c-erbB1 c-erbB2和丝裂原活化蛋白激酶与乳腺癌三苯氧胺耐药的关系

目的探讨获得性三苯氧胺（TAM）抵抗乳腺癌细胞的生长调节途径及获得性TAM抵抗的发生机制。方法4-OH TAM诱导野生型人乳腺癌细胞系WT-MCF-7构建TAM耐药细胞系MCF-7／TAM—R,采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫细胞化学方法检测MCF-7／TAM-R与WT-MCF-7细胞系中c-erbB1、c—erbB2、c—erbB3、c—erbB4 mRNA和蛋白表达及其活化状态。结果MCF-7／TAM—R细胞中c—erbB1蛋白表达水平为WT—MCF-7细胞的3倍（P〈0．05）,mRNA表达水平为其6倍（P〈0．05）;c—erbB2蛋白表达水平为其1．5倍（P〈0．05）,mRNA表达水平为其3倍（P〈0．05）;c—erbB3蛋白及mRNA表达水平在两种细胞系中相近;未检测到c—erbB4蛋白及mRNA表达。与WT—MCF-7细胞相比,MCF-7／TAM—R细胞中c—erbB1、c—erbB2和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化水平增高。MCF-7／TAM-R细胞中存在可测量的、活化的c—erbBl1／e—erbB2和c—erbB1／c—erbB3异二聚体。结论由c—erbB1特异性配体的自分泌释放作用,诱导c—erbB1／e—erbB2二聚体形成及其下游MAPK的磷酸化,与MCF-7细胞TAM耐药有关。     

雌激素受体β在乳腺癌他莫昔芬内分泌治疗耐药中的作用

目的：探讨雌激素受体β（estrogen receptor β,ERβ）的表达与乳腺癌他莫昔芬（tamoxifen,TAM）内分泌治疗耐药的相关性及其机制。方法：以前期构建的ERα/ERβ不同表达的人乳腺癌MCF-7细胞株\[M/HK（阴性对照）、M/siα（ERαlow/ERβhigh）、M/siβ（ERαhigh/ERβlow）细胞\]为研究对象,MTT法评估乳腺癌细胞对TAM的耐药性;用半定量RT-PCR法检测细胞中耐药相关基因MDR1、TOPOⅡ、LRP和GST-π的mRNA表达水平,用Western blotting法检测细胞中耐药相关信号通路MAPK、PI3K/Akt的p-ERK、p-Akt蛋白表达水平。结果：与对照组MCF-7细胞相比,MCF-7细胞中的ERβ高表达可促进高浓度TAM（1、5、10 μmol/L）对MCF-7细胞增殖的抑制作用\[（45.788 ± 1.641）% vs （24.288±1.170）%,（57.899±1.583）% vs（31.499±1.978）%,（59.853 ±1.648）% vs（38.039±1.482）%;均P<0.05 ）\],该抑制作用与TAM浓度呈剂量依赖性。ERβ高表达可显著抑制MCF-7细胞耐药基因MDR1、TOPOⅡ、LRP的 mRNA表达水平（0.431±0.032 vs 0.932±0.083,0.234±0.008 vs 0.391±0.002,0.47±0.028 vs 0.586±0.036;均P<0.05);可显著下调Akt和ERK蛋白的磷酸化水平（0224±0.006 vs 0.437±0.007,0.367±0.015 vs 0.756±0.039;均P<0.05)。结论： ERβ表达水平可影响乳腺癌细胞MCF-7对TAM的耐药性,该作用机制可能与耐药基因的表达及PI3K/ AKT、MAPK信号通路激活有关。     

乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR中Twist的表达与EMT现象的实验研究

目的：观察乳腺癌多药耐药细胞MCF-7／ADR中Twist表达及上皮-间质转化现象．探讨其与MCF-7／ADR侵袭转移能力增强的相关性。方法：分别以RT-PCR法、链霉亲和素-生物素酶复合物（Strept avidin biotin complex，SABC）免疫组织化学方法和Western blot法检测乳腺癌细胞系MCF-7及其多药耐药株MCF-7／ADR中介导EMT发生的转录因子Twist、上皮性标记基因E-钙粘素（E—cadherin）和间质性标记基因N-钙粘素（N—cadherin）表达的改变情况。结果：亲本细胞MCF-7中E—cadherin mRNA的表达和蛋白水平的表达均为阳性，Twist和N—cadherin表达阴性；多药耐药株MCF-7／ADR中E—cadherin mRNA和蛋白表达缺失，而在亲本细胞MCF-7中不表达的Twist和N—cadherin表达阳性。结论：在多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／ADR中．其侵袭力增强可能与Twist介导的EMT发生有关。     

