宫颈癌组织中HPV16E7序列多态性分析

目的 探讨广东地区宫颈癌组织中HPV16肿瘤相关性抗原E7基因序列的多态性。方法 采用通用引物PCR直接测序法对宫颈癌标本中的HPV分型,从含有HPV16型的标本中采用自行设计的多重引物通过巢式PCR扩增出HPV16E7,经DNA序列测定法检测其基因变异,进而寻找其热点突变。结果 50例宫颈癌组织HPV-DNA的检出率为78%,其中HPV16和HPV18型混合感染18例,单纯HPV16型感染15例。33例含有HPV16型的标本中扩增出25例HPV16E7,其中17例647位核苷酸“T”变异“C”,导致相应的蛋白质由天冬氨酸变异为丝氨酸。结论 广东地区宫颈癌组织中HPV16E7DNA序列发生碱基替换的区域主要在647位至846位,热点突变点为Nt647和Nt846。     

宫颈癌组织HPV16 URR及E7基因突变和序列多态性分析

目的 分析山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)上游调控区(URR)和E7开放读码框(OFR)基因突变和基因序列多态性.方法 收集山东省青岛地区妇女宫颈癌标本共111例,提取DNA作为模板,应用通用引物和型特异引物经聚合酶链反应(PCR)筛选HPV16阳性标本,PCR结合测序检测HPV16阳性标本URR和E7基因全序列,经DNAStar 100软件和在线BLAST分析其变异情况.结果 宫颈癌组织中HPV和HPV16感染率分别为99.10%(110/111)和73.63%(81/110);核苷酸水平上HPV16 URR形成24种变异模式,同源性在98.02%～99.26%之间,nt7518 G→A和nt7861 A缺失变异率均为100%(26/26).HPV16 E7形成12种变异模式,同源性在99.23%～100%之间;nt647 A→G突变率58.54%(24/41),氨基酸由Asn→Ser(N29S)、nt666 G→A突变率24.39%(10/41),为同义突变.结论 山东省青岛地区妇女宫颈癌组织中HPV16 URR和E7基因均存在变异;HPV16 URR突变热点为nt7518和nt7861,HPV16 E7突变热点为nt647,且二者尚存在未见报道的变异位点.     

宫颈癌组织中P16和HPV16/18 E7的表达及意义

①目的研究宫颈癌组织中抑癌基因p16 mRNA和蛋白质的表达,以及与HPV16/18 E7表达的关系.②方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测45例宫颈浸润癌组织、12例宫颈原位癌组织和20例正常宫颈组织中HPV16/18的感染情况;采用RT-PCR技术检测上述标本中HPV16/18阳性者E7 mRNA的表达水平及所有标本中p16 mRNA表达水平;采用免疫组化技术进一步检测HPV16/18 E7、P16蛋白的表达情况.③结果宫颈原位癌和浸润癌HPV16/18的感染率、HPV16/18 E7 mRNA和蛋白表达阳性率明显高于正常宫颈组织,差异有显著性(χ2=5.12～15.78,P<0.05、0.01),原位癌和浸润癌组之间比较差异无显著性(χ2=0.119、0.000,P>0.05);原位癌和浸润癌p16 mRNA的相对表达量明显高于正常宫颈,差异有显著性(F=5.412,q=4.125、5.519,P<0.05);HPV16/18 E7阳性组p16 mRNA的表达阳性率明显高于阴性组,差异有显著性(t=4.127,P<0.01);P16蛋白在宫颈原位癌和浸润癌组织中呈现过表达,在正常组织中为阴性表达或弱表达;p16 mRNA的相对表达量与HPV16/18 E7 mRNA的相对表达量呈显著正相关(r=0.813,P<0.05);P16蛋白的过表达与HPV16/18 E7蛋白表达有相关关系(χ2=8.959,P<0.01);HPV16/18 E7 mRNA和蛋白及p16 mRNA和蛋白的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移、肿瘤的大小和病人的年龄无关(P均>0.05).④结论抑癌基因p16的过表达发生在宫颈癌的早期和癌前病变阶段,可用于临床筛查和早期诊断宫颈癌.     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

