人细小病毒B19主要抗原片段的表达及临床初步应用

我国临床人细小病毒B19(B19)感染的诊断和流行病学调查以及献血员筛查等方面的工作尚未广泛开展,原因之一是受诊断试剂和方法的局限.目前国际上商业B19抗体诊断试剂盒均以重组抗原为基础.本研究获取能表达B19结构蛋白VP1独特区和VP1/VP2共同区主要抗原片段,建立改良酶联免疫吸附法(ELISA),检测发病期患者和献血员血清中抗B19-IgM,并与德国IBL试剂盒平行比较.     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

南通地区正常人群中TT病毒感染的初步调查

[目的]为了解TT病毒在南通地区正常人群中的感染状况。[方法]采用巢式PCR法，检测了518例南通地区ALT正常的健康人群和献血员中TT病毒的感染现状，其中献血员143例，正常人375例。[结果]518例正常的健康人群中有52例阳性，阳性率为10．0％；143名献血员中有13例TT病毒阳性，阳性率为9．1％(13／143)；正常人群中阳性率为10．4％(39／375)。两组比较无显著性差异。[结论]南通地区ALT正常的健康人群亦存在TT病毒感染，并呈健康携带者状态；献血员中也存在一定数量的感染者。     

荆州市无偿献血者梅毒感染状况分析

[目的]通过对荆州市无偿献血者梅毒感染状况的分析了解,以便采取有效措施,阻断经血液传播梅毒,从而提高血液质量,以保证临床用血的安全可靠。[方法]所有标本检测采用ELISA方法初复检。[结果]合计检测88768名无偿献血者,梅毒抗体阳性感染率呈逐年上升趋势。[结论]荆州市无偿献血人群中,学生、军人梅毒抗体阳性率较低。     

湖南省弓形虫病研究概况

弓形虫病是一种人畜共患性寄生虫病。在我国弓形虫病对人体健康的危害已引起重视 ,从基础、流行病学及临床方面均开展了广泛的研究。本文就近 10年来湖南省弓形虫病研究概况进行综述。1　流行病学及临床研究弓形虫病广泛流行于世界各地 ,人群感染极为普遍[1] 。我国人群弓形虫感染率属于低感染度水平 ,曾宪芳等[2 ] 检测长沙地区人群血清 2 2 86份 ,其中部分为医院门诊病人血清 ,ＩＨＡ阳性率为 10 .8%。欧阳颗等[3] 用ＩＨＡ法检测该地区健康成人 110 0例 ,血清弓形虫抗体检出率为 2 .0 9%。比较男性 (2 .5 1% )与女性 (2 .11% ) ,献血员 (…     

多瘤病毒样颗粒的制备及血清学检测方法的建立

目的 制备多瘤病毒（John Cunningham virus,JCV）病毒样颗粒并建立JCV血清学检测方法,了解我国一般人群JCV流行情况。方法 通过基因合成技术合成JCV衣壳蛋白基因VP1,将其克隆至PET-21a质粒,转化BL21（DE3）大肠埃希菌,IPTG诱导表达,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定目的蛋白表达。采用2次超速离心法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE、透射电子显微镜及血凝试验鉴定纯化产物。以纯化产物为抗原建立间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法,筛查一般人群血清标本,分析该人群JCV感染情况。结果 通过透射电子显微镜观察及血凝试验鉴定,显示纯化产物具有和天然JCV颗粒类似的形态结构和血凝活性。以纯化的JCV病毒样颗粒为抗原建立了间接ELISA法,筛查了一般人群抗JCV IgG抗体,结果显示一般人群抗JCV IgG抗体阳性率为54.2%。结论 本研究制备了JCV病毒样颗粒,所建立的ELISA法可应用于JCV人群血清流行病学调查。     