诺美孕酮逆转乳腺癌耐药细胞株多药耐药性的研究

目的 研究诺美孕酮（NOM）对乳腺癌耐药细胞株（MCF7／ADR）多药耐药性（MDR）的影响,探讨其调节机制。方法 应用MTT法,研究NOM对MCF7／ADR药物敏感性的影响。采用半定量逆转录聚合酶联反应（RT－PCR）和免疫细胞化学染色,分析耐药基因MDR1、谷胱甘肽S转移酶Pi(GSTπ）、拓扑异构酶Ⅱα（Topo Ⅱα)和多药耐药相关蛋白（MRP）表达的变化。通过流式细胞技术观察NOM对MCF7／ADR细胞内药物积累和细胞周期的影响。结果 NOM对MCF7／ADR的MDR具有明显的逆转作用,在20,10和5μmol/L浓度时的逆转倍数分别为21,12和8倍,逆转强度明显高于前身化合物甲地孕酮,而与维拉帕米相当。5μmol/L NOM处理MCF7／ADR后,MDRI的mRNA表达水平明显降低,呈现时间依赖性变化;P糖蛋白（P－gp)和GSTπ蛋白的变化符合相应mRNA表达的变化;MRP和Topo Ⅱα基因表达未见明显变化。用NOM 20,10和5μmol/L分别处理2h后,ADR在细胞内的积累分别增加到2．7倍、2．3倍和1．5倍。同时,NOM可明显加强ADR对MCF7／ADR细胞在G2M期的阻滞作用。结论 NOM具有较强的逆转MCF7／ADR细胞MDR的作用,其逆转机制为多种途径,包括时间依赖性下调MDRI和GSTπ基因的表达,增加细胞内药物积累,加强ADR对MCF7／ADR在G2M期的阻滞作用等。     

缺氧能引起EMT的发生促进乳腺癌的侵袭和迁移

 目的　探讨缺氧对人类乳腺癌细胞MCF-7上皮-间质转化（ EMT）标志分子E-钙黏着素（E-cadherin）、波型蛋白（Vimentin）及侵袭迁移能力的影响,揭示缺氧引起乳腺癌侵袭转移的机制, 为临床治疗乳腺癌提供实验及理论依据。方法　采用Western blot检测低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、E-cadherin、Vimentin的变化;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测缺氧对人类乳腺癌细胞MCF-7黏附能力的影响;Transwell侵袭小室法检测缺氧对MCF-7细胞侵袭和迁移能力的影响。结果　随着缺氧时间的延长,人类乳腺癌细胞中E-cadherin表达明显降低（0.09±0.02）（t＝30.98,P＝0.0007）,Vimentin表达明显升高（0.69±0.04）（t＝915,P＝0.0000) ;缺氧72 h组MCF-7细胞黏附（81.23±0.74）（t＝82.05,P＝0.000）、侵袭（120±6） （t＝22.78,P＝0.0009）和迁移能力明显增强（190±6）（t＝23.49,P＝0.000）。结论　缺氧能下调E-cadherin、上调Vimentin而引起EMT的发生,促进MCF-7细胞黏附、侵袭和迁移。     

