六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究

目的：阐明六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用。方法：将六味地黄丸主要血中移行成分以适当浓度添加到大鼠成骨细胞培养液中，用MTT法测定细胞的增殖速度。结果：六味地黄丸主要血中移行成分莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷的混合物各剂量组均明显表现出对大鼠成骨细胞的促增殖作用。结论：初步确定六味地黄丸主要血中移行成分莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷是其治疗骨质疏松的药效物质基础。     

六味地黄丸血中移行成分的分离及结构鉴定

目的：在前期六味地黄丸血清药物化学初步研究的基础上分离并鉴定六味地黄丸血中移行成分。方法：以血清色谱指纹图为指导,采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱及RP-C18柱制备色谱进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定。结果：对11种六味地黄丸血中移行成分进行分离和结构鉴定,共分离得到了8个化合物,分别鉴定为5-羟甲基-2-糠酸（A）、莫诺苷（B）、獐牙菜苷（C）、马钱子苷（D）、2-羟基-苯乙酮-4-葡萄糖醛酸苷（E）、4-甲氧基-5-磺酸基苯乙酮-2-葡萄糖醛酸苷（F）、2,4-二羟基-苯乙酮（G）、（H）2,5-二羟基-4-甲氧基苯乙酮。其中5-羟甲基-2-糠酸（A）为熟地、山茱萸和泽泻中的成分代谢形成;莫诺苷（B）、獐牙菜苷（C）、马钱子苷（D）为山茱萸所含成分直接入血而形成;2-羟基-苯乙酮-4-葡萄糖醛酸苷（E）、4-甲氧基-5-磺酸基苯乙酮-2-葡萄糖醛酸苷（F）、2,4-二羟基-苯乙酮（G）、（H）2,5-二羟基-4-甲氧基苯乙酮为丹皮酚的代谢产物。结论：将血清药物化学方法引入到化合物的分离制备领域中,成功地分离鉴定了六味地黄丸的体内直接作用物质。     

六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤B16细胞的增效作用

目的 探讨六味地黄丸主要入血成分对自杀基因系统(HSV-tk/GCV)杀伤黑色素瘤B16细胞的增效作用及作用机制。方法 采用MTT法检测六味地黄丸主要入血成分丹皮酚、马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸和獐牙菜苷5种化合物及其混合组分对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的影响;入血成分混合组分处理脾淋巴细胞后培养上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的影响;荧光显微镜观察及流式细胞术结合荧光示踪法分析含药淋巴细胞上清对细胞间缝隙连接通讯(GJIC)功能的影响及Western blot分析缝隙连接蛋白(Cx43)表达;MTT法检测含药淋巴细胞上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞的增敏作用。结果 HSV-tk/GCV联合丹皮酚、马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸和獐牙菜苷5种化合物及5种化合物的混合组分,均未显示其对自杀基因的杀伤有直接增效作用;而混合组分处理脾淋巴细胞后培养上清对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞具有协同增效作用,并呈一定的量效关系。含药淋巴上清可明显促进Cx43表达,改善B16细胞间缝隙通讯功能。含药淋巴上清对HSV-tk/GCV的B16细胞杀伤敏感性则无明显影响。结论 六味地黄丸主要入血成分可能刺激脾淋巴细胞产生某些活性物质,并对HSV-tk/GCV杀伤B16细胞起增效作用,这些淋巴细胞产生的免疫活性物质可能才是六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础;其增效机制可能与改善B16细胞间GJIC相关。     

六味地黄丸入血成分对自杀基因杀伤肝癌细胞的增效作用

目的:探讨六味地黄丸主要入血成分对单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)自杀基因系统杀伤大鼠肝癌细胞(CBRH7919)的增效作用.方法:按CBRH7919/tk占总细胞数10％的比例混合CBRH7919与CBRH7919/tk细胞,分别接种96孔板,每孔加细胞悬液100 μL(2×103个/孔),设置对照组、低、中、高3种浓度的六味地黄丸入血成分组、GCV组、各浓度六味地黄丸入血成分联合GCV组;培养24h后分别加入入血成分马钱素和丹皮酚(质量浓度均为25,50,100 μmol·L-1),莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸、獐牙菜苷(浓度均为37.5,75,150 μmol·L-1)5种化合物和5种化合物混合组分(质量浓度为0.0067,0.0135,0.027 g·L-1);及其混合组分(质量浓度为0.034 g·L-1)作用后淋巴细胞培养上清(占培养液体积分数7.5％,15％,30％),设6个复孔,37℃,5％ CO2培养箱培养72 h后MTT法测定细胞存活率,检测六味地黄丸主要入血成分及淋巴细胞培养上清对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的影响.结果:自杀基因系统联合马钱素、莫诺苷、5-羟甲基-2-糠酸、獐牙菜苷和丹皮酚5种化合物及5种化合物的混合组分,均未显示其对肿瘤自杀基因疗法的直接增效作用;但含药上清联合GCV组对肝癌细胞生长抑制率分别为(22.72±3.12)％,(26.68±1.92)％,(30.50±3.53)％;与单独自杀基因(10％ tk/GCV)组抑制率(15.37±3.96)％比较,差异均有统计学显著性意义;q值分别为1.50,1.75,2.24,均大于1.15,具有协同增效作用,并呈一定的量效关系.结论:六味地黄丸主要入血成分能刺激淋巴细胞产生某些活性物质,并发挥了对HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统对肝癌CBRH7919细胞杀伤的增效作用,这些淋巴细胞产生的内源性活性物质可能才是六味地黄丸对肿瘤自杀基因疗法增效作用的药效物质基础.     