人细小病毒B19主要抗片段的表达及临床初步应用

我国临床人细小病毒Ｂ19(Ｂ19)感染的诊断和流行病学调查以及献血员筛查等方面的工作尚未广泛开展 ,原因之一是受诊断试剂和方法的局限。目前国际上商业Ｂ19抗体诊断试剂盒均以重组抗原为基础。本研究获取能表达Ｂ19结构蛋白ＶＰ1独特区和ＶＰ1/ＶＰ2共同区主要抗原片段 ,建立改良酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ) ,检测发病期患者和献血员血清中抗Ｂ19 ＩｇＭ ,并与德国ＩＢＬ试剂盒平行比较。一、材料和方法1 标本来源 :全血细胞减少、再生障碍性贫血发病期患者血清 4 2份 ,来自天津血液病研究所和北京人民医院。献血员血清 12份 ,来自某研究…     

人细小病毒B19IgM抗体间接ELISA检测方法的初步建立

目的：利用原核表达并纯化的人细小病毒B19（HPV B19）结构蛋白VP1初步建立HPV B19 IgM酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法。方法以纯化的重组蛋白包被酶标板,建立IgM 间接ELISA检测方法,确定Cut-off值,并进行初步的应用。结果建立间接 ELISA方法Cut-off值为0．25,灵敏度为84．60％,特异性为99．70％,与对照试剂盒检测结果符合率为99．47％;用自产试剂盒检测115份孕妇和1700份健康献血志愿者血清中B19 IgM抗体,阳性率分别为12．17％和1．59％。结论通过包被 HPV B19-VP1蛋白建立的间接ELISA检测方法可用于 HPV B19早期感染或急性感染的辅助诊断。     

A组轮状病毒VP7基因表达及ELISA检测的方法研究

目的纯化原核系统中表达的A组轮状病毒VP7基因,建立间接ELISA方法,为进一步大量表达VP7基因,构建基因工程疫苗和建立快速临床检测奠定基础。方法反转录并扩增VP7基因,连接到载体中,转换乳酸杆菌,诱导并纯化重组蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备抗血清,并建立间接ELISA方法。结果成功获得VP7基因的扩增片段,筛选阳性克隆,得到大小为28 kD的大量表达蛋白。确定了间接ELISA法的最佳反应条件和工作浓度。结论构建的重组乳酸杆菌能够大量表达VP7蛋白,纯化的VP7蛋白有很好的免疫原性,制备的抗血清用于ELISA方法能够得到准确的检测结果。     

普通人群和献血员庚型肝炎病毒感染状况分析

为了解普通人群和献血员庚型肝炎病毒感染状况进行血清抗－ＨＧＶ检测。结果普通人群感染率为１％，献血感染率为４％。献血员中职业献血员同义务献血员及普通人群比较统计学上有显著差异。     

肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子重组蛋白的血清学诊断价值初探

目的克隆、表达肺炎嗜衣原体（Cpn）蛋白酶样活性因子（CPAF）的免疫优势区基因（CPAFm），初步评价其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX6p-2／CPAFm重组质粒，诱导表达重组蛋白，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定结果；将纯化蛋白免疫新西兰兔，间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其免疫原性；与人抗Cpn抗血清反应分析其免疫反应性。间接ELISA法检测Cpn IgG和沙眼衣原体（Ct）阳性血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为51.3×10^3的重组蛋白，蛋白质印迹法（Western blot）证明其能与人抗Cpn IgC抗体发生反应；在被免疫的新西兰兔体内，特异性IgG抗体的滴度为1：16000以上，间接ELISA法检测40例Cpn IgG参考血清，阴性和阳性结果的符合率均为100．0%（20／20）；与微量免疫荧光法（MIF）对照，检测300例临床血清标本中的IgG抗体，符合率为98．3％；检测Ct阳性血清未见交叉反应。结论表达的Cpn CPAF免疫优势区重组蛋白具有良好的免疫活性，在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