Shh和Gli-1在人乳腺癌MCF-7耐药细胞株中的表达及意义

目的 研究Shh和Gli-1在人乳腺癌耐药株中的表达情况,探讨Hedgehog信号通路与乳腺癌耐药的关系。方法 高浓度间歇诱导法建立人乳腺癌耐药细胞株MCF-7／PTX,MTT法检测紫杉醇（PTX）对MCF-7与MCF-7／PTX细胞的半数抑制浓度（IC50）。实时定量PCR（QPCR）检测MCF-7、MCF-7／PTX细胞中Shh、Gli-1 mRNA的表达。Western blotting检测MCF-7、MCF-7／PTX细胞中Shh、Gli-1蛋白的表达。结果 PTX 对 MCF-7细胞的IC50为（0.10±0.02）mg／L,对 MCF-7／PTX细胞的 IC50为（5.30±0.01）mg／L;耐药指数为53.0。Shh mRNA在MCF-7、MCF-7／PTX细胞中的表达量分别为0.78±0.12和1.45±0.56（P＜0.01）;Gli-1 mRNA在MCF-7、MCF-7／PTX细胞中的表达量分别为1.86±0.02和3.56±0.26（P＜0.01）。Shh 蛋白在MCF-7、MCF-7／PTX细胞中的表达量分别为0.58±0.06和1.03±0.22（P＜0.01）;Gli-1 蛋白在MCF-7、MCF-7／PTX细胞中的表达量分别为1.17±0.12和2.78±0.09（P＜0.01）。结论 人乳腺癌耐药细胞株MCF-7／PTX高表达Shh、Gli-1,化疗药物可能通过上调Hedgehog信号通路相关蛋白及基因介导乳腺癌耐药,针对该信号通路的靶向治疗将是克服乳腺癌耐药的一个新的选择。     

雌激素受体β及其剪切变异体与乳腺癌他莫昔芬耐药的关系

目的探讨雌激素受体（ER）亚型（ERβ）及其剪切变异体（ERβcx）的表达与乳腺癌他莫昔芬耐药的关系。方法 （1）对乳腺癌他莫西芬敏感MCF-7细胞和他莫西芬耐药MCF-7细胞进行培养,利用去甲基化物5-氮杂胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine,5-AZA-CdR）去甲基化的作用,对MCF-7细胞进行药物处理获得MCF-75-AZA-CdR细胞,采用Western blot方法检测3组细胞中ERβ和ERβcx蛋白的表达。（2）取对数生长期生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株,按2.5×103细胞/孔接种于96孔细胞培养板板中,实验组分为他莫细芬处理的MCF-7细胞（MCF-7＋TAM组）和MCF-75-AZA-CdR细胞（MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组）,对照组为MCF-7细胞,采用MTT比色法,观察3组细胞的增殖情况。统计学分析采用单因素方差分析和重复测量方差分析。结果 （1）ERβ蛋白在他莫西芬敏感MCF-7细胞中的表达高于他莫西芬耐药的MCF-7细胞,两组细胞间差异有显著的统计学意义（P=0.000）;ERβcx蛋白表达在两组之间差异无统计学意义（P=0.366）。MCF-75-AZA-CdR细胞ERβ和ERβcx蛋白表达均高于他莫西芬敏感MCF-7细胞和他莫西芬敏耐药MCF-7细胞（P均=0.000）。（2）与对照组MCF-7细胞相比,他莫西芬明显降低了MCF-7＋TAM组和MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组的细胞增值速度并抑制细胞生长;且他莫西芬抑制细胞增殖作用MCF-75-AZA-CdR细胞＋TAM组强于MCF-7＋TAM组（P=0.000）。结论 ERβ蛋白在他莫西芬敏感MCF-7细胞中的表达高。MCF-75-AZA-CdR细胞中ERβ和ERβcx蛋白的表达均高。他莫西芬抑制细胞增殖作用在他莫西芬处理的MCF-75-AZA-CdR细胞中强     

MiR-34a对乳腺癌Mcf-7／ADR细胞株多柔比星敏感性影响研究

目的：探讨乳腺癌细胞株MCF7和耐药株MCF7／ADR中miR-34a的表达差异及miR-34a对于多柔比星化疗敏感性的影响。方法：采用实时定量PCR技术检测MCF-7细胞及MCF-7／ADR细胞中miR-34a的表达差异。采用转染技术,以脂质体为载体,在MCF_7／ADR细胞株中过表达miR-34a后,检测其对于多柔比星耐药活性的影响,同时采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测靶基因的表达变化。结果：MCF-7细胞株和耐药株MCF-7／ADR中miR-34a的相对表达量分别为1．01±0．03和0．76±0．04,在耐药细胞株中呈现下调表达,P=0．007。MTT结果显示,MCF7及其耐药株MCF-7／ADR细胞多柔比星半数抑制浓度Ic5。分剐为（0,22±0．02）和（18．7±0．09）ftmol／L。对耐药株MCF-7／ADR过表达miR34a后,MCF-7／ADR细胞对多柔比星的ICso降低为（10．7士0．11）mol／L,明显增强此细胞株对于多柔比星的耐药敏感性。实时定量PCR结果显示,与转染阴性对照RNA相比,于耐药株MCF7／ADR细胞中转染miR--34a后耐药相关靶基因Bcl-2和CCNDl的mRNA水平分别降低了0．46±0．02（P=0．002）和0．33±0．02（P=0．008）。蛋白质印迹结果显示,过表达miR-34a后,可明显下调靶基因Bcl-2和CCNDl的表达。结论：上调表达miR34a可以增加耐药细胞株MCF-7／ADR对于多柔比星的耐药敏感性。     