基于中医方证代谢组学技术的六味地黄丸干预脑瘫大鼠模型研究

目的：本研究基于中医方证代谢组学理论和技术平台,研究六味地黄丸（LW）对脑瘫大鼠模型的干预作用。方法：研究采用延迟剖宫产手术方法复制缺氧缺血脑瘫（HICP）大鼠模型,利用经典行为学方法对HICP模型和LW的干预作用进行评价;最后借助中医方证代谢组学技术揭示了HICP模型大鼠尿液的潜在生物标记物与LW干预HICP模型体内显效成分的相关性。结果：研究表明LW通过调节HICP模型大鼠机体的糖类代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和甾体激素类生物合成四大类代谢途径,进而有效改善HICP模型大鼠的运动能力,并确定LW的入血成分中6-O-甲基梓醇、莫诺苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脱水的代谢产物为干预HICP大鼠模型的潜在药效物质基础。本证实了中医方证代谢组学技术可以成为阐明中药药效物质基础的有力手段。     

六味地黄丸浓缩丸多指标成分体外溶出度研究

目的:建立六味地黄丸浓缩丸多指标成分的溶出度测定方法,为该制剂的质量控制提供参考。方法:按照《中国药典》2015版四部溶出测定法中的浆法,以脱气处理的pH=1.2盐酸-氯化钠溶液为溶出介质,温度保持在(37±0.5)℃,转速100r·min~(-1)。采用HPLC测定莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量,流动相乙腈(A)-0.3%磷酸(B),体积流量1mL/min,检测波长为240nm(莫诺苷)、240nm(马钱苷)、274nm(丹皮酚)。结果:莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的累积溶出度在2h内都达到了65%以上。结论:该溶出度测定方法简便准确、重复性好,适用于六味地黄丸的质量控制。     

六味地黄丸血中移行成分的含量测定

目的对六味地黄丸的2种原型血中移行成分进行含量测定.方法采用RP-HPLC法建立了六味地黄丸体外指纹图谱及大鼠血清色谱指纹图谱,在此基础上通过标准品对照法确认六味地黄丸的原型血中移行成分并对其进行含量测定.结果确认丹皮酚和马钱素为六味地黄丸原型血中移行成分,测定丹皮酚含量为0.93±0.01 mg/g,马钱素含量为0.37±0.01 mg/g.结论该方法以六味地黄丸入血成分的含量为指标,为更好地控制其内在质量提供了科学依据.     

六味地黄丸对照提取液的实验研究

目的 以六味地黄丸为研究对象,探索采用中成药对照提取液对中成药进行定量测定的质量控制新方法.方法 制备六味地黄丸对照提取液,确定HPLC色谱条件,对六味地黄丸提取物中5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的量进行标定;并对该提取物进行3个月常温稳定性试验.结果 该色谱条件对5种成分的分离良好;稳定性试验结果显示5种成分峰面积的RSD均小于1.5％.结论 采用中成药对照提取液对六味地黄丸进行质量控制方法可行;该方法可大大降低质量控制成本,更全面控制中成药的质量,为研究建立新的中成药质量控制方法提供实验依据.     

