甘草素在体外不同种属肝微粒体中的代谢差异研究

目的对甘草苷的苷元甘草素在体外不同种属肝微粒体中的代谢差异进行比较研究,为甘草苷的进一步研究开发提供参考依据。方法甘草素与不同种属,包括大鼠、小鼠、人、犬及猴的肝微粒体进行孵育,比较其代谢稳定性和代谢转化情况。代谢稳定性通过底物消除法分析甘草素的剩余底物浓度水平随时间的变化,计算体外消除半衰期(t1/2)。进一步对甘草素在肝微粒体孵育后生成的代谢产物谱以及代谢途径进行分析。结果在I相肝微粒体孵育体系中,甘草素在5个种属肝微粒体中发生代谢的t1/2依次为大鼠小鼠人猴犬;在II相肝微粒体孵育体系中,甘草素代谢都非常快,除小鼠外,均在5 min内下降50%以上。甘草素与人肝微粒体进行II相孵育产生的代谢产物谱和猴的相同,其余种属则与人有明显不同。结论甘草素在猴肝微粒体中的代谢稳定性和代谢产物谱均与人最相似,其次为犬肝微粒体,大鼠和小鼠则与人存在明显差异。在进一步的临床前药代和毒理研究中可选用猴或犬作为模型动物。     

芦西丁在不同种属肝微粒体和肝S9中Ⅰ相代谢及Ⅱ相磺酸化代谢的稳定性考察

目的 采用4个种属体外肝微粒体和肝S9孵育体系评价芦西丁Ⅰ相代谢、Ⅱ相磺酸化代谢稳定性，比较其体外代谢的种属差异。方法 建立并验证了基于超高效液相色谱-高分辨质谱法（UHPLC-HRMS）的芦西丁定性、定量检测方法，将芦西丁与大鼠、小鼠、比格犬、人肝微粒体和肝S9分别进行孵育，考察其代谢稳定性参数、代谢产物和代谢途径。结果 在Ⅰ相和Ⅱ相磺酸化孵育体系中，芦西丁代谢的肝清除率大小排序为小鼠>大鼠>比格犬>人，在大鼠、比格犬、人肝微粒体和肝S9中，其代谢稳定性均良好，而在小鼠肝微粒体和肝S9中，分别表现为代谢不稳定和代谢稳定性中等；在4个种属中快速识别了5个代谢产物，其中Ⅰ相氧化产物3个，Ⅱ相磺酸化产物2个，代谢产物的生成速率与代谢稳定性结果较为一致。结论 建立的UHPLC-HRMS简便、专属性强，可用于芦西丁的代谢稳定性和代谢产物研究。芦西丁Ⅰ相和Ⅱ相磺酸化的体外代谢稳定性、代谢产物生成速率存在明显的种属差异，其在人、大鼠、比格犬中的代谢特征较为相近，可为芦西丁体内代谢研究、安全性评价及动物模型选择提供参考依据。     

HK-5的体外代谢研究

目的考察HK-5在人、SD大鼠、比格犬、小鼠和猴肝微粒体中的代谢稳定性;测定人肝微粒中HK-5代谢表型。方法采用LC-MS测定HK-5在五个种属肝微粒体中孵育不同时间点后的剩余浓度;在人肝微粒体中使用化学抑制剂对各CYP亚酶特异性抑制,比较化学抑制剂对HK-5的抑制率。结果 HK-5在5个种属的肝微粒体中体外代谢半衰期(T1/2)分别为42.5,38.3,70.7,70.0,60.9 min,肝微粒体固有清除率(CLint)分别为0.033,0.036,0.020,0.020,0.023ml·(min·mg蛋白)-1,体内固有清除率(CL'int)分别为32.7,64.8,29.7,78.8,34.2ml·(min·mg)-1。HK-5在SD大鼠肝微粒体和人肝微粒体代谢速率相近,相对较快;在猴、比格犬和小鼠肝微粒体中代谢速率相近,均比较慢;代谢速率存在一定的种属差异。代谢表型实验中发现HK-5在人肝微粒体中主要经CYP3A4,CYP2D6和CYP2A6三种亚酶催化代谢。结论 HK-5在人和SD大鼠肝微粒体中有相近的T1/2和CLint,后期体内代谢实验可选用SD大鼠进行研究;HK-5由多种CYP亚酶代谢,代谢性药物相互作用发生概率降低。     