腺病毒载体介导的发夹状RNA抑制三氧化二砷耐药的K562/AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

 目的　构建MRP1特异性发夹状RNA（shRNA）重组腺病毒载体,并研究其对耐三氧化二砷（ATO）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法　构建MRP1特异性shRNA重组腺病毒,并感染K562／AS2细胞;用荧光实时定量PCR法分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达;MTT法检测该细胞对ATO及依托泊苷（VP16）的细胞毒作用。结果　pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒感染前后,K562／AS2细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平分别为（34.70±0.28）、（4.19±0.03）（P＜0.05） 和 （26.40±0.16）、（10.85±0.37）（P＜0.05）;感染前后K562／AS2细胞对ATO及VP16耐药倍数分别为（11.4078±0.3183）、（1.6126±0.3015）和（5.9141±0.0149）、（1.7664±0.1038）,逆转倍数分别为（7.2409±1.3668）和（3.3555±0.1886）（P＜0.05）。结论　成功构建了pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒载体,该载体感染K562／AS2细胞后可抑制细胞MRP1基因表达以及逆转该细胞对ATO和VP16的耐药。     

PCNA的表达与人乳腺癌细胞凋亡的关系

目的：研究增殖细胞核抗原（PCNA）的表达与人乳腺癌细胞凋亡的关系。方法：以乳腺癌细胞株MCF-7／S（化疗敏感细胞株）为研究对象,应用MTT比色法检测阿霉素（ADR）对体外培养的MCF-7／S细胞增殖抑制作用,末端标记（TUNEL）法检测ADR诱导乳腺癌细胞凋亡,免疫细胞化学法检测ADR作用前后PCNA的表达。结果：ADR抑制MCF-7／S细胞增殖,旱剂量依赖性,IC50为0．128mg／L;ADR作用组MCF-7／S细胞的凋亡率（Apoptoticrate,AR）为0．261,与对照组细胞的凋亡率0．0449相比明显增高（P〈0．01）;PCNA阳性表达率为0．3371,与对照组PCNA阳性表达率0．5152相比明显降低（P〈0．01）。结论：乳腺癌肿瘤细胞的凋亡率（AR）和PCNA的阳性表达呈负相关;ADR能诱导MCF-7／S细胞凋亡,并能抑制其增殖。     

雌激素受体GPR30 RNAi干扰载体的构建及在耐药乳腺癌细胞MCF-7R中的效果验证

目的：采用RNA干扰（RNAi）技术研究耐药乳腺癌细胞MCF-7R中GPR30表达。方法：利用他莫昔芬（tamoxifen,TAM）诱导乳腺癌细胞MCF-7建立耐药乳腺癌细胞株。以GPR30为靶基因,pGenSil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的GPR30基因核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,Lipofectin2000转染MCF-7R细胞,G418筛选获得阳性克隆细胞扩大培养。Trizol法提取细胞总RNA,半定量RT-PCR检测GPR30的表达。结果：经TAM处理可以诱导GPR30 mRNA的表达,HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定重组干扰载体pGg30-1、pGg30-2得到了与预期大小相符的片段,RT-PCR显示,未转染组MCF-7R细胞GPR30mRNA的表达量明显高于转染pGg30-1、pGg30-2的MCF-7R细胞,而转染空载体组细胞未见明显变化。结论：RNAi技术可成功构建抑制GPR30表达的小干扰RNA重组体。     