肺炎嗜衣原体三种不同抗原的临床诊断价值评价

目的 研究肺炎嗜衣原体3种重组抗原Cpn0146、Cpn0147及Cpn0308应用于肺炎嗜衣原体感染血清学诊断中的价值.方法 构建pGEX6p-2/Cpn0146、Cpn0147、Cpn0308重组质粒,并诱导表达重组蛋白,采用间接ELISA法和免疫印迹法(Western-blot)分析其免疫原性及其免疫反应性.建立分别以3种重组蛋白为包被抗原的间接ELISA法,与肺炎嗜衣原体IgG商品诊断试剂盒平行检测183份呼吸道感染患者的血清标本及32份沙眼衣原阳性患者血清标本,比较各方法检出准确性及阳性率.结果 GST-Cpn0146、Cpn0147、Cpn0308免疫兔血清中特异性IgG抗体效价滴度分别达1:6 400、1:12 800和1:12 800以上;以3种重组蛋白为包被抗原的ELISA法准确性分别为92.3%、94.5%、96.7%.各方法检测出阳性率结果显示,Cpn0146组的阳性率为38.8%(71/183)、与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异有统计学意义(x~2=12.07,P<0.05);Cpn0147阳性率40.9%(75/183),与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异有统计学意义(x~2=8.10,P<0.05);Cpn0308阳性率44.8%(75/183),与肺炎嗜衣原体IgG试剂盒的阳性率比较差异无统计学意义(x~2=0.57,P>0.05).结论 Cpn0308在肺炎嗜衣原体感染血清学诊断实验中表现出良好的准确性(96.2%)和较高的阳性率(44.8%),可望用于进一步研制肺炎嗜衣原体诊断试剂盒.     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

Development of an indirect ELISA with artificially synthesized N protein of PPR virus

The full-length gene encoding the nucleocapsid (N) protein of the virus (PPRV) responsible for an outbreak of peste des petits ruminants in Tibet in 2007 was synthesized in two stages using overlapping PCR without the need for viral genomic cDNA as template. The full-length N gene was successfully expressed in Escherichia coli, and the purified gene product bound to monoclonal antibody raised against PPRV N protein. Furthermore, it was able to replace recombinant B-N antigen as the coating antigen in a commercial ELISA kit prepared with another PPRV strain. Recombinant protein was employed as the coating antigen to develop an indirect ELISA for PPRV antibody detection in the sera of infected small ruminants. Antibody detection was optimal at a 1:200 serum dilution and an antigen concentration of 3.2 μg/ml, and the positive threshold (cutoff) value of the assay was 2.18. Analysis of 697 serum samples revealed the sensitivity and specificity of the indirect ELISA to be 96.7 and 96.1%, respectively, compared with a commercially available ELISA test.     

HPV 16型L2全长原核融合蛋白的交叉反应特性研究

目的 研究HPV 16型L2全长蛋白在HPV6、11、16和18型别间的交叉反应特性.方法 收集108例尖锐湿疣患者、156例宫颈癌患者和100名健康对照者的血清标本,采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2全长基因,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和WB鉴定;进一步通过WB检测HPV16 L2全长融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性的患者血清的特异性结合能力.以镍螯合亲和层析柱(Nj-NTA Agarose)纯化HPV16 L2融合蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA法检测3组标本中的HPV血清特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,含有HPV16 L2的融合蛋白在原核表达体系中呈较高效表达,表达量为27.2%;SDS-PAGE和WB检测结果显示在约相对分子质量82 000处可见特异性阳性信号条带;以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示,HPV16 L2全长融合蛋白在相对分子质量82 000处均出现特异性阳性信号条带.ELISA结果显示,尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体A值分别为0.825±0.409、0.808±0.376、0.128±0.15,阳性率分别为92.6%、92.3%和6.0%.3组间血清抗体A值及阳性率差异均具有统计学意义(H=207.292,x2=251.846,P均＜0.01),而尖锐湿疣组与宫颈癌组之间的血清抗体均值(0.825和0.808)差异无统计学意义(H=0,P＞0.05).结论 HPV16 L2全长原核融合蛋白具有较强的抗原性,与HPV6、11、16和18型别间具有交叉反应,可进一步用于HPV感染及其相关肿瘤ELISA血清学检测试剂的通用型靶抗原研究.     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。