厚朴提取物HK-1在5个种属肝微粒体中的代谢

目的研究厚朴抗炎有效成分(E)-5-allyl-3'-(prop-1-enyl)biphenyl-2,4'-diol(HK-1)在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠的肝微粒体中的代谢稳定性,确定HK-1在大鼠肝微粒体中代谢表型。方法将HK-1在5个种属肝微粒体中孵育,采用UPLC-MS/MS检测方法,通过测定HK-1的剩余浓度,考察它们的代谢稳定性并外推其体内代谢清除率。化学抑制剂法鉴定在大鼠肝微粒体中HK-1的代谢表型。结果 HK-1在人、大鼠、比格犬、猴和小鼠5个种属肝微粒体中半衰期(t_(1/2))分别为9.04、7.36、2.17、4.94、18.09 min;肝微粒体中固有清除率CL_(int)分别为153.40、188.20、639.02、280.60、76.60 m L/(min·mg蛋白);体内固有清除率CL'_(int)分别为151.87、338.76、949.21、416.69、301.61 m L/(min·kg)。在大鼠肝微粒体中HK-1主要被细胞色素CYP2E1、CYP2C、CYP1A2催化代谢。结论HK-1在肝微粒体中由多种酶代谢且代谢很快,其中人肝微粒体和大鼠肝微粒体中半衰期和固有清除率相似,可将大鼠肝微粒体预估人肝微粒体不良反应的风险。     

小檗碱的酶反应动力学及其代谢酶表型和代谢产物研究

目的 采用混合人肝微粒体和重组人源细胞色素酶P450（CYP）同工酶,研究小檗碱的代谢特性,明确参与小檗碱代谢的CYP酶亚型及其贡献度,并确证相关代谢产物的结构。方法 将混合人肝微粒体分别与20、100、200、400、600、800、1 200 ng/mL的小檗碱共同孵育后,计算小檗碱酶反应动力学米氏常数（K_m）、最大反应速率（V_max）、体外肝微粒体对药物的固有清除率（CL_int）;采用CYP酶的特异性抑制剂研究小檗碱的代谢表型;将重组人源CYP同工酶CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9与一定质量浓度的小檗碱孵育,UPLC法测定孵育液中原形药物的剩余量和代谢产物的生成量;整体归一化法计算各酶的代谢贡献度;LC-MS/MS法鉴定相关代谢产物。结果 小檗碱在混合人肝微粒体中的V_max为1.51 nmol?mg^?1?h^?1;K_m为2.69 nmol/mL;CL_int为0.56 mL?mg^?1?h^?1。CYP2D6的特异性抑制剂奎尼丁和CYP1A2的特异性抑制剂呋喃茶碱对小檗碱的代谢有显著抑制作用,其他CYP酶抑制剂对小檗碱的代谢无显著影响。CYP2D6、CYP1A2对小檗碱代谢产物M₁（去亚甲基小檗碱）的贡献度分别为75.253 9%、23.323 6%;对M₂产物（唐松草分定或小檗红碱）的贡献度分别为46.893 8%、8.679 5%。小檗碱在体外混合人肝微粒体温孵体系中的主要代谢途径为O-去甲基化,可生成去亚甲基小檗碱和唐松草分定或小檗红碱。结论 小檗碱在肝脏中主要被CYP2D6和CYP1A2代谢,分别生成去亚甲基小檗碱、唐松草分定或小檗红碱。     

