌细胞系(HCT116)中分离鉴定结肠癌干细胞,并观察其体外生物学特性.方法 利用RT-PCR、免疫荧光、流式细胞等技术检测HCT116细胞中CD133的表达情况;利用免疫磁珠分选技术分选CD133+细胞;采用无血清培养基培养分选后的CD133+细胞鉴定其体外增殖特性;采用含血清培养基诱导干细胞克隆球分化并采用免疫组化检测CK20表达情况鉴定其分化特性.结果 HCT116细胞系中存住CD133+细胞,免疫磁珠能有效的分选CD133+细胞,分选后的阳性含量为91.92%,分选后的阳性细胞具有典型干细胞的体外增殖、分化特性.结论 CD133+结肠癌干细胞在体外具有和普通干细胞类似的无限增殖、自我更新和分化能力,同时它们也表达ABCG2等耐药相火蛋白.     

RNAi抑制大肠癌HCT116细胞株VEGF-mRNA表达的实验研究

目的研究载体介导的RNAi(RNA interference) 技术对大肠癌细胞株HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表达的抑制作用.方法依据Tuschl等设计siRNA 的原则,以VEGF为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体Pavu6 27中构建重组体 (Pavu6 27-VEGF siRNA).DOTAP脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株,经G418筛选,以空质粒(Pavu6 27)转染为对照;半定量RT-PCR法观察HCT116细胞中VEGF-mRNA表达改变.结果①成功构建发卡样VEGF siRNA(small interfere RNA)真核表达载体(Pavu6 27-VEGF siRNA);② Pavu6 27-VEGF siRNA转染HCT116细胞后,VEGF-mRNA表达较空载体Pavu6 27转染的对照组显著下降.结论成功构建载体介导的VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制HCT116细胞中VEGF-mRNA表达,为下一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础.     

3-溴丙酮酸对耐顺铂鼻咽癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸(3-BP)对耐顺铂鼻咽癌细胞HNE1/DDP增殖和凋亡的影响.方法:MTT比色法和集落克隆形成实验检测3-BP对HNE1/DDP细胞的增殖抑制作用,PI染色法检测3-BP对HNE1/DDP细胞凋亡的影响,Western blotting检测凋亡相关蛋白多聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)、髓样细胞白血病-1(Mcl-1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达.结果:3-BP可显著抑制HNE1/DDP细胞的增殖,其48 h的IC50值为260.2μmol/L.低浓度(10、20、40μmol/L)的3-BP能明显抑制HNE1/DDP细胞集落克隆的形成.3-BP可诱导HNE1/DDP细胞发生明显的细胞凋亡(P<0.01),80、160、320μmol/L 3-BP作用48 h的细胞凋亡率分别为(13.7±2.1)％、(25.5±2.4)％、(45.5±3.5)％,对照组的细胞凋亡率为(1.6±0.6)％.Western blotting结果显示,3-BP处理HNE1/DDP细胞后可促进PARP的剪切,能下调抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达.结论:3-BP对HNE1/DDP细胞具有增殖抑制及凋亡诱导作用,其机制可能与下调抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达相关.     

昆明山海棠总生物碱对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究昆明山海棠总生物碱(total alkaloids of tripterygium hypoglaucum hutch,THHta)对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用MTT法检测THHta对HCT116细胞增殖的抑制作用;用倒置及荧光显微镜观察THHta作用后HCT116细胞形态的变化;流式细胞术检测THHta对HCT116细胞周期及凋亡的影响,Western bolt检测凋亡相关caspase-3及PARP蛋白表达.结果 THHLa能显著抑制HCT116细胞增殖,抑制率与剂量和时间呈依赖关系.THHta作用HCT116细胞48、72 h的IC_(50)值小于20 μg/ml.THHta(10μg/ml)能诱导HCT116细胞G_0/G_1期比例增加及细胞凋亡,caspase-3活化及PARP蛋白剪切显著增强.结论 THHta能显著抑制HCT116细胞增殖,并可诱导HCT116细胞G_0/G_1期阻滞及细胞凋亡.     

吲哚美辛对结肠癌细胞HCT116中细胞周期蛋白的影响

目的揭示吲哚美辛抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的分子机理，探讨其抗结肠肿瘤的作用机制。方法不同浓度的吲哚美辛作用于结肠癌细胞株HCT116细胞24h，采用Western蛋白印迹技术检测CDK2、CDK4、Bcl-2、Bax及p21^WAE1/CIP1蛋白表达。结果吲哚美辛能降低CDK2、CDK4及Bcl-2的表达，同时上调p21WAE1／CIP1蛋白的表达且呈剂量依赖方式，而对促凋亡蛋白bax的表达无影响。结论吲哚美辛可通过降低CDK2、CDK4、Bcl-2蛋白，上调p21^WAF1/CIP1蛋白的表达来抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，从而实现其抗肿瘤作用。     

微小RNA136过表达对结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6含量及细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建携带微小RNA136(mir136)的真核表达载体并将其转染人结直肠癌细胞,观察外源性mir136表达对人结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6表达及细胞增殖活性的影响.方法 提取人肾上皮HEK293细胞基因组DNA,PCR扩增包含mir136前体序列的DNA片段并构建重组载体,采用阳离子脂质体法将重组载体转染人结直肠癌HCT116细胞.转染后48h,采用实时定量PCR法检测细胞内mir136含量变化,以蛋白质印迹法检测细胞中S100A6蛋白的表达;转染后24和48h,采用CCK 8试剂盒检测肿瘤细胞增殖活性;转染后48 h,以双染法检测细胞凋亡情况.结果 成功构建重组mir136真核表达载体并转染HCT116细胞.转染后48 h,重组载体转染组HCT116细胞内mir136相对表达量高于未转染组(P＜0.01),而S100A6蛋白的相对表达量则低于未转染组(P＜0.01).同时,重组载体转染组HCT116细胞增殖活性较未转染对照组降低(P＜0.05),而细胞凋亡则较未转染对照组增加(P＜0.01).结论 Mir136可能通过抑制S100A6基因表达而抑制结直肠癌细胞增殖活性,同时引起细胞的凋亡.     

裸鼠盲肠黏膜下注射HCT116细胞建立结肠癌原位种植及转移模型的研究

目的建立一种简便、可行、稳定的裸鼠盲肠黏膜原位种植癌及转移模型。方法将人结肠癌细胞株HCT116细胞注射接种于裸鼠盲肠黏膜下,HE染色及人癌胚抗原(CEA)免疫组化检测接种后不同时期的盲肠原位瘤,腹腔淋巴结、肝、肺组织转移情况。结果盲肠接种HCT116细胞后2周,90%裸鼠均长出直径2~5 mm的盲肠原位瘤;接种后4周开始有腹腔淋巴结转移,12周时淋巴结转移率100%;接种10周时见肝、肺有转移,12周时肝、肺转移率分别为60%、39%。结论利用盲肠黏膜下原位接种HCT116细胞法建立裸鼠结肠癌模型,可模拟结肠癌临床原位发生、发展演变过程,方法简便且成瘤率高,为深入研究结肠癌转移机制的基础研究提供理想、稳定的动物模型。