HPV16E6和E7基因序列多态性与宫颈癌临床病理特征相关性

目的 探讨宫颈癌人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7转化基因序列多态性,及其与宫颈癌临床病理特征的相关性.方法 从77例宫颈癌组织中筛选出51例HPV16阳性标本,扩增E6及E7基因,PCR产物进行序列测定.应用DNAStar生物软件进行核苷酸和氨基酸序列的分析.结果 宫颈癌组织中HPV16 E6共测得6个突变位...     

喉组织中HPV11,16 E6基因DNA及HPV16 E6 mRNA的定量检测

①目的探讨人乳头瘤病毒11,16型(HPV11,16)转化基因E6 DNA及HPV16 E6 mRNA与喉疾病严重程度的关系.②方法分别用竞争性聚合酶链反应(CPCR)和半定量RT-PCR技术检测喉乳头状瘤、喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量.③结果喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量均高于喉乳头状瘤组织,差异有显著性(t=3.745,2.776,2.759, P<0.01,0.05);高、中、低分化喉鳞癌组织中HPV11,16 E6 DNA含量无显著性差异(F=0.335, 0.234, P>0.05),但低分化喉鳞癌组织中HPV16 E6 mRNA的表达水平显著高于高分化喉鳞癌(F=4.219,q=4.107, P<0.05).④结论 HPV11,16 E6 DNA和HPV16 E6 mRNA的含量有随病理程度加重而增高的趋势,从分子水平探讨转化基因E6的致癌性, 有助于阐明HPV与喉癌发生发展的关系.     

宫颈癌组织中HPV16 E7基因的结构变异及其意义

目的了解宫颈癌组织中人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7基因的结构及其原核表达蛋白的免疫原性.方法运用PCR的方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,分子克隆技术进行基因的克隆后进一步测定基因序列,ITPG诱导原核表达HPV16 E7蛋白,ECL Western blot的方法检测表达蛋白的免疫原性.结果宫颈癌组织中HPV16 E7基因的结构中存在两处点突变,分别是第43位密码子由标准株CAA变为TAA,第76位密码子由标准株CGT变为TGT.原核表达的HPV16 E7变异蛋白不能被HPV16 E7单克隆抗体识别.结论宫颈癌组织中HPV16 E7基因存在两个点突变,突变后的E7蛋白失去了免疫原性.将这种变异的HPV16 E7用于疫苗的研究开发,可能因其表达蛋白丧失恶性生物学行为而具有较高的安全性.     

宫颈癌高危人群HPV16及18感染检测方法的建立

①目的　建立宫颈癌高危人群人乳头状瘤病毒 (HPV) 1 6及 1 8感染的检测方法。②方法　对HPV1 6及 1 8E6 /E7基因序列进行序列比较分析 ,根据二者的共享序列设计通用引物 ,进行外侧扩增 ;在通用引物扩增序列之间分别设计HPV1 6和 1 8的特异性引物 ,分别进行半套式PCR扩增 ,以检测并鉴定女性宫颈分泌物中HPV1 6及 1 8的感染。对该方法的敏感度和特异度进行了测定 ,并用该法对 31例宫颈癌病人和 1 1 3例对照组妇女宫颈分泌物进行了检测。③结果　PCR扩增后HPV1 6、HPV1 8分别有 341、4 30bp和 1 0 9、4 73bp的带产生。该反应体系最低可检测浓度为 3μg/L。用该方法对人类基因组DNA、人类巨细胞病毒 (HCMV)和大肠埃希菌DNA以及其他型别的HPV进行检测 ,均未见假阳性结果产生。宫颈癌病人HPV1 6的感染率为 6 7.7% ,HPV1 8的感染率为 1 9.4 % ,明显高于对照组 (χ2 =31 .5 2、6 .2 6 ,P <0 .0 1、0 .0 5 )。④结论　HPV1 6、HPV1 8感染与宫颈癌的发生密切相关。本研究建立的方法具有特异度和敏感度高、简便、快速等特点 ,可推广应用于临床检测。     