HPLC-MS法测定去氢骆驼蓬碱在人肝微粒体中代谢产物

目的:测定人肝微粒体中去氢骆驼蓬碱的代谢产物。方法:以去氢骆驼蓬碱为研究对象,采用高效液相色谱-离子阱-质谱系统分析去氢骆驼蓬碱经肝微粒体代谢的代谢产物。结果:去氢骆驼蓬碱在人肝微粒体中经Ⅰ相代谢后产物主要为哈尔酚。结论:哈尔酚为首次报道的代谢产物,本研究利用液质联用技术阐明了去氢骆驼蓬碱的体内代谢产物,为进一步研究奠定了基础。     

应用全胚胎培养方法研究野百合碱对 小鼠胚胎发育的影响

目的:探讨野百合碱的胚胎发育毒性.方法:采用小鼠全胚胎培养模型,将8.5 d小鼠胚胎在含有野百合碱的即刻离心血清中培养48 h(野百合碱的终浓度分别为100,50,25,12.5 mg·L-1),观察野百合碱对胚胎生长发育(卵黄囊直径、颅臀长、头长、体节数)和组织器官形态分化(卵黄囊循环、尿囊、翻转、心、脑、尾神经管、视听嗅系统、腮弓、颌突、肢芽)的影响.结果:随野百合碱浓度的增加,胚胎的生长发育和组织器官形态分化受到的影响越来越严重,其中以视听系统、颌突、肢芽等项的影响最为明显.结论:野百合碱对体外培养的小鼠胚胎有明显的毒性作用,提示妊娠期暴露于该化合物对胎儿具有潜在的毒性.     

人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶参与马钱子碱和士的宁体外代谢研究北大核心CSCD

目的考察参与士的宁和马钱子碱Ⅱ相代谢的主要人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGTs)亚型,为预测其与其他药物代谢性相互作用提供理论借鉴。方法士的宁和马钱子碱分别与大鼠肝微粒体(RLMs)、人肝微粒体(HLMs)和12种主要人重组UGTs亚酶进行孵育,采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法检测士的宁和马钱子碱葡糖醛酸代谢产物,考察参与其体外Ⅱ相代谢UGTs亚酶类型。结果马钱子碱和士的宁均在HLMs里生成1个单葡糖醛酸代谢产物,而在RLMs中未产生,单酶试验中二者均只在UGT1A4重组酶中发生代谢。结论马钱子碱和士的宁在人鼠代谢中存在种属差异,UGT1A4为其主要代谢亚酶。该研究结果可为临床预防马钱子因药物代谢性相互作用引发的不良反应提供理论和实验依据。     

黄连碱在人肝微粒体中的代谢

目的研究黄连碱在人肝微粒体中的代谢情况。方法通过酶促动力学实验计算酶促动力学参数,通过检测CYP450亚酶专属性抑制剂对黄连碱代谢的影响,推测参与黄连碱代谢的CYP酶亚型,并推断代谢产物的结构。结果黄连碱在人肝微粒体中代谢的米氏常数Km为6.802 7μmol/L,最大代谢速率Vmax为0.054 76 nmo L/(mg protein·min),肝清除率Clint为0.008 m L/(mg·min),奎宁、甲氧沙林、酮康唑均在一定程度上抑制了黄连碱的代谢,黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物为黄连碱脱去一个亚甲基结构。结论 CYP2D6、CYP2A6、CYP3A4可能参与黄连碱的代谢,代谢产物为脱亚甲基黄连碱。     