miR-490-3p逆转MCF-7／ADM细胞对阿霉素耐药性的影响

【摘 要】目的 探讨miR-490-3p在阿霉素（ADM）耐药乳腺癌细胞系MCF-7／ADM中的表达情况及其对MCF-7／ADM细胞增殖、凋亡和ADM耐药的影响。方法 以野生型人乳腺癌细胞系MCF-7及其耐药型细胞系MCF-7／ADM为研究对象,用实时荧光定量PCR（qPCR）比较两种细胞中miR-490-3p的表达水平,将miR-490-3p的过表达载体pcDNA1（+）miR-490-3p瞬时转染至MCF-7／ADM细胞（过表达组）后采用qPCR检测转染效果,同时设pcDNA3.1（-）空载体对照组和空白对照组;采用MTT法测定转染pcDNA3.1（+）miR-490-3p对各组MCF-7/ADM细胞增殖能力的影响,测定ADM对MCF-7／ADM细胞的增殖抑制率并计算半数抑制浓度（IC50）及逆转倍数以评价对ADM敏感性的变化;分别于瞬时转染48 h后用Annexin V／FITC流式细胞术检测各组MCF-7/ADM细胞的凋亡率,Western blotting检测耐药蛋白P-糖蛋白（P-gp）,乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达,荧光分光光度计检测胞内ADM药物浓度,流式细胞仪检测P-gp活性。结果 MCF-7／ADM细胞中miR-490-3p的表达水平为0.24±0.07,显著低于野生型MCF-7细胞的1.02±0.03（P＜0.05）;过表达组瞬时转染24～96 h的miR-490-3p水平持续升高,均高于空载体对照组和空白对照组（P＜0.05）;过表达组的增殖抑制率随转染时间的延长而增加,转染24、48、72和96 h的增殖抑制率依次为（17.52±1.87）％、（31.67±2.79）％、（45.09±1.88）％和（61.82±2.52）％,高于空载体对照组（P＜0.05）;ADM对过表达组的IC50值为（11.27±2.34）μg／ml,低于空白对照组的和空载体对照组（P＜0.05）,且过表达组相对于空白对照组和空载体对照组的逆转倍数分别为3.35倍和3.39倍;与其余两组相比,过表达组的MCF-7/ADM细胞早、晚期凋亡率和细胞内药物浓度均升高,P-gp、BCRP和MRP1表达及P-gp活性均降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 上调miR-490-3p可逆转MCF-7／ADM细胞对ADM的耐药性,可能通过降低耐药蛋白表达及抑制P-gp活性有关,且升高其水平可抑制细胞增殖并诱导凋亡。     

微小RNA-152对乳腺癌细胞增殖及阿霉素敏感性影响的实验研究

目的 探讨微小RNA-152（miR-152）对乳腺癌细胞阿霉素敏感性的影响及其作用机制。方法 采用实时定量PCR（QPCR）检测人乳腺上皮细胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7细胞及阿霉素耐药株MCF-7／ADR细胞中的miR-152水平,分别向MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞转染miR-152模拟物 mimics（过表达组）和阴性对照NC（阴性对照组）,以未行转染为空白对照组。采用QPCR检测转染后MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞中miR-152的表达情况,采用MTT法检测不同浓度阿霉素（10、50、100、200和500 ng/ml）处理后各组的增殖情况,流式细胞术检测转染后各组的凋亡率,Western blotting检测磷脂酰肌醇激酶-3催化亚基α基因（PIK3CA）的蛋白水平,双荧光素酶报告实验评价miR-152对PIK3CA的靶向调控作用。结果 QPCR实验结果 表明MCF-7细胞和MCF-7／ADR细胞中的miR-152水平均低于HBL-100细胞,且MCF-7／ADR细胞的miR-152水平均低于MCF-7细胞,差异有统计学意义（P＜0.05）;过表达组转染后的miR-152水平均高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）。与其余两组比较,过表达组的存活率降低而凋亡率升高,且PIK3CA蛋白水平也降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。miR-152可抑制野生型PIK3CA 3’ UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型PIK3CA 3’UTR的荧光素酶活性无影响。结论 miR-152表达在乳腺癌细胞中降低,且与阿霉素耐药有关,参与乳腺癌细胞的增殖和凋亡过程,在逆转乳腺癌耐药中发挥重要作用,具有一定价值。     