宫颈癌组织中HPV16E6、E7蛋白水平与患者临床病理特征及预后的关系

目的 探究宫颈癌组织中16型人乳头瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E6)、16型人乳头瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein, HPV16 E7)水平与患者临床病理特征及预后的关系。方法 选取行宫颈癌根治术87例患者的肿瘤组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本进行研究,采用免疫组织化学法检测组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达情况,并结合患者临床病理特征进行分析,采用Kaplan-Meier生存曲线比较患者3年生存情况,采用COX回归分析各项因素对患者预后的影响。结果 免疫组化结果显示肿瘤组织中HPV16 E6、HPV16 E7阳性率高于癌旁组织和正常组织(P<0.05); HPV16 E6及HPV16 E7蛋白阳性表达患者3年生存率低于阴性表达患者(P<0.05);多因素分析显示HPV16 E6、HPV16 E7阳性是宫颈癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白在宫颈癌组织中...     

宫颈癌组织中HPV16 E6C基因变异的研究

为探讨ＨＰＶ１６ 肿瘤相关抗原Ｅ６ 羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）在宫颈癌组织中的变异性以及采用Ｅ６Ｃ做为肿瘤治疗性疫苗抗原基因的可行性,采用ＰＣＲ方法自１８ 例单纯ＨＰＶ１６ ＤＮＡ 阳性的宫颈癌组织中扩增ＨＰＶ１６ Ｅ６ＣＤＮＡ,经单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）和ＤＮＡ序列测定法检测其基因变异性。ＳＳＣＰ分析结果显示,１８ 例宫颈癌组织中ＨＰＶ１６ Ｅ６ＣＤＮＡ 电泳条带与标准对照ＤＮＡ 条带一致,提示无基因变异现象存在,ＤＮＡ 序列测定也证实Ｅ６Ｃ编码区内无核苷酸突变。该研究证实采用ＨＰＶ１６ Ｅ６Ｃ端基因片段作为ＨＰＶ疫苗候选基因可行,为进一步研制ＨＰＶ１６ ＤＮＡ 疫苗奠定了基础     

宫颈癌妇女人乳头瘤病毒16E6/E7基因变异分析

目的了解宫颈癌妇女人乳头瘤病毒(HPV)16E6/E7基因变异的情况,为HPV防治提供流行病学数据。方法从大量样本中筛选出HPV16阳性标本180例,其中宫颈癌患者100例,宫颈不典型增生患者50例,宫颈炎症患者30例,对宫颈脱落细胞样本采用PCR方法扩增HPV16 E6/E7基因,然后对反应产物采用DNA测序法获得基因序列,在GeneBank进行经BLAST分析,寻找变异位点。结果宫颈癌患者中E6核苷酸变异率为82.00%(82/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);宫颈癌HPV16E6最频繁的序列变异为T178G(60/100),其他常见变异为T350G、C335T/A442C、T178G/G39T,年轻宫颈癌组E6核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但两者T178G变异率存在明显差异(=0.000)。宫颈癌患者HPV16 E7核苷酸变异率为74.00%(74/100),明显高于宫颈不典型增生患者(=0.000)及宫颈炎患者(=0.000);E7最频繁序列变异为A647G 32.00%(32/100),其他常见的变异为A647G/C749T/T843C/T846C、A647G/C749T/T846C、C749T/C790T、A647G/C749T;年轻宫颈癌组E7核苷酸变异率与非年轻宫颈癌无明显差别,但A647G变异率存在明显差别(=0.03)。结论宫颈癌患者明显存在HPV16E6E7核苷酸变异,HPVE6 T178G、E7 A647G可能与宫颈癌年轻化密切相关,故对该人群的检测并及时尽早采取干预措施。     