升板方对SD大鼠CYP3A1酶活性的影响

目的:研究升板方对于SD大鼠肝微粒体CYP3A1酶活性的影响,为临床化疗联合用药方案提供参考。方法:将25只SD雄性大鼠随机分为升板方高(8.645 g/kg)、中(4.322 g/kg)、低(2.161 g/kg)地塞米松诱导组(灌胃100 mg/kg,1次/d,连续3 d),及空白对照组(灌胃给予生理盐水,10 mL/kg,2次/d,连续14 d)。升板方各剂量组均灌胃给药,2次/d,连续14 d。以睾酮为底物探针,建立稳定、可靠的检测大鼠CYP3A1酶代谢活性的HPLC方法,考察体外代谢体系最佳的孵育时间、最佳蛋白浓度、最佳底物浓度,在最佳孵育条件下根据大鼠肝微粒体转化生成6β-羟基睾酮的速率,评价各组大鼠肝药酶的活性。结果:在大鼠肝微粒体孵育体系,睾酮代谢为6β羟基睾酮反应的最佳孵育时间是10 min,最佳酶蛋白浓度是0.25 mg/mL,最佳底物浓度为200μmol/L。在最佳孵育条件下,升板方高、中、低剂量组及空白对照组、地塞米松诱导组6β-羟基睾酮生成速率分别是:(55.82±5.97)、(65.10±6.83)、(60.89±6.53)、(62.17±6.55)、(126.73±15.40)μmol/(L.mg pro.min)。经统计学检验,升板方高中低剂量组与地塞米松组反应速率的差异有统计学意义(P0.05),与生理盐水组无统计学差异。而升板方各剂量组间均无统计学差异。结论:升板方对大鼠肝药酶CYP3A1酶活性无诱导作用。     

荜茇中3种酰胺类生物碱在不同种属肝微粒体中代谢差异比较

胡椒碱、荜茇明宁碱和墙草碱是荜茇中主要的酰胺类成分,具有多种药理活性,为了阐明这3种成分在5个不同种属肝微粒体中代谢差异,应用超高效液相色谱串联双压线性离子阱静电场轨道阱质谱(UHPLC-LTQ-Orbitrap MS)采集这3种化合物的全扫描图谱及二级三级质谱图,获取碎片离子信息,结合其质谱裂解规律和代谢产物精确质谱数据,比较3种生物碱分别在人、恒河猴、比格犬、大鼠以及小鼠肝微粒体中的代谢差异,并快速鉴定出3个胡椒碱代谢产物、2个荜茇明宁碱代谢产物及1个墙草碱代谢产物。结果显示荜茇中酰胺类生物碱的主要代谢类型为苯环亚甲二氧基开环脱甲基和氧化反应,且在种属间存在代谢率差异,该研究为进一步阐明荜茇中胡椒碱类成分体内代谢途径提供了实验依据。     

基于精密肝切片技术的野百合碱体外肝毒性初步研究

目的:对精密肝切片技术进行实验条件的优化,并依此技术对野百合碱的体外肝毒性进行初步的研究探讨.方法:利用震荡切片机制备肝切片,通过对培养液、切片厚度、pH及不同培养温度等条件下,肝切片MTT还原能力的测定,建立肝切片培养技术,并将肝切片与野百合碱共培养,连续监测法侧定GPT,GOT,LDH,GGT酶活浓度,BCA法测定蛋白含量,观察其对肝切片MTT还原能力及以上生化指标的影响.结果:精密肝切片厚度在200μm,pH6.8,37℃,BPM培养液中肝切片MTT还原能力最强;野百合碱0.02,0.1,0.5g·L-1与肝切片共培养24h,LDH漏出率显著上升,蛋白含量显著下降;野百合碱3个剂量组与肝切片共培养6h,对MTT还原能力及生化各项指标无明显影响.结论:大鼠精密肝切片在BPM培养基的优化培养条件下,MTT还原能力可维持24h;野百合碱0.02,0.1,0.5g·L-1与肝切片共培养24h,显示出一定的肝脏毒性.     