HPLC法同时测定六味地黄丸中4种活性成分的含量

目的:建立HPLC法同时测定六味地黄丸中莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚的含量。方法:采用Phenomenex Luna C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以乙腈-0.3%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱;流速1 m L/min,柱温35℃;检测波长240 nm(莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷)和274 nm(丹皮酚)。结果:4种测定成分分离度良好,莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷和丹皮酚进样量分别在0.390~3.904μg(r=0.999 5)、0.297~2.970μg(r=0.999 5)、0.136~1.360μg(r=0.999 6)和0.531~5.306μg(r=0.999 8)范围内呈良好的线性关系;加样回收率分别为97.42%、97.08%、95.40%和100.59%,相应的RSD分别为1.87%、1.14%、2.18%和1.25%。结论:本方法简单易行,准确可靠,可作为六味地黄丸的定量方法。     

祛风及开窍类引经药对六味地黄丸有效成分眼内分布的影响

目的观察祛风及开窍类引经药柴胡、防风及冰片对六味地黄丸有效成分在眼不同组织分布和代谢的影响,探讨引经药是否可以增加药物有效成分在眼部的靶向性聚集。方法将252只家兔随机分为6组,每组42只,对照组正常饲养不作处理,其它组分别用蒸馏水、六味地黄丸、六味地黄丸+防风、六味地黄丸+柴胡、六味地黄丸+冰片溶液灌胃,在灌胃后0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、4.00、8.00 h各时间点每组随机取6只家兔,采用液质联用技术检测房水、玻璃体、视网膜中莫诺苷和马钱苷的含量,比较各组含量差异。结果房水中检测发现莫诺苷、马钱苷的浓度曲线变化趋势较一致,均在灌胃后0.25~1 h达到峰值,在8 h后基本清除完全,其中六味地黄丸+冰片组的马钱苷、莫诺苷的浓度在0.25~0.75 h均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高,差异有统计学意义(P0.05)。各组有效成分在玻璃体中的浓度均很低,马钱苷的曲线呈波动趋势,各个时间点各组两两比较差异均无统计学意义(P0.05),莫诺苷的曲线在0.25~1 h达到峰值,随后在8 h基本清除完全,其中六味地黄丸+冰片组的莫诺苷浓度在0.25~0.75 h均较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高,差异有统计学意义(P0.05);其它各组两两比较,差异均无统计学意义(P0.05)。各组视网膜内莫诺苷和马钱苷的浓度也偏低,其中六味地黄丸+冰片组马钱苷和莫诺苷的浓度在0.25 h较六味地黄丸组、六味地黄丸+防风组、六味地黄丸+柴胡组高,差异有统计学意义(P0.05);其他组两两比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论冰片可以增加六味地黄丸有效成分在房水、玻璃体和视网膜的浓度,这可能是引经药的作用机制之一。     

六味地黄苷糖中糖苷部位的化学成分研究

目的:对六味地黄苷糖中糖苷部位的化学成分进行研究,阐明其活性的物质基础.方法:用大孔树脂柱色谱制备糖苷部位,用硅胶和反相硅胶柱色谱分离各成分,用MS及NMR技术鉴定结构.结果:分离得到了11个化合物,其中包括9个环烯醚萜苷,1个蒎烷单萜苷,1个酚苷,分别鉴定为7-脱氢马钱素(1),7α-甲氧基莫诺苷(2),7β-甲氧基莫诺苷(3),7α-乙氧基莫诺苷(4),7β-乙氧基莫诺苷(5),莫诺苷(6),獐芽菜苷(7),马钱素(8),芍药苷(9),丹皮酚原苷(10),番木鳖酸(11).结论:该糖苷部位是新药六味地黄苷糖发挥免疫和内分泌调节作用的重要部分.化合物6～8是该部位的主要成分,具有较好的免疫调节作用,是该部位主要活性成分.     

六味地黄汤相关成分对蛋白酪氨酸磷酸酶1B的影响

目的 研究六味地黄汤中芍药苷、没食子酸、丹皮酚、梓醇、马钱苷、莫诺苷、桃叶珊瑚苷、23-乙酰泽泻内酯醇B、薯蓣皂苷元9种重要单体成分对蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP-1B)的影响,以筛选PTP-1B的有效抑制剂.方法PTP Assay Kit 1(R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G)中孔雀绿磷酸检测法.结果所有单体均有不同程度的抑制PTP-1B的作用,其中莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻内酯醇B、芍药苷、桃叶珊瑚苷的作用较明显,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05,P＜ 0.01).结论莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、23-乙酰泽泻内酯醇B、芍药苷、桃叶珊瑚苷等成分可明显抑制PTP-1B,这可能是六味地黄汤降糖、降脂机制之一.     