宫颈病变患者人乳头瘤病毒16亚型E2基因多态性检测

目的分析宫颈病变中人乳头瘤病毒（HPV）16亚型E2基因的多态与宫颈病变的关系,了解E2基因变异情况及其与宫颈
病变的相关性。方法应用PCR和高分辨率熔解曲线方法针对379例HPV高危亚型阳性宫颈脱落细胞样本进行HPV16感染
情况及HPV16亚型E2基因68位点和133位点多态分布情况进行检测。结果379例HPV高危亚型阳性宫颈标本共检出78例
HPV16亚型阳性,其在宫颈癌、CINⅡ~Ⅲ、CINⅠ、炎症患者中的检出率分别为44.8%、31.5%、24.1%和9.6%;HPV16E2基因
68C和133G的频率在中重度宫颈内瘤样病变和宫颈癌中明显高于轻度上皮内瘤样病变和炎症患者（P<0.05）。结论HPV16是
导致宫颈恶性病变的重要致病因素;随着病理类型的进展,HPV16感染率也逐渐增加;同时基因位点改变说明HPV16E2基因
单核苷酸变异可能使致癌能力发生改变。
     

人乳头瘤病毒16型E2/E6癌基因与宫颈癌关系的研究

目的探讨人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2/E6癌基因在宫颈癌发生中的作用。方法采用以医院为基础的1∶1配比病例对照研究,应用热启动PCR法检测经病理诊断确诊的74例宫颈鳞癌新发病例,及同期就诊的74例宫颈良性肿瘤患者的高危型HPV16 E2/E6癌基因的状况。结果病例组HPV16 E2、E6阳性率(41.89%,52.70%)高于对照组(17.57%,21.62%),差别有统计学意义,OR分别为3.250(1.471-7.178)和3.875(1.824-8.233);病例组HPV16 E2缺失率较对照组略高。结论宫颈癌的发生与HPV感染,特别是高危型HPV16的感染密切相关;HPV16 E2基因缺失、E6基因高阳性率在宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

Telomerase expression in normal human fibroblasts by introduction of human papillomavirus type16(HPV16) E6 and E7 genes

用已构建的含有     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

人乳头瘤病毒16型E7C端亚基因片段的克隆与表达

目的旨在获得无转化活性而保留抗原性的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７Ｃ端,为进一步研制抗ＨＰＶ１６疫苗打下基础。方法应用自行设计合成的引物进行ＰＣＲ扩增ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ端亚基因片段,并克隆入真核表达载体ｐＬＮＣＸ。结果准确获得含有Ｅ７Ｃ亚基因片段的重组质粒ｐＬＮＣＥ７Ｃ,将ｐＬＮＣＥ７Ｃ转染Ｂ１６细胞。对Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交阳性克隆应用Ｅ７多抗进行免疫组织化学方法检测,检出Ｅ７Ｃ的表达。结论所构建的表达质粒适于ＤＮＡ疫苗的制备。     

人乳头瘤病毒16型、18型DNA在涎腺肿瘤组织中的表达

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型与涎腺肿瘤病因学之间的关系.方法采用特异引物PCR法为44例涎腺肿瘤组织标本中31例HPVs阳性组织DNA进行分型检测.结果检出HPV16E7阳性率为13.60%,HPV18E7阳性率为47.72%,涎腺肿瘤组织中HPV18E7阳性率明显高于HPV16E7阳性率;恶性肿瘤组中HPV16E7和HPV18E7阳性率显著高于良性肿瘤组(P＜0.05).结论HPV18型感染与涎腺肿瘤的发生密切相关;HPV16,18型E7基因在恶性肿瘤的发生中起重要作用.