香柑内酯在不同种属肝微粒体中的代谢差异研究

[目的]研究香柑内酯在7种不同肝微粒体中的代谢差异。[方法]采用肝微粒体体外孵育的方法研究香柑内酯在7种不同种属肝微粒体中的代谢差异。使用四级杆飞行时间液质联用(Q-TOF-LC/MS)法检测分析代谢产物。[结果]香柑内酯与7种肝微粒体孵育后共检测出4种不同的代谢产物,通过分析代谢产物的种类及含量,香柑内酯在比格犬和大鼠肝微粒体中的代谢与在人肝微粒的代谢较为相近。[结论]通过研究发现,香柑内酯在比格犬和大鼠肝微粒体中的代谢与在人肝微粒体中的代谢较为接近。     

苦豆碱对野百合碱致大鼠肺动脉高压的保护作用

目的:研究苦豆碱对野百合碱致大鼠肺动脉高压的影响。方法:将SD大鼠随机分为6组:对照组、模型组、苦豆碱25mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg及西地那非30 mg/kg组。模型组和各给药组大鼠给予野百合碱60 mg/kg造模,对照组给予等量生理盐水。21天后开始灌胃给予大鼠相应的药物,每天一次。在实验第43天,测量各组大鼠血流动力学指标、组织学指标、超声心动图指标及心电图指标。结果:苦豆碱25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg可以在不同程度上改善肺动脉高压大鼠中由野百合碱导致的血流动力学指标、组织学指标、超声心动图指标及心电图指标的不利变化。结论:苦豆碱对野百合碱致大鼠肺动脉高压具有保护作用。     

UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术鉴定石斛碱在人肝微粒体中的代谢产物

目的:通过UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对石斛碱在人肝微粒体中的主要代谢产物进行鉴定与分析。方法:运用人肝微粒体体外温孵法,模拟细胞色素P450酶(CYP450)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)酶反应体系,采用Thermo Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统分析,Hypersil Gold C_(18)色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.9μm),流动相0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱,流速0.3 m L·min~(-1),电喷雾离子源(ESI)正离子模式检测。结果:通过精确相对分子质量和二级碎片离子信息,鉴定了石斛碱在人肝微粒体中Ⅰ相代谢的4个主要代谢产物,依次标记为M-250([M+H]+m/z 250.180 1),M-262([M+H]+m/z 262.180 0),M-280([M+H]+m/z 280.190 6),M-296([M+H]+m/z 296.185 6),以及Ⅱ相代谢的1个主要代谢产物,标记为M-440([M]+m/z 440.227 8)。结论:所建立的UPLC/LTQ-Orbitrap-MS测定人肝微粒体中石斛碱及其代谢产物的方法灵敏、快捷,可应用于石斛碱在人肝微粒中的代谢研究,同时为石斛碱的药物代谢动力学研究提供了实验依据。     

3种中药成分对大鼠CYP3A4酶代谢的影响

目的:探讨3种中药成分(延胡索乙素、甲基莲心碱、三七总皂苷)对CYP3A4酶代谢活性的影响,以了解中药与CYP3A4酶底物联合用药时可能产生的相互作用.方法:采用超高速离心法制备大鼠肝脏微粒体,建立体外肝脏微粒体混合酶代谢体系.以睾丸酮作为底物探针,用HPLC建立检测CYP3A4酶代谢活性的方法,分别考察体外代谢体系的最适宜底物浓度、代谢时间、pH、孵育温度以及磷酸盐浓度.在确定的条件下,将3种中药成分稀释成不同浓度,分别与睾丸酮共同孵育于肝微粒体代谢体系中,测定在有或无中药成分存在下代谢产物6β-羟基睾丸酮的产生量,以评估中药成分对CYP3A4酶代谢的影响.结果:在肝微粒体孵育体系中,睾丸酮代谢为6β-羟基睾丸酮最适宜的体外代谢条件为底物浓度200μmol·L~(-1),代谢时间3.5 h,pH 7.0,孵育温度37℃,磷酸盐终浓度0.1 mol·L~(-1).延胡索乙素和三七总皂苷均对CYP3A4酶的抑制作用较弱,IC_(50)>100μmol·L~(-1),甲基莲心碱有一定的抑制作用,IC_(50)为(47.5±2.3)μmol·L~(-1).结论:延胡索乙素和三七总皂苷对CYP3A4酶代谢无明显影响,提示这2种中药成分与CYP3A4酶底物之间的相互作用较低,甲基莲心碱有可能会产生微弱的药物相互作用.     