microRNA-21对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株多柔比星耐药性影响的研究

目的:探讨microRNA-21(miR-21)基因表达改变对乳腺癌细胞多柔比星化疗耐药的影响.方法:人工合成miR-21模拟序列或干扰序列,以脂质体为载体,转染乳腺癌细胞MCF-7及其多柔比星耐药细胞株MCF-7/ADR;应用荧光定量RT-PCR检测miR-21的表达;应用MTT法检测细胞转染前后对多柔比星的耐药性;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;应用蛋白质印迹法检测PTEN、BAX及Bcl-2蛋白的表达.结果:MTT检测结果示,MCF-7及其耐药株MCF-7/ADR细胞多柔比星半数抑制浓度(IC50)分别为(0.28±0.03)和(17.5±0.12) μmol/L.miR-21表达上调,MCF-7细胞对多柔比星的IC50明显增高为(3.65±0.12) μmol/L;miR-21表达下调,MCF-7/ADR细胞对多柔比星的IC50明显降低为(7.53±0.11) μmol/L.流式细胞分析显示,miR-21下调后MCF-7/ADR细胞凋亡率明显增加.同时,细胞内PTEN、BAX蛋白表达水平增加,Bcl-2表达降低.结论:miR-21在乳腺癌化疗耐药中具有重要作用,抑制miR-21的表达可以逆转乳腺癌多柔比星耐药细胞株对多柔比星的耐药性.     

Role of PKC-ERK signaling in tamoxifen-induced apoptosis and tamoxifen resistance in human breast cancer cells

This study was designed to investigate the role of protein kinase C (PKC) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) signaling in tamoxifen (TAM)-induced apoptosis and drug resistance in human breast cancer cells. Drug-sensitive, or estrogen receptor (ER)-positive human breast carcinoma cells (MCF-7) and the multi-drug-resistant variant (ER-negative) MCF-7/ADR cells were treated with doses of TAM for various periods of time. Cell viability and apoptosis were assessed using cell counting, DNA fragmentation and flow cytometric analysis. We found that TAM administration caused a significant increase in apoptosis of MCF-7 cells but not MCF-7/ADR cells. Western blot analysis revealed enhanced expression of PKCδ but decreased expression of PKCα in ER-positive MCF-7 cells; while ER-negative MCF-7/ADR cells had decreased levels of PKCδ and increased levels of PKCα. Interestingly, we observed that in MCF-7 cells, TAM stimulated apoptosis by promoting rapid activation of PKCδ, antagonizing downstream signaling of ERK phosphorylation; while in MCF-7/ADR cells, TAM upregulated PKCα, which promoted ERK phosphorylation. These results suggest that PKCδ enhances apoptosis in TAM-treated MCF-7 cells by antagonizing ERK phosphorylation; while the PKCα pathway plays an important role in TAM-induced drug resistance by activating ERK signaling in MCF-7/ADR cells. The combination of TAM with PKCα and ERK inhibitors could promote TAM-induced apoptosis in breast cancer cells.     

β-榄香烯对MCF-7／ADM细胞株中乳腺癌干细胞作用的初步研究

目的探讨乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADM与阿霉素敏感细胞株MCF-7／S中乳腺癌干细胞（BCSCs）含量及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和P-糖蛋白（P-gp）表达的差异,观察中药β-榄香烯（β-ELE）对BCSCs及BCRP和P-gp表达的影响。方法 应用无血清细胞培养法培养MCF-7／ADM和MCF-7／S细胞株,形态学观察不同细胞株无血清细胞球培养的成球率,RT PCR检测两种细胞株中BCRP和P-gp的mRNA水平,流式细胞仪检测BCRP和P-gp的阳性表达率及CD44+CD24^-／low细胞比例。应用15μg/ml β-ELE作用MCF-7/ADM细胞株48h后,检测细胞成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白表达的变化。结果 与MCF-7／S细胞比较,MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp mRNA水平较高。MCF-7／ADM细胞中BCRP和P-gp蛋白的阳性表达率分别为（77.78±9.55）％和（32.33±5.12）％,CD44+CD24-／low细胞比例为（64.79±11.78）％,均高于MCF-7／S细胞的（3.97±1.51）％、（14.26±2.51）％和（18.79±3.28）％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。β-ELE能明显抑制MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白的表达（P＜0.01）。结论 MCF-7／ADM是BCSCs相对富集的一种耐药细胞株且高表达BCRP和P gp,β-ELE能够抑制MCF-7／ADM细胞中BCSCs比例及其成球率,并降低耐药蛋白的表达。     