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??OBJECTIVE To improve the quality control method of Liuwei Dihuang Pills.METHODS Morroniside and loganin from processed Fructus Corni were identified by TLC. Morrniside, loganin and paeonol in Liuwei Dihuang Pills were determined by HPLC. The determination was performed on a Phenomenex Gemini 110?~ C₁₈ column (4.6 mm??250 mm, 5 ??m) maintained at 40 ?? with gradient elution of acetonitrile (A) and 0.3% phosphoric acid aqueous solution (B) at a flow rate of 1 mL??min^-1. The detective wavelength was set at 240 nm for morroniside and loganin and 274 nm for paeonol. RESULTS The TLC spots were clear. Morrniside, loganin and paeonol showed good linear relationship in the range of 0.020 78-1.039, 0.020 34-1.017, and 0.045 76-2.288 ??g, respectively. The average recoveries (n=9) were 99.97%-100.99% with RSDs less than 2.3%. CONCLUSION The method is simple, rapid, accurate and can be used to control the quality of Liuwei Dihuang Pill more effectively.     

六味地黄丸对肾虚型老年痴呆动物模型的改善作用

目的:研究六味地黄丸对肾虚型老年痴呆动物模型的改善作用.方法:48只小鼠随机分为对照组、模型组、六味地黄丸组、塞络通组;各试验组按照15 mg·kg-1连续sc氢化可的松40 d,第20天时侧脑室注射β-淀粉样蛋白(25-35)(Aβ25-35)6μg建立肾虚型老年痴呆动物模型,对照组给予等量生理盐水.从第21天开始,六味地黄丸组小鼠按8 g·kg-1 ig六味地黄浓缩丸,塞络通组小鼠按32 mg· kg -1 ig塞络通,对照组和模型组以相同体积每日ig蒸馏水.从第31天开始观察、检测各组小鼠的体重及状态、学习记忆能力、自主活动、抗疲劳能力、血清皮质酮含量、免疫学指标及脑组织病理学变化.结果:与对照组相比,模型组小鼠出现体重增长缓慢,自主活动受到抑制,水迷宫学习记忆能力受损,跑步力竭时间缩短,胸腺和脾指数降低,脾细胞刺激指数降低,血清皮质酮值降低.与模型组比较,六味地黄丸组小鼠的体重增长、自主活动、水迷宫上台潜伏期及游出率、跑步力竭时间、胸腺和脾指数、脾细胞刺激指数、血清皮质酮值等得到明显改善(P＜0.05,P＜0.01),而塞络通组小鼠各项指标改善不明显.结论:六味地黄丸对肾虚型老年痴呆症状具有显著改善作用,而塞络通不适合用于改善肾虚症状.     

中药六味地黄汤与单味颗粒剂混合液成分比较研究

目的:比较中药六味地黄汤与单味颗粒混合液有效成分的含量。方法:采用高效液相色谱法,以乙腈-磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 m L/min,检测波长238 nm。定量分析2种溶液中的已知有效活性成分马钱苷、丹皮酚、没食子酸、芍药苷的含量变化。结果:3批六味地黄传统汤剂种马钱苷、丹皮酚、没食子酸、芍药苷的含量明显高于同批的单味颗粒剂混合液中成分的含量,分别为3批单味颗粒的1.45、1.36、1.43倍。结论:中药六味地黄汤单味颗粒剂混合液低于六味地黄汤有效成分含量,存在明显差异,本研究为临床中药汤剂、单味颗粒剂合理应用提供科学依据。     

高效液相色谱法测定六味地黄丸的溶出度

目的：测定六味地黄丸中丹皮酚和马钱苷的溶出度。方法：采用溶出度第三法（小杯法）测定六味地黄丸的溶出度,以高效液相色谱法测定其浓度。结果：马钱苷24 h的平均累积溶出百分率为94.42%,丹皮酚24 h平均累积溶出百分率为68.75%。结论：该方法准确、可靠,可同时用于测定六味地黄丸中的两种成分的溶出情况。     

六味地黄苷糖片多指标成分的溶出度考察

目的:建立六味地黄苷糖片中多指标成分的溶出度测定方法,为该制剂的质量控制提供参考。方法:采用HPLC测定莫诺苷、马钱苷和芍药苷的含量,流动相水(A)-甲醇(B)-乙腈(C)梯度洗脱(0~10 min,76%A,20%B,4%C;10~30 min,76%~69%A,20%~27%B,4%C),检测波长236 nm。采用小杯法,以水为溶出介质,对六味地黄苷糖片中莫诺苷、马钱苷和芍药苷进行溶出度测定。结果:莫诺苷、马钱苷和芍药苷的线性范围分别为4.87~155.75,4.86~155.35,2.83~180.85 mg·L-1,平均加样回收率分别为99.88%(RSD 1.6%),101.10%(RSD 1.8%)和100.20%(RSD 1.4%)。各成分在90 min内的累积溶出度均75%。结论:六味地黄苷糖片批内和批间样品中莫诺苷、马钱苷和芍药苷的累积溶出率差异较小。该溶出度测定方法简便准确、重复性好,适用于六味地黄苷糖片的质量控制。