松脂醇二葡萄糖苷在人和大鼠肝微粒体中的代谢比较

目的 比较松脂醇二葡萄糖苷在人和大鼠肝微粒体中的代谢.方法 将人和大鼠肝微粒体在体外分别与松脂醇二葡萄糖苷共同孵育,高效液相色谱串联四极杆质谱(HPLC/QQQ-MS)法分析该成分及其代谢产物,二级质谱扫描来推测化学结构.结果 最佳条件为肝微粒体质量浓度20 mg/mL,孵育时间120 min,松脂醇二葡萄糖苷在人和大...     

LC-MS/MS研究人体及人肝微粒体内盐酸非洛普代谢产物

 目的 通过在体及离体实验阐明盐酸非洛普代谢情况。方法 健康志愿者口服盐酸非洛普60 mg,收集系列时间点血样,采用液相色谱串联质谱法检测志愿者血浆中的代谢产物并推测其可能结构;在建立人肝微粒体孵育体系中加入盐酸非洛普,常规温孵,采用液质联用仪分析孵育体系中的代谢产物,与在体实验进行对比。结果 在志愿者血浆中,除原型外检测到1个代谢产物,代谢物的m/z为212.1,推测其结构可能为盐酸非洛普分子中间断裂产物;在人肝微粒体孵育体系中,除原型外共检测到 6个代谢产物,m/z分别为360.1、342.2、415.1、281.4和330.2,推测其分别为盐酸非洛普氧化、脱氢、甲基化并结合甘氨酸、失掉相对分子质量62.6片段以及脱甲基的产物。结论 盐酸非洛普在志愿者体内及体外人肝微粒体孵育体系中的主要代谢产物不同。盐酸非洛普在人体内可能存在肝脏以外的其他代谢途径,并起主要作用。
     

采用肝微粒体研究夫拉平度葡萄糖醛酸化代谢的性别及种属差异

 目的 研究夫拉平度（flavopiridol）在不同种属不同性别肝微粒体中葡萄糖醛酸化（UDP-glucuronosyl transferase,UGT）代谢速率及代谢机制。方法 采用人和4种动物（小鼠、大鼠、豚鼠、狗）雌雄两种性别的肝微粒体酶对夫拉平度的酶代动力学进行研究,以超高效液相色谱法测定葡萄糖醛酸化代谢反应物的浓度,比较葡萄糖醛酸化代谢速率。结果 夫拉平度在各种肝微粒体中都能被代谢并生成葡萄糖醛酸结合物。同一性别的5种动物的肝微粒体代谢夫拉平度的速率有种属差异（P     

UPLC-MS/MS研究披针灰叶素B在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性及代谢酶表型

应用体外肝微粒体孵育体系,研究披针灰叶素B(lanceolatin B)在大鼠、人、比格犬、猴肝微粒体中的代谢稳定性及体外代谢参数,确定主要代谢披针灰叶素B的CYP酶表型。将披针灰叶素B与不同种属肝微粒体共同孵育,应用UPLC-MS/MS检测孵育液中披针灰叶素B的含量,考察其代谢稳定性与体外代谢动力学参数。将披针灰叶素B与各CYP450同工酶CYP2E1,2C19,1A2,2D6,2C9,3A4,2A1的特异性抑制剂共同孵育,确定其代谢酶表型。研究结果显示,披针灰叶素B在人、比格犬肝微粒体中不代谢,而在大鼠与猴肝微粒体中可代谢,它们的体外半衰期(T_(1/2))与固有清除率(CL_(int))分别为11.57,8.07min和0.12,0.17 m L·min-1·mg-1,结果没有显著性差异;披针灰叶素B在肝微粒体中的代谢存在种属差异,在大鼠肝微粒体中由多个酶共同参与代谢,其中CYP1A2酶的作用最强,是主要代谢披针灰叶素B的酶。