米非司酮逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐多柔比星机制的探讨

目的 探讨米非司酮对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR的逆转耐药作用.方法 以亲本乳腺癌细胞MCF-7和耐多柔比星(阿霉素)乳腺癌细胞MCF-7/ADR为研究对象,分别应用MIF进行干预后,流式细胞仪检测MIF作用前后瘤细胞P-gp的表达、细胞内阿霉素蓄积量的变化以及细胞周期的分布.结果 (1)10 μmol/L MIF作用72小时后,MCF-7/ADR细胞P-gp表达率[(23.21±1.80)％]明显高于MCF-7细胞[(19.37±2.37)％,P＜0.05].(2)5 μmol/L ADR处理后,MCF-7/ADR细胞内ADR蓄积量为(47.13±4.11)％,低于MCF-7细胞[(60.24±2.61)％,P＜0.05].(3) 10 μmol/L MIF联合5 μmol/L ADR处理细胞,MCF-7/ADR和MCF-7细胞内ADR的蓄积量分别为(82.72±2.42)％及(88.63±2.75)％ (P ＞0.05);但均较单用ADR时升高(均P＜0.01).(4) MIF作用前,MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例[(77.21±3.10)％]高于MCF-7细胞G0/G1期比例[(59.05±2.16)％,P＜0.05];MCF-7/ADR细胞S期比例明显低于MCF-7细胞(P＜0.05).经10 μmol/L MIF作用后,MCF-7细胞G0/G1期比例(75.28±2.53)％较MIF作用前明显升高(P＜0.05);S期比例则较MIF作用前显著降低(P＜0.05);MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例和S期比例分别为(80.13±2.72)％及(13.52±1.03)％,与MIF作用前比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);两种瘤细胞的G2/M期比例与MIF作用无关(P＞0.05).结论 (1)MIF可以逆转MCF-7/ADR的耐药性,其作用机制与降低细胞P-gp含量、增加细胞内ADR蓄积量有关.(2) 10 μmol/L浓度的MIF对MCF-7/ADR细胞周期分布影响不大.     

MALAT1靶向微小RNA-206对乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的影响

目的探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)靶向调控微小RNA-206(miR-206)表达及对乳腺癌细胞三苯氧胺(TAM)敏感性的影响。方法采用实时定量PCR(QPCR)检测乳腺癌细胞MCF-7及其TAM耐药株MCF-7/TAM的MALAT1水平;脂质体法向MCF-7/TAM细胞转染3条靶向MALAT1的小干扰RNA(si-MALAT1),经QPCR筛选干扰效果最佳的si-MALAT1片段进行后续实验。将MCF-7/TAM细胞分为转染si-MALAT1片段的干扰组、转染无关序列的阴性对照(NC)组和未转染的空白对照(Blank)组,MTT比色法、划痕实验和Transwell小室实验检测5μg/ml TAM处理后的增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9水平,采用荧光素酶报告实验验证MALAT1对miR-206的靶向调控作用。结果MCF-7/TAM细胞的MALAT1水平高于其亲本MCF-7细胞(P<0.05)。与Blank组和NC组相比,干扰组的MALAT1水平降低至0.372±0.045(P<0.05)。干扰组MCF-7/TAM细胞转染48、72 h的增殖活力低于Blank组和NC组(P<0.05);干扰组的划痕愈合率和穿膜细胞数分别为(28.399±2.032)%和(296.367±10.118)个,低于Blank组的(69.674±4.337)%和(463.062±18.159)个及NC组的(67.526±3.185)%和(472.675±20.941)个(P<0.05);与Blank组和NC组相比,干扰组的MMP-2和MMP-9水平均降低(P<0.05)。Blank组和NC组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-206 mimics能抑制MALAT1野生型荧光素酶活性(P<0.05),但对突变型无影响(P>0.05)。结论MALAT1在乳腺癌TAM耐药株中表达升高,而下调MALAT1水平可增加耐药株的TAM敏感性并抑制侵袭和迁移,可能通过靶向miR-206来发挥促癌作用。